Laboratorio di Genetica molecolare
e dello sviluppo
Mimmo Turano, Giuseppe Tortoriello, Alberto Angrisani, Fiorella Minopoli, Filippo
Scialò, Maria Carmela Accardo, Sara Riccardo e Maria Furia
Il nostro gruppo utilizza la Drosophila melanogaster come organismo modello per studi di Genomica Funzionale. Le principali linee di
ricerca includono oggi lo studio delle funzioni e del meccanismo di biogenesi dei piccoli RNA nonnon-coding a localizzazione nucleolare
(snoRNAs:
snoRNAs: small nucleolar RNAs)
RNAs) e delle principali componenti proteiche che si associano a queste
queste molecole per formare gli specifici
complessi ribonucleoproteici (snoRNPs di tipo H/ACA o C/D) che dirigono la modificazione degli RNA bersaglio.
bersaglio.
Nei complessi H/ACA
-snoRNP,
H/ACAsnoRNP, l’attività di pseudouridina sintetasi è svolta dai membri di una
una famiglia proteica altamente
conservata dagli Archaea ai mammiferi. Nell’ uomo, quest’attività
quest’attività enzimatica è codificata dal gene DKC1, responsabile della
della
malattia genetica discheratosi congenita (DC) X-linked.
linked.
Negli ovari, gli
snoRNA prodotti
dagli introni sono
espressi in tutti i
tipi di cellule e si
localizzano nel
nucleolo….
nucleolo….
L’organizzazione del gene si è rivelata particolarmente
interessante. Il gene produce due proteine alternative ed
ospita nei suoi introni 5 geni che codificano per snoRNA
e 2 geni che producono small non messanger RNA
(snmRNA)
snmRNA)
Il
nostro
gruppo
sta
caratterizzando
l’ortologo
l’ortologo
del gene umano DKC1 in
Drosophila.
Drosophila. Un primo passo
è stato l’isolamento di
mutanti,
che
appaiono
caratterizzati
da
una
ridotta taglia corporea,
sterilità ed anomalie a
carico delle setole e della
cuticola addominale.
addominale.
La sovraespressione di un
transgene che contiene i
piccoli
nonRNA
non-coding
localizzati al 3’ del gene
provoca
un
significativo
aumento della dimensione
corporea
….mentre gli
snmRNA sono
presenti solo nelle
cellule della linea
germinale e si
localizzano nel
nucleo in maniera
diffusa.
Mediante un approccio computazionale basato sull’utilizzo del programma SNOSCAN
abbiamo analizzato l’intero genoma di Drosophila melanogaster per identificare i geni che
codificano per snoRNA di tipo C/D.
VALIDAZIONE SPERIMENTALE
DEI PUTATIVI GENI
IDENTIFICATI
ANALISI
TRASCRIZIONALE TRAMITE NORTHERN
BLOT
PREPARAZIONE SONDE GENOMICHE
SPECIFICHE
IDENTIFICAZIONE DI POTENZIALI
GENI PER snoRNA NEL GENOMA DI D. melanogaster
RICERCA IN DATABASE E
ANALISI DI SEQUENZA
ALLINEAMENTO DELLE SEQUENZE
DELL’rRNA di Drosophila
CON QUELLE di
S.cerevisiae E H.sapiens
5
UTILIZZO DEL PROGRAMMA BLAST 2
Identificazione dei putativi siti di
metilazione (score› 20) sull’rRNA di
ULTERIORE ANALISI DELLE REGIONI
GENOMICHE FIANCHEGGIANTI
PER IDENTIFICARE EVENTUALI
ISOFORME
6
4
8
Drosophila
3
9
2
RICERCA DI PUTATIVI SnoRNA DI
CLASSE C/D CHE RICONOSCONO
I SITI DI METILAZIONE
SULL rRNA
7
SNOSCAN
PROGRAMMA PER LA RICERCA DEGLI
SnoRNA (Lowe and Eddy, 1999)
1
Nel corso della nostra analisi sono stati identificati
anche snoRNA il cui potenziale bersaglio è costituito
non dall’ rRNA,
rRNA, ma da molecole di snRNA;
snRNA; 9 snoRNA
sono invece risultati “orfani”. Estendendo la ricerca
all’intero trascrittoma,
trascrittoma, abbiamo osservato che molti
mRNA potrebbero rappresentare i potenziali bersagli
di modificazione.
Localizzazione dei 52 nuovi geni codificanti snoRNA
identificati in D.melanogaster
2: in
: regioni soggette a
splicing alternativo; 4%
3: a cavallo di una
giunzione esone-introne;
6%
UN ESEMPIO DI GENI CODIFICANTI snoRNA A LOCALIZZAZIONE INTERGENICA:
Il CLUSTER DmSnR48/DmSnR39-59
DmSnR39/59-DmSnR48
CG3741
CG8078
Chr 2R
E1
10: in esoni di geni che
codificano per proteine;
19%
13: in regioni intergeniche; 25%
E2
24: in introni di geni che
codificano per proteine; 46%
La localizzazione genomica è risultata
molto variegata, ed i nuovi geni sono
risultati localizzati non solo in introni, ma
anche negli esoni dei geni ospiti. La
localizzazione esonica,
esonica, o nelle giunzioni
introneintrone-esone,
esone, suggerisce l’esistenza di
meccanismi di biogenesi basati sulla
produzione alternativa delle molecole di
mRNA e snoRNA sovrapposte.
E3
E1
DmSnR48c
DmSnR39/59b
DmSnR39/59a
E2
L’identificazione bioinformatica è stata poi seguita
dalla conferma sperimentale, che ha validato 52 dei
100 putativi candidati.
E3
Due snoRNAs “orfani” hanno come potenziali target l’mRNA del
gene Pde6
DmSnR48b
UN ESEMPIO DI GENI CODIFICANTI snoRNA A LOCALIZZAZIONE INTRONICA:
Il CLUSTER DmSnR60
Il gene Pde6 (Phosphodiesterase 6) codifica una 3’5’ fosfodiestarasi
nucleotide-ciclica
DmSnR60
Mfl/Nop60B (CG3333)
E1
E2
E3
E4
E5
E7
E6
DmSnR60d
E8
DmSnR60c
Introne 1
E10
E9
DmSnR60a
DmSnR60b
Exon 1
Exon 2
Exon 3
Exon 12
UN ESEMPIO DI GENI CODIFICANTI snoRNA A LOCALIZZAZIONE ESONICA:
Il CLUSTER DmSnR60
Dm3403
bt (CG32019)
E29
Dm3403d
E30
Dm3403c
E31
E32
Dm3403b
E33
Dm3403a
*
*
5’-//-gacagaaaucgcg-………………………………………………………//………………………………………………-gacagaaaucgcg-//- 3’mRNA
|||||||||||||
|||||||||||||
3’-UCAGcugucuuuagcgc- 5’
3’-UCAGcugucuuuagcgc- 5’
D’ box
D’ box
snoRNA DmG1322
snoRNA Dm1008a