Accessibilità del DNA come fattore di regolazione
dell’espressione genica
Alice Pasini
C3MIG Meeting 21-04-09
Stati di impacchettamento del DNA
H2A, H2B, H3, H4
Eucromatina vs Eterocromatina
Cromatina svolta
Cromatina condensata
trascrizionalmente accessibile
trascrizionalmente repressa
Fattori che determinano lo stato di condensazione della cromatina:


Modificazioni istoniche
Metilazione del promotore
Modificazioni istoniche
Modificazioni istoniche post-trasduzionali:
• Acetilazione
• Metilazione
Acetilazione Istonica
L’acetilazione degli istoni destabilizza la struttura della cromatina, in parte perché
l’aggiunta di un gruppo acetile neutralizza la carica positiva della lisina.
Cromatina repressa
HAT = Istone
Acetiltransferasi
HDAC = Istone
Deacetilasi
Cromatina attiva
La metilazione del DNA
figura tratta (modificata) da:
Bernstein BE, Meissner A and ES Lander. Cell (2007) 128: 669–681.
La metilazione delle citosine precedenti le guanine (CpG) è l’unica
modifica covalente nota del DNA nei mammiferi, dove è associata alla
specificità dell’espressione genica tissutale, al differenziamento,
all’imprinting genomico, al silenziamento del cromosoma X,
all’invecchiamento, alla carcinogenesi…
La metilazione delle CpG è ereditabile
figura tratta da:
Alberts B, Johnson A, Lewis J et al. Biologia Molecolare della cellula (4° ed. 2004) Zanichelli; Bologna.
Gli schemi di metilazione del DNA vengono ereditati fedelmente: un enzima
metilante diretto da gruppi metilici (metiltransferasi di mantenimento)
determina la metilazione dei filamenti neosintetizzati in corrispondenza delle
sedi complementari metilate dei filamenti parentali.
La metilazione come meccanismo di
silenziamento genico
La metilazione delle CpG del
promotore di un gene favorisce il
suo legame da parte proteine che
legano il DNA metilato e quindi
interagiscono con complessi
proteici di rimodellamento della
cromatina, che rendono il gene
trascrizionalmente silente.
figura tratta da:
Alberts B, Johnson A, Lewis J et al. Biologia Molecolare della cellula (4° ed. 2004) Zanichelli; Bologna.
Regolazione epigenetica
Per Epigenetica si intende una qualunque attività di regolazione dei geni tramite
processi chimici che non comportino cambiamenti nel codice del DNA cioè del
genotipo, ma possono modificare il fenotipo dell’individuo e/o della progenie.
Modificazion
i Istoniche
Metilazione
del DNA
ESPRESSIONE
GENICA
EPIGENETICA
Fattori che
rimodellano
la cromatina
Organizzazione della
cromatina a livello di un
promotore non-metilato di un
gene trascrizionalmente attivo
(in alto, condizioni normali) e
silenziamento della trascrizione
dello stesso gene – mediato
dall’ipermetilazione del
promotore (in basso,
neoplasia).
CpG non-metilata
figura tratta da:
Herman JG and SB Baylin. N Engl J Med (2003) 349: 2042–2054.
CpG metilata
Istone H3 acetilato, e metilato in lys 4
Istone H3 deacetilato, e metilato in lys 9
MGMT: O6-metilguanina DNA metiltransferasi
 Gene coinvolto nella riparazione del DNA.
 Codifica per la proteina AGT (alchilguanina-alchiltransferasi), responsabile
di eliminare il legame di gruppi alchilici addizionali in posizione O6 della
guanina nel DNA.
 Gene oncosoppressore in quanto protegge da eventi di mutagenesi,
cancerogenesi, e dagli effetti citotossici degli agenti alchilanti.
 Ipermetilato nel glioblastoma
Il Glioblastoma

I tumori maligni cerebrali rappresentano circa il 2% di tutti i tumori.

I gliomi rappresentano circa l'86% dei tumori cerebrali e vengono
clinicamente classificati in diversi gradi, la forma più aggressiva ed
invasiva è il Glioblastoma multiforme (GBM), la cui aspettativa di vita è
di 9/12 mesi.

Circa il 35% dei GBM ha MGMT silenziato dall’ipermetilazione delle
isole CpG nel suo promotore.
Glioblastoma e Poliammine
E’ stato evidenziato che il Glioblastoma presenta elevati livelli di poliammine.
Ruolo delle Poliammine
Le poliammine sono composti organici aventi due o più gruppi amminici (-NH2);
stimolano la proliferazione cellulare e svolgono un ruolo nella regolazione della
sintesi del DNA e dell’espressione genica.
Essendo policationi
hanno elevata affinità
per il DNA, che è un
polianione.
ODC nella sintesi delle poliammine
La biosintesi e la degradazione delle poliammine e dei loro amminoacidi
precursori sono strettamente regolati.
Il primo enzima della via di
sintesi delle poliammine è
ODC (Ornitina
decarbossilasi) il quale
catalizza la formazione della
putrescina a partire
dall’ornitina.
Interazione delle Poliammine con l’impacchettamento
DNA-istoni
Le Poliammine partecipano alla regolazione epigenetica?
Obiettivo
Valutare in condizioni basali e a seguito di trattamento con farmaci che
interferiscono con l’assetto epigenetico e con la via di sintesi delle
poliammine:

lo stato di metilazione e di espressione del gene MGMT in linee
cellulari di GBM;

l’acetilazione degli istoni H3 e H4;
Metodi
Modello sperimentale:

Linee cellulari di glioblastoma umano (T98G, U87MG) con diverso
livello di espressione di AGT.
Metodi:



Rilevazione della metilazione del promotore (MSP, Methylation Specific
PCR)
Quantificazione relativa di tradotto (WB)
Rilevazione dei marker istonici associati al promotore (ChIP, Immunoprecipitazione della cromatina)
Rivelazione dello stato di metilazione del promotore
Bisulfatazione
MSP, Methylation Specific PCR
Particolare tipo di PCR (Polymerase Chain Reaction) che utilizza in due
distinte reazione di amplificazione due specifici set di primer in grado di
ibridizzarsi con DNA non metilato o metilato rispettivamente
PCR Un-Methylated Specific
UnMet-F
93 pb
UnMet-R
5'
3'
Met-F
MGMT
sequence
81 pb
PCR Methylated Specific
Met-R
Studio della metilazione del promotore di MGMT in
condizioni basali
U87MG
UM
M
T98G
UM
M
NL
UM
M
C+
M
Mw
H2O
UM
M
NL = Normal
Lymphocytes
C+ = In vitro
methylated DNA
93bp
UM = Unmethylated
reaction
M = Methylated
reaction
81bp
Studio in WB dell’espressione di AGT in condizioni basali
con diversi tamponi di lisi
Mw
22 kDa
AGT
43 kDa
β-Actina
T98
____________________
SDS
Chet
HCl
U87
____________________
SDS
Chet
HCl
Trattamento farmacologico con DFMO della linea T98
 DFMO, inibitore del I° enzima della via di sintesi delle poliammine
 Concentrazioni utilizzate 0.5-1-2mM per 16-24 ore
Standardization DFMO 0.5-1-2mM 16-24h
3
% Control
2,5
2
acH4
1,5
acH3
1
MGMT
0,5
0
T98 cntr
0.5mM
16h
1mM 16h 2mM 16h
0.5mM
24h
1mM 24h 2mM 24h
Il trattamento con DFMO causa un aumento dell’acetlilazione istonica
accompagnato da un aumento dell’espressione di MGMT
Trattamento farmacologico con TSA della linea T98
 TSA, inibitore delle istone deacetilasi (HDACs).
 Concentrazioni utilizzate 0.2-0.4μM per 2-4-8-16-24 ore
Standardization TSA T98
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
T98 acH4%
T98 acH3%
T98 MGMT%
cntr
2h
4h
8h
0.2μM
16h
24h
cntr
2h
4h
8h
16h
24h
0.4μM
Il trattamento con TSA causa un aumento dell’acetlilazione istonica con picco
alle 4-8 ore non accompagnato da un aumento dell’espressione di MGMT,
quindi non basta solo inibibire le HDACs per favorire l’espressione.
Conclusioni

È evidente l’importanza del ruolo svolto dallo stato d’impacchettamento
della cromatina nella regolazione dell’espressione genica.

L’inibizione della via di sintesi delle poliammine è un elemento in grado di
intervenire sullo stato di acetilazione degli istoni e di produrre quindi un
concomitante aumento dell’espressione di un gene regolato
epigeneticamente.

La comprensione del codice “epigenetico” ha un grande potenziale in
termini farmacologici.
Prospettive future
ChIP

Indagine dei marker istonici
associati al promotore di MGMT
(ChIP) in condizioni basali e a
seguito di trattamenti farmacologici
con DFMO.

Prove di sinergie tra DFMO e
farmaci demetilanti.

Prove di citotossicità dei farmaci
utilizzati.
MGMT
Figura tratta da:
Esteller M and Herman JG. Oncogene (2004) 23: 1-8.
Amplificazione del DNA:
Reazione a catena della polimerasi, PCR
Elettroforesi su gel
Migrazione di particelle cariche in soluzione attraverso una matrice sotto
l’influenza di un campo elettrico
1
Gel visualizzato
ai raggi UV
2
3
SDS-PAGE & western blotting