Ottobre-Dicembre 2013 • Vol. 43 • N. 172 • Pp. 208-214
immunologia pediatrica
Screening neonatale delle immunodeficienze
congenite: stato attuale e prospettive
Chiara Azzari 1,2, Roberta Cupone 1,2, Elisa Giocaliere 3,4, Clementina Canessa 1,2, Francesca
Lippi1,2, Giancarlo la Marca 3,4
Divisione di Immunologia e Allergia, Ospedale pediatrico universitario Anna Meyer, Firenze
Dipartimento di Scienze della Salute, Università di Firenze
3
Laboratorio di Screening neonatale, Biochimica e Farmacologia, Unità e laboratorio di Neurologia pediatrica,
Dipartimento di Neuroscienze, Ospedale pediatrico universitario Anna Meyer, Firenze
4
Dipartimento di Neuroscienze, Psicologia, Farmacologia e Salute del Bambino, Università di Firenze
1
2
Riassunto
Gli screening neonatali sono procedure diagnostiche che hanno come scopo quello di evidenziare patologie in fase presintomatica, con notevoli vantaggi
sia per il paziente (in termini di salute), che per la società (in termini di risparmi di risorse).
In molti paesi viene effettuato screening neonatale per numerosi errori congeniti del metabolismo (ECM); in alcuni di essi, con l’impiego della spettrometria
di massa (MS), si può ottenere la diagnosi di oltre 40 ECM fra difetti della beta-ossidazione degli acidi grassi, amminoacidopatie, acidurie organiche e difetti
del ciclo dell’urea.
Nel 2010 il Secretary’s Advisory Committee for Heritable Disorders in Newborns and Children (ACHDNC) ha raccomandato l’estensione dello screening
neonatale anche alle immunodeficienze severe combinate (SCID). È noto, infatti, che il bambino con immunodeficienza congenita nasce sano, ma va rapidamente incontro a gravi infezioni che possono portare a danni permanenti o addirittura alla morte. Una diagnosi precoce ottenuta mediante screening
neonatale consente di ottenere il massimo risultato terapeutico.
Summary
Neonatal screenings are diagnostic procedures made to identify pre-symptomatic diseases. Such procedures lead to benefits in terms of both health for
the patient and resources for society. Several countries have adopted neonatal screenings for many congenital metabolic diseases (CMD), often using
tandem mass spectrometry (MS). This allows the diagnosis of over 40 different CMD such as defects of fatty acid beta-oxidation, amino acids and urea
cicle disorders. In 2010 the Secretary’s Advisory Committee for Heritable Disorders in Newborns and Children (ACHDNC) recommended to extend the use
of neonatal screenings to detect Severe Combined Immunodeficiencies (SCID). It’s a known fact that immunodeficient babies are born healthy and later
suffer severe infections which can lead to permanent damages or even death. Early diagnosis through newborn screening would allow to perform the most
effective treatment.
Parole chiave: immunodeficienze severe combinate, screening neonatale, TRECs; KRECs; Spettrometria di massa
Key words: severe combined immunodeficiency, neonatal screening, TRECs; KRECs, tandem mass spettrometry
Metodologia della ricerca bibliografica
Perché lo screening?
La ricerca degli articoli rilevanti lo Screening Neonatale delle Immunodeficienze Severe Combinate è stata effettuata sulla banca
bibliografica Medline, utilizzando come motore di ricerca Pubmed
e come parole chiave: “Neonatal Screening, SCID, Tandem mass,
TREC, KREC, RT-PCR”.
Non tutte le patologie possono essere sottoposte a screening neonatale. Perché ciò possa avvenire e sia vantaggioso per la comunità e
per il paziente è infatti necessario che la patologia suddetta abbia un
elevato tasso di morbilità e mortalità e un’incidenza notevole nella
popolazione, che venga individuato un marcatore altamente specifico per la patologia stessa e che sia disponibile una terapia in grado di modificarne il decorso clinico dopo aver effettuato la diagnosi
precoce. Le SCID, pur essendo comunemente considerate patologie
rare, in realtà rispondono a questi requisiti. Diversi studi in letteratura hanno, infatti, dimostrato come il trattamento precoce delle SCID
possa favorevolmente modificarne l’andamento altrimenti fatale: un
trapianto di midollo osseo o di cellule staminali, effettuati nel corso
dei primi 3,5 mesi di vita del paziente con SCID, ossia prima che
possa sviluppare infezioni gravi, garantisce un tasso di sopravvivenza intorno al 95%. Di contro, per quei pazienti sottoposti a trapianto
più tardivamente, il tasso di sopravvivenza scende al 60-70% (Buckley, 2004; Gaspar et al., 2004; Puck, 2007). In merito all’incidenza
Le immunodeficienze severe combinate (SCID)
Le SCID sono condizioni cliniche ereditarie che si manifestano con
un grave deficit del sistema immunitario, ad esordio nella maggior
parte dei casi precoce nei primi mesi dopo la nascita e decorso invariabilmente fatale, se non trattate, solitamente entro i primi due anni
di vita. I neonati affetti da SCID sono perfettamente sani alla nascita,
ma precocemente si ammalano di gravi infezioni a causa del difetto numerico o funzionale dei linfociti T e/o B. È prioritario, dunque,
riconoscere le SCID prima che esse si manifestino con gravi o fatali
episodi infettivi, in modo da poter intervenire tempestivamente.
208
Screening neonatale delle immunodeficienze congenite: stato attuale e prospettive
nella popolazione, va precisato che le SCID sono patologie la cui
reale frequenza è probabilmente sottostimata a seguito della mancanza di un metodo diagnostico valido che ne permettesse, negli
anni passati, l’identificazione. Non è inverosimile che un numero
imprecisato di piccoli pazienti deceduti precocemente a seguito di
infezioni gravi fosse affetto da SCID non diagnosticata. Un calcolo
approssimativo dell’incidenza cumulativa di SCID nella popolazione si aggira intorno ad 1 caso su 66.000 nuovi nati (Backer et al.,
2009). Si rende necessaria, pertanto, una metodica di screening dal
basso costo e che possa indagare la presenza di diverse patologie
causa di immunodeficienza severa utilizzando un unico test.
I primi tentativi di screening
Uno dei primi metodi proposti nel tentativo di identificare precocemente un’immunodeficienza in tutti i nuovi nati era rappresentato
dall’esecuzione di un emocromo. Sebbene si tratti di un esame dal
costo contenuto e che non richiede una specifica formazione del
personale, esso non si è dimostrato sufficientemente sensibile e
specifico nell’identificazione delle SCID. In molte SCID non è presente alla nascita la linfopenia che sarebbe individuabile con l’emocromo e, di contro, la presenza di una linfopenia non è necessariamente
sinonimo di SCID. Uno studio effettuato da Lipstein et al. ha tentato
di individuare il cut-off del valore di globuli bianchi (GB) che potesse
garantire una sufficiente sensibilità e specificità del test: considerando un cut-off di 2800 GB/mm3, l’emocromo avrebbe una sensibilità dell’86% e una specificità del 94% nell’individuare una SCID; alzando il cut-off a 5000 GB/mm3 la sensibilità salirebbe al 100%, con
una specificità di appena il 56% e, dunque, un alto numero di falsi
positivi (Lipstein et al., 2010). Inoltre, effettuare un prelievo venoso
in tutti i nuovi nati rappresenterebbe una procedura non routinaria.
Un ulteriore tentativo di screening delle SCID, anch’esso di difficile
attuazione, è dato dal dosaggio di IL-7 su spot neonatale (DBS), dal
momento che tale citochina è normalmente elevata nei pazienti con
basso numero di linfociti T. La metodica necessita però di ulteriore
conferma con altri test più specifici e, pertanto, raggiungerebbe costi troppo elevati.
T cell receptor excision circles (TREC)
Negli USA è stato messo a punto e validato un metodo basato su una
tecnica di amplificazione genica capace di effettuare un dosaggio
quantitativo dei T-cell receptor excision circles (TREC), piccoli frammenti di DNA normalmente prodotti da cellule T nel timo durante la
differenziazione del T cell receptor (Chan et al., 2005; Hazenberg et
al., 2001). Durante questa maturazione, tutto il DNA relativo ai loci
V, D e J non utilizzato, viene fisiologicamente espulso. Questo fenomeno, che viene definito ricombinazione, dà luogo alla formazione,
nelle cellule T, di un prodotto finito, che è il TCR (con i suoi segmenti
VDJ), e ad una grande quantità di DNA “avanzato” che resta nella
cellula. I frammenti di DNA che vengono generati durante la maturazione dei linfociti T e la formazione del recettore specifico TCR,
si aggregano a costituire strutture circolari definite TREC (Fig. 1). I
TREC non si moltiplicano durante la divisione cellulare cosicché un
dosaggio quantitativo di questi elementi dà un’idea quantitativa sul
numero delle cellule T che sono andate incontro a maturazione; è
utile quindi per individuare la presenza di recenti emigranti timici,
cioè di cellule appena “uscite” dal timo. Un quantitativo normale di
TREC è presente solo quando il processo di ricombinazione avviene
normalmente, mentre quando la ricombinazione non avviene cor-
Figura 1.
Rappresentazione schematica della produzione dei TREC durante la ricombinazione VDJ.
Il recettore VDJ del linfocita T si forma mediante l’unione di un tratto V, un
tratto D e un tratto J. Il DNA umano contiene numerosi tratti V (V1,V2,V3..),
numerosi D e numerosi J. Tra tutti quelli contenuti nel genoma umano,
soltanto un V, un D e un J vengono casualmente selezionati a formare il
recettore. Il DNA eccedente (quello che conteneva i tratti genomici codificanti per tutti gli altri V, D e J non selezionati) viene espulso e va a formare
dei piccoli frammenti di DNA circolare, detti appunto T cell receptor excision circles (il cui acronimo è TREC).
rettamente o quando esiste un grave difetto numerico dei linfociti T la quantità di TREC risulterà molto ridotta. Nonostante le SCID
siano causate da mutazioni in molti geni diversi, la maggior parte
dei pazienti con SCID ha un ridotto numero di cellule T funzionali e
quindi un basso numero di TREC (Notarangelo, 2010). Per tale motivo, l’analisi quantitativa dei TREC è stata proposta come metodo di
screening neonatale delle SCID. Il primo stato americano ad avviare un progetto pilota di screening neonatale delle SCID mediante il
dosaggio dei TREC è stato il Wisconsin. Il progetto, attuato grazie al
sostegno della Jeffrey Modell Foundation, del Children’s Hospital del
Wisconsin e del Wisconsin Laboratory of Hygiene, ha permesso di
analizzare la presenza dei TREC direttamente sullo spot neonatale
(DBS) di 207,696 nuovi nati da gennaio 2008 a dicembre 2010. I
TREC vengono dosati su DBS (Fig. 2) mediante una tecnica di biologia molecolare, Real-time PCR (Verbsky et al., 2012).
La Real-time PCR supera molti dei limiti esposti da altri test di biologia molecolare: è una metodica di rapida esecuzione in quanto
consente di analizzare l’avvenuta amplificazione del DNA specifico
ricercato nel corso della stessa reazione, senza attenderne il termine; ha un’elevata sensibilità rilevando anche meno di 5 copie
di sequenza per campione ed elevatissima specificità; inoltre può
utilizzare contemporaneamente diversi fluorocromi per marcare le
sonde nel corso di una stessa reazione, permettendo così di identificare contemporaneamente più geni. Nell’analisi dei TREC, il DNA
necessario per la RT-PCR può essere ottenuto con estrazione da
DBS; questo approccio è molto pratico e abbatte notevolmente i costi. Infatti si possono utilizzare, per l’analisi quantitativa dei TRECs gli
stessi spot neonatali comunemente effettuati su tutti i nuovi nati per
209
C. Azzari et al.
Figura 2.
Estrazione, amplificazione e analisi dei TRECs da spot neonatali mediante RT-PCR.
La procedura di quantificazione dei TREC mediante Realtime PCR è estremamente semplice e rapida. Si parte da uno spot del diametro di 3,2 mm,
corrispondente a circa 3,4 µL di sangue, si estrae il DNA e si amplifica con sonde e primers specifici.
lo screening di patologie quali la fenilchetonuria (PKU), l’ipotiroidismo congenito e la fibrosi cistica. Il metodo di raccolta del campione
è dunque lo stesso già utilizzato per tutti i neonati e le procedure
di spedizione ai centri di riferimento sono ben collaudate. Questo
riduce il rischio di mancata raccolta o perdita di campioni da parte
dei reparti di neonatologia.
Accanto alla diagnosi di SCID, la riduzione dei TRECs può essere
talvolta evidenziata anche in pazienti con forme intermedie di SCID
(“leaky” SCID), nei pazienti con engrafment T materno (Morinishi et
al., 2009) e nei pazienti con sindromi talvolta associate a immunodeficienza, quali la Sindrome di Di George.
Il metodo presenta, tuttavia, alcune mancanze: innanzitutto non può
evidenziare i difetti isolati dei linfociti B, come la agammaglobulinemia congenita (XLA o malattia di Bruton) che possono manifestarsi
già nel primo anno di vita con una sintomatologia di gravità e conseguenze paragonabili a quelle delle SCID con difetto di T, inoltre è
un metodo dal costo non trascurabile (circa 6-8$ /test) e presenta
una specificità e sensibilità buone ma non del tutto soddisfacenti.
Per quanto riguarda la specificità, è stato dimostrato che la ricerca
dei TREC con RT-PCR può dare falsi positivi in bambini prematuri, in
neonati i corso di sepsi o anche in pazienti con linfopenie transitorie
non associate ad immunodeficienza (Mallott et al., 2013). In merito,
poi, alla sensibilità, il metodo non è risultato in grado di diagnosticare alla nascita tutti i casi di SCID, e può considerare falsamente
negativi alcuni casi di SCID sindromiche, come l’immunodeficienza
associata alla malattia veno-occlusiva, alcuni difetti di adenosina
deaminasi (ADA-SCID) (La Marca et al., 2013) o di purina-nucleoside fosforilasi (PNP-SCID) (Azzari, dati non pubblicati), forme di
SCID caratterizzate da alterazioni di vie metaboliche con accumulo
di metaboliti a monte delle vie compromesse.
La spettrometria di massa
Alla ricerca di un approccio alternativo, in Italia è stato sviluppato e
validato un nuovo metodo basato sulla MS in grado di identificare
due forme di SCID, il difetto di adenosina deaminasi e il difetto di
purina-nucleoside-fosforilasi caratterizzate da profonde alterazioni
metaboliche. Le alterazioni sono già presenti alla nascita e sono caratterizzate, nel caso di ADA-SCID, dall’accumulo di due metaboliti,
l’adenosina e la desossiadenosina e, nel caso di PNP-SCID, di guanosina, inosina e dei loro deossi-derivati. I metaboliti specifici sono
facilmente individuabili negli spot di sangue prelevati alla nascita
(DBS), utilizzando la stessa procedura di MS con cui oggi, nella mag-
210
gior parte dei paesi del mondo, si effettua lo screening neonatale
degli errori congeniti del metabolismo (Azzari et al., 2011).
Dalla fine degli anni ’90 i progressi tecnologici, e in particolare l’utilizzo della spettrometria di massa tandem (MS), che consente l’analisi di più metaboliti su un’unica goccia di sangue, hanno portato
a modificare il concetto di screening, da un sistema con un test per
malattia (come il test di Guthrie effettuato in origine per la diagnosi
di PKU) ad un sistema con un test per molte malattie (screening in
MS).
Nella MS, con la medesima goccia di sangue, vengono contemporaneamente analizzati e quantificati vari metaboliti (acilcarnitine,
amminoacidi), marcatori che si trovano alterati in oltre 40 malattie
metaboliche (acidurie organiche, difetti della β-ossidazione degli
acidi grassi, amminoacidopatie e difetti del ciclo dell’urea) (La Marca et al., 2008).
Queste patologie, rare singolarmente, mostrano elevata frequenza
come gruppo e sono suscettibili di trattamento. Se non diagnosticate
possono portare rapidamente ad exitus o a gravi sequele neurologiche. Il prelievo di sangue, sotto forma di DBS, è raccolto tra le 48 e
le 72 ore di vita.
Ad ogni neonato viene punto il tallone, e alcune gocce di sangue
vengono raccolte su carta bibula Whatmann 903, essiccate, quotidianamente spedite al laboratorio di screening tramite corriere e
analizzate entro due giorni dalla raccolta. La puntura del tallone avviene abitualmente sulla porzione mediale o su quella laterale del
tallone stesso, utilizzando una lancetta “pungidito”. La disinfezione
della cute avviene mediante alcool isopropilico al 70%. Occorre lasciare asciugare completamente la cute prima di pungere il tallone,
ed eliminare con garza sterile la prima goccia di sangue, al fine di
evitare commistioni di sangue e disinfettante, che possono interferire con le determinazioni analitiche.
Standard chimici e marcati
Gli standard marcati con isotopi stabili sono disponibili commercialmente e sono utilizzati per l’analisi quantitativa. La soluzione madre
viene preparata in metanolo per le acilcarnitine e in una miscela
50:50 v/v acqua/metanolo per gli amminoacidi. Le concentrazioni
degli standard sono comprese nell’intervallo 500-2500 μmol/L per
gli aminoacidi e fra 7,6-152 μmol/L per le acilcarnitine. Le concentrazioni di succinilacetone, adenosina, 2-deossiadenosina, guanosina, deossi-guanosina, inosina e deossi-inosina sono 10 μmol/L.
Le soluzioni giornaliere vengono preparate per diluizione 1:200 v/v
Screening neonatale delle immunodeficienze congenite: stato attuale e prospettive
dalle soluzioni madri usando una miscela acqua/metanolo 10:90 v/v.
Tutti i solventi utilizzati sono di grado HPLC.
Preparazione del campione e analisi MS/MS
Uno spot del diametro di 3,2 mm, corrispondente a circa 3,4 µL di sangue viene prelevato dal DBS ed inserito in una piastra a 96 pozzetti.
Duecento μl della soluzione di metanolo contenente gli standard
marcati e 100µL di una soluzione acquosa di idrazina 3mmol/L vengono aggiunti ai campioni.
La piastra contenente i campioni viene incubata a 37°C per 25 minuti sotto agitazione per ottenere una completa estrazione degli
analiti di interesse dallo spot di sangue.
Al termine dell’estrazione, il surnatante viene prelevato e trasferito
in una nuova piastra e quindi essiccato sotto corrente di azoto a circa 50°C. I campioni vengono risospesi con 300µL di una soluzione
70:30 v/v acetonitrile-H2O (0,1% acido formico).
Una volta preparato, il campione è pronto per essere analizzato con
uno strumento HPLC-MS/MS.
Le analisi di routine vengono eseguite su uno spettrometro di massa
a triplo quadrupolo, utilizzando come modalità di scansione in ionizzazione positiva il neutral loss scan per gli amminoacidi, il precursor
ion scan per le acilcarnitine e il multiple reaction monitoring (MRM)
per altri metaboliti di interesse, tra cui il succinilacetone e i nucleosidi purinici.
La diagnosi precoce mediante screening neonatale consente una
terapia, in fase presintomatica. Attualmente esiste ampia variabilità
nel gruppo di difetti metabolici ricercati su spot neonatale nei diversi
paesi. In Italia, dal 1992, lo screening neonatale include esclusivamente la ricerca della Fenilchetonuria (PKU), dell’ipotiroidismo congenito e della Fibrosi Cistica.
In anticipo rispetto alle altre regioni italiane, dal 2004 la Toscana si
è adeguata ai protocolli internazionali sottoponendo tutti i nuovi nati
a screening su DBS mediante MS per più di 40 patologie. Inoltre, da
gennaio 2011, il pannello di patologie sottoposte a screening neonatale in MS è stato allargato alle immunodeficienze causate da deficit
dell’enzima Adenosina Deaminasi (ADA) e di Purina-nucleoside Fosforilasi (PNP). I primi 18 mesi di esperienza toscana hanno permesso di individuare un paziente ADA, suggerendo così che l’incidenza
della malattia è largamente sottostimata.
L’ADA-SCID è una delle più frequenti SCID (10-25%) e nella sua forma neonatale (early onset) porta rapidamente a morte per infezioni
gravi. Esistono anche forme più tardive di questa immunodeficienza (delayed and late onset) che si manifestano con severe infezioni
ricorrenti, autoimmunità, danno neurologico; anche questi fenotipi
possono portare a danni permanenti e a morte. Proprio per la loro
caratteristica di progressività e quindi per il fatto che il danno timico
può non essere completo alla nascita, le forme che non hanno esordio neonatale sfuggono al test basato su dosaggio di TREC mentre
vengono individuate mediante il test in MS (La Marca et al., 2008;
Azzari et al., 2011). I livelli dei metaboliti adenosina e desossiadenosina, marcatori del difetto di ADA sono, infatti, correlati alla mutazione genica che ha causato il difetto, con la conseguenza che i loro
livelli sono già elevati alla nascita e restano stabilmente alterati nel
corso della vita. La differenza tra i valori che si trovano nei pazienti
con ADA-SCID e nei soggetti sani è estremamente ampia (Fig. 3),
tanto che non esiste overlapping nei range tra sano e malato. La
conseguenza di questo fenomeno è un’altissima specificità e sensibilità del test.
In maniera analoga, il metodo MS è in grado di identificare il difetto
di PNP dosando i metaboliti specifici Guanosina ed Inosina e i loro
Figura 3.
Confronto tra i livelli di adenosina e 2-deossiadenosina dosati su DBS con MS in paziente sano e affetto da ADA-SCID.
Nel paziente sano i livelli di adenosina sono molto bassi e la 2-desossiadenosina è addirittura assente. Al contrario, nel paziente con ADA-SCID
i livelli dei due metaboliti possono essere anche 1000 volte più alti dell’atteso. Non esiste overlapping tra i livelli trovati in soggetti sani e i livelli
trovati nei pazienti con ADA-SCID, per cui il test non presenta falsi positivi. I metaboliti sono già presenti alla nascita, anche in pazienti con forme
di immunodeficienza da difetto di ADA ad esordio tardivo; la tandem massa è quindi il metodo più sensibile per la diagnosi di ADA-SCID.
211
C. Azzari et al.
Tabella I.
Principali differenze tra screening neonatale per immunodeficienze effettuato con tecnologia Realtime per TREC e spettrometria di massa tandem.
Screening con TRECs
Sensibilità
Specificità
Tecnologia utilizzata
Costo per test
Screening con (per ADA-SCID e PNP-SCID)
<100%
100%
per ADA e PNP
Non identifica i casi di difetto di ADA ad esordio tardivo
Non identifica alcune SCID
Identifica tutti i casi di ADA e PNP sia ad esordio precoce
che tardivo
<100%
100%
per ADA e PNP
Valuta come casi positivi anche linfopenie T non associate
ad immunodeficienza
Non sono stati descritti falsi positivi
Realtime PCR
Spettrometria di massa
Tecnologia non in uso routinario nei laboratori di screening
Tecnologia in uso routinario nei laboratori di screening
6€
< 0,05 €
desossiderivati. Il metodo MS ha, per la diagnosi di SCID da difetto
di ADA o PNP, una specificità e una sensibilità molto elevate (ad oggi
entrambe del 100%) e un costo molto contenuto (inferiore a 0.05
€/test). Lo svantaggio di questo metodo sta nel fatto che esso non
riesce ad individuare, al momento, SCID diverse da ADA e PNP. Essendo, però, estremamente poco costoso e molto più sensibile dei
TREC, specialmente nelle forme non neonatali, il metodo MS può essere utilizzato in aggiunta all’uso dei TREC. Inoltre, per il bassissimo
costo di applicazione, il metodo può essere introdotto in tutte quelle
realtà che non dispongono di fondi sufficienti ad uno screening su
base genetica (TREC) (Tab. I).
Lo screening per ADA e PNP-SCID mediante spettrometria di massa tandem potrebbe essere facilmente incluso in un programma di
screening sulla popolazione a causa del suo basso costo e perché
non richiede né la strumentazione extra né tempo extra degli operatori, che già lavorano nei programmi di screening. Il presente metodo è applicabile anche ai neonati prematuri i cui livelli medi di adenosina, guanosina, inosina e dei loro deossi-derivati non differiscono
da quelli osservati nei neonati a termine. Nessuno dei pazienti ADA o
PNP analizzati fino ad ora è nato prematuro, ma è ben noto che elevati livelli di metaboliti tossici sono già presenti durante la vita fetale.
Il metodo descritto non sembra essere influenzato da stoccaggio
a lungo termine o condizione di cattiva conservazione. I metaboliti
assorbiti sul cartoncino di Guthrie (DBS) prelevato alla nascita sono
molto stabili, tanto che possono essere testati anche dopo anni (Azzari et al., 2011) permettendo di individuare in modo inequivocabile
un paziente ADA o PNP-SCID nato molti anni prima.
Figura 4.
Schematica rappresentazione della produzione dei KREC (modificata da van Zelm MC et al., JEM, 2007).
212
Screening neonatale delle immunodeficienze congenite: stato attuale e prospettive
Tabella II.
Principali vantaggi e limiti dei metodi di screening neonatale sperimentati fino ad oggi.
Emocromo
Vantaggi
Basso costo
Dosaggio IL-7
TREC
KREC
Spettrometria di
massa
Effettuabile su spot
neonatale
Effettuabile su spot
neonatale
Effettuabile su spot
neonatale
Effettuabile su spot
neonatale
Individua linfopenia
T, associata o meno a
SCID
Individua la maggior
parte delle SCID con
difetto di T
Individua la maggior
parte delle SCID con
difetto di T e/o B
Specificità 100% su
deficit di ADA e PNP
Sensibilità 100% su
deficit di ADA e PNP
Costo estremamente
basso
Utilizza una tecnologia
già in uso routinario nei
laboratori di screening
Limiti
Bassa specificità;
difficoltà di
impostazione di un
cut-off
Costo elevato
Costo elevato
Costo elevato
Necessaria esecuzione
di prelievo ematico su
tutti i nuovi nati
Scarsa specificità
(necessità di test di
conferma mediante
esami quali TREC)
Non identifica i difetti di
ADA ad esordio tardivo,
né alcune SCID
Non identifica i difetti di
ADA ad esordio tardivo,
né alcune SCID
Utilizza una tecnologia
non in uso nei
laboratori di screening
Utilizza una tecnologia
non in uso nei
laboratori di screening
Utilizza una tecnologia
non in uso nei
laboratori di screening
Utilizza una tecnologia
non in uso nei
laboratori di screening
Individua linfopenie
non associate ad
immunodeficienza
Deve essere effettuato
insieme con il test
TREC per raggiungere
sensibilità e specificità
adeguate
Kappa-deleting recombination excision circles
(KREC)
Analogamente a quanto avviene nella maturazione del TCR nelle
cellule T, anche nelle cellule B si verifica una ricombinazione che
estromette piccole parti di DNA “avanzato”. Con procedura simile
a quella dei TREC, che utilizza lo stesso metodo di amplificazione
genica in Realtime, questi frammenti di DNA, chiamati KREC (Fig. 4)
possono essere individuati e quantizzati, consentendo così di individuare forme di immunodeficienza primitiva con deficit isolato dei B
(Nakagawa et al., 2011).
L’utilizzo dei KREC non deve essere però visto come limitato all’individuazione delle immunodeficienze con difetto isolato di cellule B;
è stato recentemente dimostrato che in alcune forme di SCID con
fenotipo più lieve, può essere alterato anche uno solo dei due test
TREC/KREC. L’utilizzo di entrambi i metodi contemporaneamente
consente di migliorare la sensibilità di diagnosi.
È evidente però che raddoppiare un test genetico già di per sé costoso come quello dei TREC può rappresentare un ulteriore scoglio alla
diffusione dello screening. Per questo motivo sono state introdotte
tecniche di multiplex Realtime PCR, mediante le quali nella stessa
Dati disponibili solo su
difetto di ADA e PNP
provetta viene ricercata con primer e sonde specifiche sia la presenza di TREC che di KREC (Borte et al., 2012). In questo modo il costo
è solo di poco superiore al costo dei TREC da soli.
Resta tuttavia da chiarire quale sia la specificità del metodo KREC e
quella del metodo multiplex (TREC più KREC) quando usati su un’intera popolazione di nuovi nati. Questi dati potranno essere ottenuti
soltanto mediante l’applicazione del metodo ad uno screening di
popolazione. Il passo successivo sarà, per tutti i ricercatori che si
occupano di screening neonatale, quello di armonizzare le procedure in modo da avere risultati paragonabili, tendo conto dei vantaggi e
svantaggi di tutte le tecnologie fino ad oggi utilizzate (Tab. II).
Prospettive future
In conclusione, l’utilizzo di uno screening neonatale per le SCID può
significativamente migliorare l’outcome clinico della patologia e
molti metodi, tra cui l’analisi con amplificazione genica dei TREC e
KREC, o metodi in spettrometria di possono essere utilizzati allo scopo di allargare il più possibile la popolazione sottoponibile a screening con il costo più ridotto possibile.
213
C. Azzari et al.
Bibliografia
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Baker MW, Grossman WJ, Laessig RH et al. Development of a routine newborn
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** Gli autori hanno effettuato uno studio su quattro pazienti pediatrici affetti da
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** L’autore riesamina, alla luce dei recenti progressi nell’ambito della biologia
molecolare e della genetica, le basi patogenetiche, i metodi di diagnosi e le possibilità terapeutiche delle immunodeficienze primarie.
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Box di orientamento
Cosa si sapeva prima
Le immunodeficienze congenite sono malattie estremamente gravi e spesso mortali già nel primo anno di vita. Inizialmente si credeva che esse fossero
estremamente rare. Nel passato sono stati proposti diversi metodi per la loro diagnosi molto precoce, tra cui il dosaggio di IL7, l’emocromo a tutti i
nuovi nati.
Cosa sappiamo adesso
Oggi sappiamo che la frequenza delle immunodeficienze congenite è grandemente sottostimata e che sono disponibili metodologie basate sulla biologia molecolare o sulla spettrometria di massa, altamente sensibili e specifiche, che consentono di effettuare uno screening di massa per la maggior
parte di esse.
Quali ricadute sulla pratica clinica.
Considerando che esistono terapie risolutive, estremamente efficaci se utilizzate in fase pre-sintomatica, si può prevedere una diffusione sempre
maggiore dello screening neonatale per le immunodeficienze congenite.
Corrispondenza
Chiara Azzari, Immunologia Pediatrica, Università degli Studi di Firenze, Azienda Ospedaliero-Universitaria Anna Meyer, Viale Pieraccini, 24, 50139
Firenze. [email protected]
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