STUDIO DI ALTERAZIONI
EPIGENETICHE IN MELANOMI CUTANEI
PRIMITIVI E METASTATICI.
G Sartori (1), L Garagnani (2), L Schirosi (3),
C De Gaetani (4), A Maiorana (5).
Dipartimento ad Attività Integrata di Laboratori, Anatomia
Patologica e Medicina Legale, Sezione di Anatomia
Patologica, Università degli Studi di Modena e Reggio
Emilia, Modena.
INTRODUZIONE I
Il melanoma cutaneo è una neoplasia caratterizzata da
molteplici e diverse alterazioni a livello genico. I
principali meccanismi molecolari implicati nella
tumorigenesi e nello sviluppo di metastasi in queste
forme tumorali sono rappresentati da:
• Delezioni geniche (in particolare, del gene CDKN2A);
• Mutazioni attivanti (in particolare, dei geni B-RAF e NRAS);
• Inattivazioni epigenetiche (coinvolti numerosi geni ad
azione onco-soppressiva).
INTRODUZIONE II
• I processi di metilazione a carico dei promotori
genici sono alterazioni molecolari che implicano una
riduzione dell’espressione genica corrispondente; si
sono, inoltre, dimostrati eventi cruciali nel
determinare lo sviluppo e la progressione in
molteplici forme tumorali.
• Negli ultimi anni, nel tentativo di individuare fattori
prognostici e predittivi di risposta a trattamenti
terapeutici specifici, sono stati condotti numerosi
studi di valutazione dello stato di metilazione genica.
SCOPO
Scopo del lavoro svolto consiste nella valutazione
in una serie di melanomi cutanei e nelle loro
metastasi (linfonodali, dermiche e viscerali) di
diversi marcatori molecolari suscettibili di
inattivazione attraverso meccanismi epigenetici.
L’analisi contemporanea di forme primitive e
metastatiche di queste neoplasie potrebbe
consentire di individuare geni eventualmente
coinvolti nello sviluppo di lesioni maggiormente
aggressive.
MATERIALI
• Sono stati analizzati 29 casi di melanomi cutanei
primitivi, in 14 dei quali erano anche disponibili
metastasi metacrone localizzate in sedi differenti; il
numero di metastasi per caso era variabile da 1 a 4.
• Le forme metastatiche analizzate sono risultate così
distribuite: 9 a livello linfonodale; 5 a livello dermico;
4 a livello polmonare; 3 a livello muscolare; 1 a
livello cerebrale; 1 a livello intestinale.
METODI
• Sezioni rappresentative del materiale in esame,
precedentemente fissato in formalina ed incluso in
paraffina, sono state utilizzate per valutare lo stato di
metilazione dei promotori dei geni MGMT, ER-α,
PTEN, RASSF1A e APAF, mediante metodica di PCR
metilazione-specifica (MSP). Degli ultimi tre geni
sono state esaminate due regioni, una prossimale e
una distale al sito d’inizio della trascrizione.
MSP
• L’MSP si basa sul pretrattamento del campione di DNA
con sodio bisolfito, che determina la conversione di
tutte le citosine non metilate in molecole di uracile,
mentre le 5-metilcitosine rimangono inalterate. La
sequenza del DNA trattato risulta così modificata o
meno a seconda che la sequenza originale si presenti,
rispettivamente, non metilata o metilata.
• Ogni campione di DNA così modificato deve quindi
essere analizzato mediante una doppia amplificazione
con PCR, condotta con primers specifici (MSP,
methylation specific PCR), disegnati in modo da
distinguere fra DNA metilato (M) e non-metilato (U).
RISULTATI I
• Il gene più frequentemente metilato è risultato essere
l’ER-α, alterato nel 79,3% delle forme primitive e nel 78,3%
delle metastasi. I geni PTEN e RASSF1A sono risultati
metilati nel 44,8% delle forme primitive e, rispettivamente,
nel 73,9% e nel 39,1% delle forme metastatiche. Non è
stata evidenziata metilazione del gene APAF in nessun
caso esaminato.
• Non sono state osservate correlazioni tra presenza di
metilazione genica, successiva comparsa di metastasi e
sopravvivenza dei pazienti.
RISULTATI II
• Particolarmente interessante è stato il riscontro di una
assenza di metilazione del gene MGMT in tutti i tumori
primitivi, a fronte di una percentuale di metilazione del
39,1% nei tessuti metastatici.
• Lo stato di metilazione è risultato variabile in differenti
metastasi metacrone dello stesso paziente, in cui, per
esempio, una metastasi linfonodale mostrava MGMT
non-metilato, mentre una metastasi polmonare
risultava metilata per MGMT (figura 1).
MSP DEL
GENE MGMT
1
2
3
4
5
6
M
1
2
3
4
5
6
1: Controllo Positivo (un
allele U e uno M).
2: Controllo Negativo.
3: Campione non metilato
(melanoma primitivo).
4: Campione metilato
(metastasi polmonare).
5: Campione non metilato
(metastasi linfonodale).
MSP, PRIMERS U
MSP, PRIMERS M
6: Controllo Negativo di
PCR.
M: Marcatore di PM.
Figura 1. La presenza di un prodotto di PCR condotta con primers
“U” indica un allele non-metilato, mentre un prodotto ottenuto con
primers “M”indica un allele metilato per il gene MGMT.
RISULTATI III
• Valutando lo stato di metilazione del gene MGMT nelle
forme metastatiche, si è osservato come questa sia
più frequente nelle metastasi viscerali (66,7% dei
casi) rispetto a quelle linfonodali e dermiche (28,6%
dei casi).
• Una tendenza opposta è emersa, invece, per il gene
RASSF1A, la cui metilazione è più frequente nelle
metastasi linfonodali e dermiche (50,0% dei casi)
rispetto a quelle viscerali (22,2% dei casi).
CONCLUSIONI
• Nella casistica di melanomi analizzata è stata
riscontrata la presenza di inattivazione del gene
MGMT secondaria a metilazione in circa due terzi dei
casi di metastasi viscerali in esame.
• Tale informazione potrebbe rivestire importanza
terapeutica, in quanto sono disponibili farmaci
alchilanti, quali la temozolomide, la cui efficacia
terapeutica è diminuita o bloccata dalla presenza di
una forma attiva del gene MGMT.