ESERCIZI
di
BIOLOGIA
MOLECOLARE
A.A 2004-2005
ESERCIZIO n°1
Il plasmide pNEB è una molecola di DNA circolare di 2713
bp.
La soluzione ottenuta dopo il processo di purificazione
presenta il seguente spettro di assorbimento nell’UV visibile:
0,8
0,7
0,6
0,5
A
0,25
0,4
0,3
0,2
0,1
0
200
210
230
260
l(nm)
280
290
300
1)
Qual è la concentrazione MOLARE della
soluzione?(d=cammino ottico=0,3 cm)
[C=30,7 X 10 –9 M=30,7 nM]
2)
1)
Qual è la concentrazione in ng\ml? [C=55 ng\ml]
Considerando che per la misura allo spettrofotometro, 5ml
della soluzione originaria sono stati diluiti in 95 ml di
acqua, qual è la concentrazione molare della soluzione
originaria?
[C=614 X 10 –9 M=614 nM; C=1,1 mg\ml]
Quale sarebbe stata l’Assorbanza osservata se la misura
fosse stata eseguita sulla soluzione originaria? [ A = 4,99]
Considerando che il volume della soluzione originaria
rimasta è 30 ml, quanti mg totali di DNA abbiamo?
[DNATOT= 33 mg]
1)
2)
ESERCIZIO n°2
Avendo 815 ·10-6 g. di u oligonucleotide a singolo
filamento (primer) lungo 24 nt, in quanti ml di acqua è
necessario scioglierli per ottenere una soluzione 100 mM?
[V=1029 ml=1,3 ml]
Diluiamo 1 ml della soluzione in 99 ml di acqua.
Quale risulterà l’assorbanza a l=260 nm di tale soluzione?
[ A=0,24]
ESERCIZIO n°3
Il Servizio di Sequenziamento richiede per eseguire la
reazione
-500 ng. di campione da sequenziare
-6,4 pmol dell’oligonucleotide utilizzato come primer.
1)Quanti ml di una soluzione 125 nM di un plasmidio lungo
3215 bp da sequenziare devo inviare? [ 1,88 ml ]
2)Quanti ml di oligonucleotide 10 mM? [ 0,64 ml ]
ESERCIZIO n°4
Quanto misura la lunghezza in nm di una molecola di DNA
lineare in forma B costituita da 9824 bp? [ L=3340,16
nm=3,34 mm ]
Quanti giri di elica contiene? [n°giri=982]
Se la stessa molecola viene posta in alcool, quindi in
condizioni di scarsa umidità, quale modificazione strutturale
interviene? [forma A]
Di quanto varieranno lunghezza in nm e numero di giri
dell’elica?
[L=2515 nm=2,515 mm ; n° giri=893]
ESERCIZIO n°5
Qual è il peso molecolare (PM) di una molecola di DNA ds
(double strand)di 3421 bp? [PM= 2257869 Da]
Quale invece il peso molecolare di un singolo filamento di
DNA di 1750 nucleotidi? [PM=577500 Da]
ESERCIZIO n°6
Se una soluzione contenente tre frammenti di DNA lunghi
rispettivamente 1600 bp, 650 bp e 1105 bp, viene sottoposta
ad elettroforesi su gel di agarosio, quale sarà, a partire dal
polo positivo, l’ordine delle bande osservate al termine della
corsa?
Il peso molecolare di una molecola di DNA a
doppio filamento è:
PM= 660 x nro bp
DA DOVE DERIVA IL VALORE
“660”?
-è il peso molecolare di una coppia di basi, quindi la
metà, 330, corrisponde al peso molecolare di un
nucleotide.
-Poiché il DNA è costituito da quattro nucleotidi
diversi, tale valore rappresenta un VALORE MEDIO
PO3 PM=78
C5H10O4 PM=130
PM=111
PM=126
PM=135
PMmedioBASI=130
PMmedioNUCLEOTIDE
330
PM=150
ESERCIZIO n°7
Un plasmide di 3000 bp viene sottoposto ad una serie di
restrizioni analitiche che danno i seguenti risultati visualizzati
con gel-elettroforesi:
Kb
1)
Quanti siti di restrizione ha EcoRI?
[2]
2) Quanti siti di restrizione ha BamHI?
[2]
3) Quali sono le distanze reciproche
tra i siti?
Disegnare la mappa di restrizione.
ESERCIZIO n°8
Un plasmide di 6000 bp viene sottoposto ad una serie di
restrizioni analitiche che danno i seguenti risultati visualizzati
con gel-elettroforesi:
Digestioni singole
Kb
1)
2)
3)
4)
Quanti siti di restrizione ha PvuII?A quale distanza
reciproca?
[ 3 siti posti a 2000 bp uno dall’altro]
Quanti siti di restrizione ha EcoRI? [1]
Quanti siti di restrizione ha BamHI? [1]
Quanti siti di restrizione ha SapI? [1]
Digestioni doppie
Kb
1) Quali sono le distanze reciproche tra i siti di restrizione?
Disegnare la mappa di restrizione.
ESERCIZIO n°9
Un frammento di DNA lineare lungo 5000 bp viene
sottoposto ad una serie di restrizioni analitiche che danno i
seguenti risultati visualizzati con gel-elettroforesi:
Kb
1) Quanti siti di restrizione ha EcoRI? [1]
2) Quanti siti di restrizione ha BamHI? [1]
3) Quali sono le distanze reciproche tra i siti?
Disegnare la mappa di restrizione del frammento.
ESERCIZIO n°10
Il plasmide A, lungo 4000 bp viene tagliato con BamHI e il
risultato della restrizione viene visualizzato tramite gelelettroforesi:
Kb
1)
2)
Quanti siti di restrizione ha
BamHI? [2]
Qual è la loro posizione
reciproca? [1000 bp di distanza]
Supponiamo di recuperare e purificare il frammento di
restrizione più lungo.
Avendo digerito 4 mg di plasmide A, se al termine della
purificazione del frammento di 3000 bp, la soluzione ottenuta
presenta una A260nm=0,4, quanti ng di DNA sono stati persi nei
vari passaggi rispetto alla resa teorica?
[ DNA perduto=1260 ng]
Il frammento di 3000 bp viene utilizzato come vettore di
clonaggio per l’inserzione di un frammento di DNA di 178
bp ottenuto a sua volta da un secondo plasmide per
restrizione BamHI-NdeI.
1) Quale sarà la lunghezza in bp del nuovo costrutto?
[3178 bp]
2) Quale sarà il risultato di una successiva digestione del
nuovo costrutto con BamHI? [il costrutto circolare viene
linearizzato]
3)Nella reazione di ligazione, vettore e inserto devono
essere miscelati in rapporto molare 1:3; utilizzando 100
ng di vettore, quanti ng di inserto sono necessari?
[quantità inserto=17,62 ng]
Se la soluzione dell’inserto di 178 bp a disposizione
presenta lo spettro di assorbimento nell’UV visibile
rappresentato in figura, quanti ml ne devono essere
utilizzati?
[V= 0,5 ml]
0,8
0,7
0,6
0,5
A 0,4
0,3
0,15
0,2
0,1
0
200
210
230
260
280
l(nm)
290
300
ESERCIZIO n°11
Dobbiamo preparare 50 ml di un buffer di trascrizione(10X)
così costituito:
500 mM KCl
200 ml Tris-HCl
50 mM MgCl2
Avendo a disposizione i seguenti stock concentrati
Tris-Hcl 1M
KCl
2M
MgCl2
1M
Quanti ml di ciascuno stock devono essere utilizzati?[KCl
12,5 ml;Tris-HCl 10 ml; MgCl2 2,5 ml; si aggiungono 25ml di
acqua]
Considerando che il volume di ciascuno stock è 25 ml e che
le tre sostanze hanno i seguenti PM
KCL
PM=74,56 uma
MgCl2
PM=203.32 uma
Tris-HCl
PM=157.64 uma
quanti g. di ciascuna sostanza sono stati pesati per preparare
i tre stock?
[KCl g. 3,728;MgCl2 g. 5,083;Tris-HCl g. 3,941]
Quanti g. di ciascuna sostanza sarebbero serviti per
preparare il buffer direttamente dalle polveri?[KCl
g.1,864;MgCl2 g. 0,5; Tris-HCl g. 1,576]
ESERCIZIO n°12
Per ottenere un frammento di DNA di 850 bp, esso viene
amplificatotramite PCR e gel purificato.
Si allestiscono 4 reazioni di PCR, ciascuna avente un Volume
di 50 ml.
Considerando che a PCR ultimata la concentrazione di DNA
n soluzione è in ciascun tubo 10 ng\ml e che l’efficienza della
procedura di gel purificazione è del70 %, quale sarà la
concentrazione molare dei 50 ml di soluzione finale
ottenuti?Quanti mg. totali di DNA si ottengono?[c=50x 10-9M
=50 nM;mg.DNA 1,4]
ESERCIZIO n°13
La corsa elettroforetica di tre campioni contenenti frammenti
di DNA ha fornito il seguente risultato:
1
2
3
Determinare la lunghezza
in bp e il peso molecolare
dei frammenti contenuti in
ciascun campione.
[1:544bp; 2:1480 bp ;3:
221 bp]
La corsa elettroforetica di molecole si
dimensioni diverse va linearmente con
il LOGARITMO del peso molecolare
n° bp ln
n°bp
Distanza
(mm)
1857
7,5
0,75
1058
6,96
2,7
929
6,83
3,2
383
5,94
6,28
121
4,79
9,05
8
ln lunghezze
7
6
5
4
3
2
1
0
0
2
4
6
8
10
lunghezze(bp)
distanze (mm)
2000
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
0
2
4
6
distanze (mm)
8
10