Laboratorio di Citogenetica
Laboratorio di Biologia Molecolare
LE ANALISI DI LABORATORIO
PER LA DIAGNOSI PRENATALE:
DALLA CITOGENETICA
TRADIZIONALE AGLI ARRAY
MODENA , 09 MARZO 2013
Dott.ssa Patrizia Caggiati
Responsabile Settore Biologia Molecolare
[email protected]
N° TELEFONO 800116110
Laboratorio Test – Viale Verdi, 63 – 41121 Modena
Con il termine di DIAGNOSI PRENATALE si
intende l’insieme delle indagini strumentali
e di laboratorio finalizzate ad ottenere
informazioni sullo stato di salute
dell’embrione e del feto e ad individuare
eventuali patologie fetali su base
genetica,infettiva,iatrogena o ambientale.
Laboratorio Genetica Medica
DIAGNOSI PRENATALE
Dati recenti indicano che circa il 2-5% dei neonati
è affetto da una malattia genetica.
Lo scopo della diagnosi prenatale (DP) è quello
di offrire ai genitori e al medico le migliori
informazioni possibili sui rischi di dare alla luce
un bambino affetto da un'anomalia congenita o
da una malattia genetica.
Le tecniche di DP utilizzate sono:
non invasive (ecografia, test biochimici)
invasive (villocentesi,amniocentesi,cordocentesi)
Laboratorio Genetica Medica
DIAGNOSI PRENATALE
• LE TECNICHE DI DP NON INVASIVE
consentono di effettuare esclusivamente una
valutazione probabilistica dal momento che non
permettono di identificare o di escludere
direttamente le anomalie cromosomiche ma di
selezionare pazienti a basso e ad alto rischio.
• LE TECNICHE DI DP INVASIVE permettono di
giungere ad una diagnosi di tipo citogenetico,
molecolare, immunologico, infettivo.
Laboratorio Genetica Medica
DIAGNOSI PRENATALE
Attualmente l’indagine citogenetica
per lo studio del cariotipo fetale
interessa circa l’80% delle diagnosi
prenatali eseguite per evidenziare
patologie genetiche.
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DIAGNOSI PRENATALE
• I laboratori di citogenetica eseguono specifici
test finalizzati allo studio del cariotipo. Viene
definito cariotipo l´insieme dei cromosomi
caratteristico per numero e struttura del
genoma di una specie.
• L´analisi citogenetica permette di identificare
anomalie cromosomiche costituzionali o
acquisite, di numero o di struttura, omogenee
o a mosaico.
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ANOMALIE CROMOSOMICHE
Laboratorio Genetica Medica
ANOMALIE CROMOSOMICHE
NUMERICHE
POLIPLOIDIE
La più comune è la TRIPLOIDIA dovuta a
fecondazione di un singolo ovulo da parte di due
spermatozoi (DISPERMIA) o dalla fecondazione
che coinvolge un gamete diploide anomalo.
La TETRAPLOIDIA è invece dovuta al non
completamento della prima divisione zigotica.
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ANOMALIE CROMOSOMICHE
NUMERICHE
ANEUPLOIDIE
Le aneuploidie più comuni sono le TRISOMIE e MONOSOMIE .
I principali meccanismi sono:
NON-DISGIUNZIONE: incapacità dei cromosomi di separarsi durante la prima
divisione meiotica, o dei cromatidi fratelli appaiati di separarsi nella seconda
.
divisione meiotica. I due cromosomi o cromatidi congiunti migrano ad un polo e
vengono inclusi in una sola cellula figlia, mentre l’altra avrà materiale genetico in
meno.
RITARDO ANAFASICO: ritardata migrazione del cromosoma durante l’anafase e
conseguente perdita del cromosoma. Mancata incorporazione di un cromosoma
nel nucleo di una delle cellule figlie.
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ANEUPLOIDIE PIU’ FREQUENTI
ALLA NASCITA
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ANOMALIE CROMOSOMICHE
NUMERICHE
CROMOSOMI MARKER
Il termine di cromosoma marker (ESACs) viene usato in citogenetica
per indicare qualsiasi piccolo cromosoma sovrannumerario non
identificabile mediante le usuali tecniche di bandeggio.
Possono essere classificati come de novo o familiari.
Possono essere omogenei oppure a mosaico.
Da un punto di vista morfologico la classificazione fondamentale è
quella che distingue i marker satellitati (con satelliti che derivano da
cromosomi acrocentrici) da quelli non satellitati.
Incidenza dei marker :
0,6/1000 a 0,9/1000 casi in amniocentesi
3:1000 in pazienti con ritardo mentale
1:4.000 nella popolazione generale
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CROMOSOMI MARKER
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CROMOSOMI MARKER
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ANOMALIE CROMOSOMICHE
NUMERICHE
MOSAICISMO CROMOSOMICO
Per mosaicismo cromosomico si intende la presenza nello stesso
individuo , in suo organo o tessuto, di due o più linee cellulari
derivanti dallo stesso zigote, dovute ad una non disgiunzione o
ritardo cromosomico verificatisi in una delle divisioni mitotiche in
fase embrionale precoce.
Il mosaicismo può coinvolgere sia il feto che la placenta, oppure
indipendentemente l’uno dall’altro, in relazione allo stadio precoce o
tardivo in cui si instaura la nuova linea cellulare durante
l’embriogenesi.
La frequenza del mosaicismo cromosomico è valutata in circa l’1-2%
delle aneuploidie esaminate.
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ANOMALIE DI STRUTTURA
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•
•
•
•
Delezioni
Duplicazioni
Inversioni
Traslocazioni (reciproche e robertsoniane)
Cromosomi ad anello
Isocromosomi
Anomalie cromosomiche bilanciate: se non c’è acquisizione o perdita netta di
materiale cromosomico.
Anomalie cromosomiche sbilanciate: se c’è acquisizione o perdita netta di materiale
cromosomico. In caso di sbilanciamento la gravità è correlata al tipo di cromosoma e
alla quantità di geni interessati.Tanto più grave è lo sbilanciamento cromosomico tanto
più precoce sarà l’interruzione di gravidanza.
Negli aborti la frequenza delle alterazioni strutturali sbilanciate è dell’1,54% e dello
0,28% per quelle bilanciate.
Tra i nati vivi è dello 0,06% per riarrangiamenti sbilanciati e dello 0,52% per quelli
bilanciati.
Nella popolazione generale circa 1 individuo su 200 è portatore di un
riarrangiamento strutturale bilanciato.
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FREQUENZA DELLE ANOMALIE
CROMOSOMICHE IN DIAGNOSI PRENATALE
Direttamente correlata con l’età materna.
Inversamente correlata con l’epoca gestazionale.
20% dei prodotti del concepimento vengono abortiti prima dell’impianto
42% vengono abortiti prima della 7a s.g.
10% vengono abortiti tra la 7a e la 12a s.g.
3% vengono abortiti dopo la 12a s.g.
Solo il 25% dei concepiti arrivano alla nascita.
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INDICAZIONI ALL’ESECUZIONE
DELLA DIAGNOSI PRENATALE
• Età materna avanzata: superiore a 35 anni.
• Coppie con precedente figlio affetto da una anomalia cromosomica.
• Genitore portatore
bilanciata.
di
una
anomalia
cromosomica
strutturale
• Genitore portatore di un marcatore cromosomico sovrannumerario.
• Genitore con mosaicismo cromosomico.
• Riscontro ecografico di malformazioni fetali, ritardo dello sviluppo
fetale.
• Indagini biochimiche su siero materno suggestive di un aumento del
rischio di patologia cromosomica nel feto.
• Storia familiare di malattia genetica.
• Storia familiare di difetti del tubo neurale.
• Malattie infettive insorte in gravidanza.
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ANALISI DI DIAGNOSI CITOGENETICA
PRENATALE EFFETTUATE PRESSO IL
NOSTRO LABORATORIO
Cariotipo su villi coriali
Incubazione
a
breve
termine:
Analisi
del
citotrofoblasto
Coltura a lungo termine:
Analisi
Mesoderma
extraembrionale
Cariotipo su liquido amniotico
Materiale abortivo
Laboratorio Genetica Medica
SETTORE DI CITOGENETICA
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La Sezione di Citogenetica è attiva dal 1991 ed opera sia su richiesta dei
singoli medici, che in convenzione con strutture pubbliche e private.
Il Laboratorio Test garantisce per tutte le analisi citogenetiche gli standard
qualitativi previsti dalle linee guida emanate dall’ISS.
Per gli aspetti tecnici, il Laboratorio Test fa riferimento alle linee guida per
l’analisi citogenetica riportate sul documento del “CONSENSUS 2007”,
formulate da gruppi di lavoro della Società Italiana di Genetica Umana
(SIGU) facendo riferimento ai documenti internazionali, in particolare:
“Cytogenetic Guideline and Quality Assurance” a cura della European
Cytogeneticists Association (2006).
Il laboratorio TEST possiede la certificazione SIGUCERT specifica dei
laboratori di Genetica Medica.
Nel settore di citogenetica viene monitorata trimestralmente la qualità del
servizio mediante l’analisi di specifici indicatori statistici. Il laboratorio
partecipa inoltre a controlli di qualità esterni (CEQA).
Nel settore di citogenetica opera personale tecnico con consolidata
esperienza e personale laureato con specializzazione in genetica medica e
genetica applicata.
Laboratorio Genetica Medica
VILLI CORIALI
Prelievo eseguito tra la 10a e la 12a settimana di gestazione (10 mg).
Se eseguita prima della 10a settimana si associa più frequentemente ad
anomalie degli arti, micrognatia, microglossia.
Metodo “diretto”: Si sfruttano le mitosi spontanee delle cellule del
citotrofoblasto; si procede alla selezione dei villi idonei, eliminando eventuale
sangue o decidua aspirati durante il prelievo; i villi vengono messi in coltura
per 24-48 h; si aggiunge colchicina; si effettua lo shock osmotico con
soluzione ipotonica per rompere le membrane cellulari; si esegue il fissaggio e
lo striscio del preparato sul vetrino e analisi delle metafase dopo colorazione.
Vantaggi: tempi risposta (2-7 gg), minor inquinamento da cellule materne.
Svantaggi: l’attivita’ mitotica e la qualità delle metafasi sono inferiori al
metodo della coltura. Risoluzione 300 bande /set aploide.
Metodo “coltura”: I villi sono posti in coltura previo trattamento con enzimi
proteolitici (pronase e collagenase) per disgregare le cellule del mesenchima.
A crescita avvenuta, si procede al trattamento con colchicina, cui segue shock
osmotico, fissaggio dei preparati su vetrino e analisi delle metafase dopo
colorazione. Tempi di risposta 18-21gg. Risoluzione 400 bande /set aploide.
Laboratorio Genetica Medica
VILLI CORIALI
L’INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO dipende da:
•
Risoluzione delle metafasi ottenute
Numero di bande osservabili.
Rischio di non scorgere minime alterazioni strutturali (inferiori a 10 Mb).
•
Contaminazione materna
Presenza di decidua nel materiale prelevato.
•
Mosaicismo
TIPO I (solo citotrofoblasto)
TIPO II (solo nel mesenchima)
TIPO III (nel citotrofoblasto e nel mesenchima)
Il riconoscimento di una condizione di mosaicismo richiede una conferma nel II trimestre
di gravidanza: mosaicismo vero o mosaicismo confinato alla placenta (CPM).
Differenze nel cariotipo delle diverse componenti dell’unità feto-placentare vengono
osservate nell’1-2% circa dei prelievi di villi coriali.
Necessità di consulenza genetica
Laboratorio Genetica Medica
VILLI CORIALI
Successo e accuratezza diagnostica
• Fallimento dell’esame nello 0,5-1% dei casi (assenza di
metafasi in diretta e/o di crescita cellulare in coltura).
• Falsi positivi dell’esame citogenetico nell’1% dei casi circa per
la presenza di mosaicismi placentari (90%) e raramente per
aneuploidie non a mosaico.
• Falsi negativi degli esami citogenetici sono rarissimi (1 su
3000) utilizzando la sola tecnica diretta, eccezionali (1 su
20.000) utilizzando l’analisi diretta insieme a quella colturale.
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LIQUIDO AMNIOTICO
Prelievo di 16 ml di liquido amniotico eseguito tra la 16a e la 18°
settimana di gestazione.
Materiale esaminato: cellule di desquamazione provenienti da sacco
amniotico,epidermide, mucosa del tubo digerente, del tratto
respiratorio e di quello urogenitale.
Metodo “in situ”: l’analisi avviene per colonie. Migliore valutazione
diagnostica in caso di mosaicismo cromosomico o di
contaminazione materna.
Metodo “in fiasca”: si perde l’individualità.
Su un’aliquota di liquido amniotico viene eseguito il dosaggio
dell’alfafetoproteina per lo screening dei difetti del tubo neurale.
Tempi di refertazione 15 giorni.
Risoluzione: 400 bande per set aploide.
Laboratorio Genetica Medica
LIQUIDO AMNIOTICO
L’INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO dipende da:
•
Risoluzione delle metafasi ottenute
Numero di bande osservabili.
Rischio di non scorgere minime alterazioni strutturali (inferiori a 10 Mb).
•
Contaminazione materna
Presenza di cellule materne nel materiale prelevato.
•
Mosaicismo
Tipo I: una singola cellula con anomalia numerica o strutturale (2,5%-7%).
Tipo II: due o più cellule con la stessa alterazione proveniente da una coltura in fiasca
o da una singola colonia o più colonie anomale osservate in una singola coltura in situ
(0,7%-1,1%).
Tipo III : più metafasi o colonie in almeno due preparati provenienti da due colture in
fiasca o da due colture in situ indipendenti (0,2%).
Tipo I e II: pseudomosaicismo
Tipo III: mosaicismo fetale o vero
Necessità di consulenza genetica
Laboratorio Genetica Medica
PROBLEMATICHE E LIMITI
DELL’ANALISI CITOGENETICA
PRENATALE
1. Possibilità che le cellule in coltura non crescano in
maniera adeguata e non sia possibile effettuare la diagnosi
sul campione prelevato.
Assenza di metafasi nel metodo diretto e/o di crescita
cellulare nel metodo coltura per i villi coriali (1%).
Assenza o ridotta crescita cellulare per il liquido amniotico
(0.2-0.5%).
2. Possibilità che l’analisi fornisca un risultato ambiguo.
Contaminazione materna (0.3% in L.A. e 2% in V.C.).
Mosaicismo cromosomico, pseudomosaicismo.
Laboratorio Genetica Medica
PROBLEMATICHE E LIMITI
DELL’ANALISI CITOGENETICA
PRENATALE
3. Diagnosi certa ma implicazioni fenotipiche incerte
Questo costituisce attualmente un importante limite della
diagnosi citogenetica fetale. In pratica, a fronte di un
risultato diagnostico accurato a livello di laboratorio, non
è possibile in certi casi predire con altrettanta
accuratezza il fenotipo fetale.
In queste situazioni viene attribuito un rischio empirico di
patologia, che non è ulteriormente precisabile.
Esempi di queste problematiche sono rappresentati da
riarrangiamenti strutturali de novo e dalla presenza di
marker sovrannumerari.
Laboratorio Genetica Medica
ARRAY-CGH
Array –based Comparative Genomic Hybribation
L’analisi array-CGH viene utilizzata per analizzare lo sbilanciamento
del numero di copie di sequenze genomiche ad una risoluzione di
molto superiore a quella possibile con le tradizionali tecniche di
citogenetica su metafasi. Questa tecnologia è basata sull’uso di
campioni di DNA da analizzare e DNA di controllo marcati con
fluorocromi diversi che vengono ibridati contemporaneamente a
DNA targets (BAC od oligonucleotidi) localizzati su un vetrino.
L’analisi a-CGH è impiegata per la diagnosi di anomalie
cromosomiche quantitative, ossia di CNVs (Copy Number
Variations), in forma di delezione o duplicazione.
Permette di analizzare numerosi riarrangiamenti cromosomici
responsabili di sindromi con ritardo psicomotorio e anomalie
fenotipiche multiple (anomalie comprese tra 10Mb e 75-100kb).
Per eseguire l’analisi molecolare in prenatale è necessario una
fiasca di amniociti coltivati oppure 10-20mg di villi coriali e il
prelievo ematico dei genitori in K3-EDTA e in Litio o Na-Eparina per
eventuali controlli.
Laboratorio Genetica Medica
ARRAY-CGH
Laboratorio Genetica Medica
ARRAY-CGH
Array-CGH ad alta risoluzione (oligoarray) può essere
utilizzato in diagnosi prenatale in presenza di:
1. Riarrangiamenti cromosomici de novo apparentemente bilanciati.
2. Piccoli cromosomi marcatori soprannumerari (ESACs).
3. Translucenza nucale >4mm in presenza di un cariotipo standard normale
4. Associazione, in varia combinazione, tra più marcatori ecografici minori (cisti
dei plessi coroidei, iperecogenicità intestinale, pielectasia renale, arteria
ombelicale unica).
5. Alterazioni del volume del liquido amniotico e/o ritardo dell’accrescimento
fetale in associazione con marcatori ecografici minori.
6. Cardiopatie congenite.
7. Ernia diaframmatica.
8. Anomalie del sistema nervoso centrale (esclusa anencefalia).
Laboratorio Genetica Medica
LIMITI DELLA TECNICA
a-CGH deve essere intesa come un’integrazione
dell’esame cromosomico convenzionale.
Con questa tecnica non si evidenziano
riarrangiamenti cromosomici bilanciati come
traslocazioni bilanciate e inversioni e le polipliodie.
Non si evidenziano mosaicismi cellulari inferiori al
10%.
Laboratorio Genetica Medica
LIMITI DELLA TECNICA
Esistono problematiche connesse con l’interpretazione dei risultati
legati ai seguenti aspetti
CNVs BENIGNE
CNVs PATOGENICHE
CNVs di
SIGNIFICATO
INCERTO
• CNVs di piccole dimensioni, sono riscontrabili in
individui normali e sono prive di significato
patologico.
• CNVs delete o duplicate responsabili di
riarrangiamenti submicroscopici clinicamente
significativi.
• Riarrangiamento de novo caratterizzato da CNVs piccole e/o con
geni poco caratterizzati. Oppure CNVs ereditate da un genitore che
ad oggi non assume un chiaro significato patogenetico. Tuttavia il
coinvolgimento del riarrangiamento come consausa della malattia
non può essere escluso.
E' fondamentale prima di
procedere al prelievo fornire
alla coppia le informazioni
sull'esame richiesto e
richiedere il consenso
all’analisi.
Laboratorio Genetica Medica
GRAZIE PER
L’ATTENZIONE
Laboratorio Genetica Medica
•
•
Direttore Laboratorio
Dott.ssa Rossana Bellucci
Laboratorio di Citogenetica
Laboratorio di Biologia Molecolare
Dott.ssa Patrizia Caggiati
Dott.ssa Angela Ricco
Dott.ssa Francesca Ravasini
Dott.ssa Alessandra Scarselli
Sig.ra Elisabetta Loro
Sig. Raffaele Gambini