Diagnosi Prenatale I
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Diagnosi prenatale
nata nel 1966 (Steele e Breg); richiede l’intervento di numerose
discipline: ostetricia, ultrasonografia, genetica clinica, diagnosi e
consulenza genetica e la diagnostica di laboratorio;
scopi:
fornire scelte informate alle coppie a rischio
rassicurare e ridurre l’ansia
permettere a coppie ad alto rischio di confermare o smentire
l’anomalia nel feto mediante il test, anziche’ rinunciare ad avere
figli
permettere a coppie con un bambino affetto di avere una
preparazione psicologica prima e dopo la nascita
permettere il trattamento prenatale del feto affetto
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Indicazioni Diagnosi prenatale
1. Eta’ materna avanzata
Incidenza della
trisomia 21
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Indicazioni Diagnosi prenatale
2. un precedente bambino con un’anomalia cromosomica “de novo”
3. la presenza di anomalie cromosomiche di tipo strutturale in uno
dei genitori
4. la presenza di una storia familiare per una malattia genetica
che puo’ essere diagnosticata o esclusa mediante analisi
biochimiche o del DNA
5. La presenza di una storia familiare per una malattia X-linked
per la quale non esiste un test prenatale specifico
6. Il rischio dei difetti del tubo neurale
7. Lo screening del siero materno ed ecografia I e II trimestre
(NT, nasal bone, CPC, EHF,SUA)
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Considerazione Importante!!!!!
Le diapositive che seguiranno trattano
aspetti non genetici: sono teniche che
attengono alla pratica medica, tuttavia mi
sembra appropriato che li conosciate.
Questo non vuol dire che siano l’aspetto
piu’ importante o esaustivo …..ANZI!!!!
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Metodi “ostetrici”per la diagnosi prenatale
Tests invasivi:
Amniocentesi
Esame dei villi coriali
Cordocentesi
Diagnostica genetica preimpianto
Tests non invasivi:
Alfa-fetoproteina nel siero materno
Screening del siero materno
Ecografia
Isolamento delle cellule fetali dal sangue materno
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AFP (alfa-fetoproteina)
E’ una glicoproteina di origine fetale prodotta principalmente nel fegato,
secreta nel circolo fetale, ed eliminata attraverso i reni nel liquido fetale
Entra nel circolo sanguigno materno attraverso la placenta, le membrane
amniotiche e la circolazione materna-fetale
Puo’ essere valutata sia nel liquido amniotico (AFAFP) che nel siero materno
(MSAFP)
La concentrazione viene valutata mediante dosaggio immunoenzimatico
(tecnica poco costosa)
Insieme all’esame ecografico a 18-19 settimane, l’esame dell’ AFAFP
permette di identificare il 99% dei feti con spina bifida e tutti quelli affetti
da anencefalia (il range di normalita’ va stabilito in relazione all’eta’
gestazionale)
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AFP (alfa-fetoproteina)
La concentrazione di AFP viene valutata nel liquido amniotico per rilevare la
eventuale presenza di difetti del tubo neurale (Spina bifida, anencefalia,
ecc.)
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Amniocentesi
E’ una procedura
mediante la quale un
campione di liquido
amniotico viene
prelevato
attraverso l’addome con
l’uso di una siringa
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Aspetti tecnici (sempre ostetrici)
dell’amniocentesi
Esame ecografico preliminare per valutare le condizioni fetali,
il periodo gestazionale, il numero di feti, la normalita’
strutturale e la posizione ottimale per l’inserimento dell’ago
Epoca: tra la 15a e la 16a settimana di gestazione
(eccezionalmente tra la 10a e la 14a)
Esecuzione: ambulatoriale
Preparazione: nessuna
Aghi: 21-22 g (0,8-0,7 mm)
Via: transaddominale
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Complicazioni:
Aumento dello 0.5-1% al di sopra del normale rischio del 2-3% di aborto
Rare perdite di liquido amniotico, infezioni e danni al feto causati dalla
puntura dell’ago
L’amniocentesi precoce (10-14 settimane) ha un rischio d’aborto del 2,6%
contro lo 0,8 dell’amniocentesi tradizionale
Per prevenire l’immunizzazione Rh della madre, viene somministrata di
routine la globulina immune Rh alle donne Rh negative
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Analisi dei villi coriali (chorionic villus sampling
o CVS)
La biopsia dei villi si effettua tra la 10a e la 12a settimana
di gestazione mediante prelievo transaddominale o
transcervicale
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Vantaggi del CVS:
Dal momento che il trofoblasto é di provenienza embrionale e
presenta il medesimo patrimonio genetico dell’embrione,
possono essere effettuate su questo materiale le medesime
indagini citogenetiche, biochimiche e sul DNA effettuate con
l’amniocentesi.
I risultati delle successive indagini sono disponibili in un’eta’
gestazionale piu’ precoce rispetto all’amniocentesi, riducendo il
periodo di incertezza e permettendo un’eventuale interruzione
di gravidanza nel primo trimestre
Fornisce l’esito dell’analisi cromosomica in un periodo di
tempo piu’ breve rispetto all’amniocentesi
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Svantaggi del CVS
L’AFP non puo’ essere valutata in questo stadio (a
differenza dell’amniocentesi) e lo screening per le anomalie del
tubo neurale deve essere effettuato mediante esame
ecografico durante la 16a settimana di gestazione
La frequenza di aborto e’ dell’1% sopra il normale rischio
del 2-5% alla 7a-12a settimana di gestazione
Il successo dell’analisi cromosomica e’ pari a quello
dell’amniocentesi (>99%). Tuttavia, il 2% dei tests eseguiti da
CVS danno risultati ambigui a causa del mosaicismo
cromosomico (sia vero che pseudomosaicismo). Quindi si
raccomanda l’esecuzione di un’amniocentesi successiva per
stabilire in maniera inequivocabile se il feto presenta
un’anomalia cromosomica.
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Cordocentesi (Funicolocentesi)
Con il termine funicolocentesi
(o cordocentesi) si intende il
prelievo di sangue fetale dal
cordone ombelicale.La
funicolocentesi viene eseguita
più tardivamente rispetto alla
villocentesi e all'amniocentesi
(dopo la 20a settimana fino al
termine della gravidanza) ed il
prelievo comporta un maggiore
rischio di aborto rispetto agli
altri tipi di prelievo. Questo
esame viene richiesto solo
quando ci sono indicazioni
specifiche.
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QUANDO SI CONSIGLIA LA FUNICOLOCENTESI
Mosaicismo cromosomico: nel caso di mosaicismo cromosomico rilevato su
liquido amniotico o villo coriale può essere necessario eseguire un esame del
cariotipo su sangue fetale, allo scopo di analizzare un tessuto diverso e
ottenere maggiori indicazioni sull'assetto cromosomico del bambino.
Malformazioni fetali evidenziate ecograficamente: le anomalie anatomiche
prendono il nome di malformazioni e colpiscono un neonato su 40. Vengono
frequentemente evidenziate intorno alla 20-22a settimana di gravidanza,
all'ecografia di secondo livello (ecografia morfologica). Alcune di queste
malformazioni possono essere conseguenza di anomalie cromosomiche e quindi
richiedere un esame del cariotipo, che può essere effettuato su liquido
amniotico o sangue fetale, a seconda dell'epoca gestazionale. Nel caso in cui la
gravidanza sia avanzata è preferibile eseguire la funicolocentesi, in quanto si
ottiene una risposta in tempo più breve rispetto all'amniocentesi.
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QUANDO SI CONSIGLIA LA FUNICOLOCENTESI
Ritardo nella crescita intrauterina: un importante ritardo della
crescita fetale è talvolta associato ad un'anomalia cromosomica e può
essere necessario un esame del cariotipo.
Diagnosi di malattie infettive: un prelievo di sangue fetale può
essere richiesto per valutare un'eventuale trasmissione di un agente
infettivo dalla madre al bambino. Oggigiorno, comunque, questo tipo di
indagini viene effettuato nella maggior parte dei casi su liquido
amniotico.
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Il prelievo di sangue fetale
La funicolocentesi non richiede alcuna preparazione ed è ambulatoriale, anche
se sono necessari uno o più controlli ecografici dopo il prelievo.La sua
esecuzione consiste nell'aspirazione, mediante un ago sottile introdotto per via
transaddominale sotto guida ecografica, di una piccola quantità (circa 0.5-2 ml)
di sangue fetale.E' consigliabile, dopo il prelievo, un periodo di riposo di 48
ore.
Funicolocentesi: un esame rischioso?
I rischi per la madre sono praticamente inesistenti, se vengono rispettate
le regole della sterilità.
Per quanto riguarda il feto, viene stimato un rischio di aborto dopo
prelievo di sangue fetale pari al 3-4%.
Il sangue fetale in laboratorio
Il sangue fetale viene raccolto in apposite provette con un terreno nutritivo
che favorisce la proliferazione delle cellule prelevate. Sono necessari circa 3
giorni per poter analizzare al microscopio le cellule fetali.
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Screening dell’AFP nel siero materno alla 16a settimana
Quando il feto presenta difetti del tubo neurale, la concentrazione
dell’AFP e’ piu’ alta rispetto ai normali livelli nel siero materno.
Questo saggio combinato con l’esame ecografico risulta molto efficace
per la diagnosi dei difetti del tubo neurale.
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Screening del siero materno(Triplo TEST o TRI-TEST)
Misura la concentrazione di tre marcatori del sangue (AFP, estriolo non
coniugato o uE3, gonadotropine corioniche o HCG) ed e’ disponibile alla
15a-20a settimana di gestazione per identificare i soggetti che presentano
un aumentato rischio per la sindrome di Down, trisomia 18 e difetti del
tubo neurale
Rischio aumentato per
sindrome di Down
Trisomia 18
NTD
By
AFP
uE3
HCG







non applicabile
non applicabile
Individua il 70% dei bambini affetti da Trisomia 21 ed ha un 5% circa di
falsi positivi, cioè di risposte allarmanti ma non veritiere. Viene definito
positivo quando il rischio stimato è superiore a una probabilità su 250. Le
pazienti positive al test (si stima circa il 10%) devono
eseguire l'amniocentesi per una diagnosi definitiva.
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Screening del siero materno(Triplo TEST o TRI-TEST)
Attenzione: questo test è scarsamente attendibile in caso di
gravidanza gemellare e diabete materno.
 L’esame MSS rappresenta un test di screening e non un mezzo
diagnostico (come l’amniocentesi)!
Il BI-TEST ha il vantaggio di poter essere eseguito più precocemente tra
la 11a e la 14a settimana di amenorrea. Il risultato dipende dalla analisi
dell'età materna rapportata al dosaggio di due ormoni: la Gonadotropina
Corionica e la Plasma Proteina Associata alla Gravidanza (PAPP-A). La
Gonadotropina Corionica aumenta in caso di malattie cromosomiche mentre
la PAPP-A diminuisce. Il test viene definito positivo quando il rischio
stimato è superiore ad una probabilità su 300.
L'ULTRASCREEN è una evoluzione del bi-test. L'associazione infatti del
bi-test con una ecografia genetica (all'epoca in cui fu proposto veniva
studiata la translucenza nucale) può aumentare la sensibilità
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L’INDAGINE ECOGRAFICA
I feti affetti da anomalie cromosomiche presentano delle
caratteristiche anatomiche particolari individuabili con una indagine
ecografica nel corso del primo trimestre di gestazione.
Nel 2001 un gruppo di ricercatori del King's College Hospital di
Londra ha proposto un ulteriore marker ecografico utile per
l'individuazione degli embrioni affetti da Sindrome di Down, lo
studio delle ossa nasali. Si è infatti scoperto che il 73% dei
bambini nati con Sindrome di Down non ha ossa nasali. Si stima
che questa indagine associata all'ultrascreen può portare la
predittività fino al 93% circa.
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L’INDAGINE ECOGRAFICA
Una di queste indagini è la valutazione della cosiddetta TRANSLUCENZA NUCALE. Si è visto
in effetti che molti embrioni affetti da anomalie cromosomiche hanno, per ragioni ancora non
completamente conosciute, un accumulo transitorio di liquido negli strati sottocutanei della
regione retronucale del collo nel periodo tra 10 e 14 settimane. Se lo spessore di questa zona
supera i 3 mm si ha una probabilità di anomalie cromosomiche pari al 75% con un 5% di falsi
positivi. In questi casi è consigliabile procedere quindi subito ad una biopsia dei villi coriali e se
questa è negativa è consigliabile comunque ripetere un accurata osservazione del feto mediante
un'ecografia di II livello tra la 20a e la 22a settimana, in 1 caso su 20 infatti possono essere
presenti altre malformazioni, soprattutto cardiache.
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Tecnologie emergenti
Diagnosi genetica preimpianto (PGD)
si effettua la biopsia di
un blastomero dopo IVF.
Il trasferimento degli
embrioni sani e’
effettuato dopo analisi
molecolari e/o
cromosomiche. Non
esiste attualmente
alcuna evidenza di danni
negli embrioni sottoposti
a biopsia.
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Diagnosi genetica preimpianto (PGD)
Nel caso di malattie monogeniche si applica l’analisi molecolare mediante PCR,
mentre per le anomalie cromosomiche si utilizza la FISH in interfase dopo fissazione
su vetrino di uno o piu’ blastomeri.
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Cellule fetali nel
sangue materno
In ogni gravidanza sono
presenti cellule fetali
(linfociti, cellule
trofoblastiche,
eritrociti) nel sangue
materno (1 su 103-107).
Queste possono essere
arricchite mediante
MACS ed utilizzate per
la FISH con speciali
sonde di DNA per il
cromosoma 13, 18 e 21,
X e Y. Queste tecniche
pero’ non sono ancora
applicabili nella pratica
clinica e devono, per il
momento, essere
considerate delle
tecniche sperimentali.
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Test di laboratorio
Analisi citogenetica
Analisi del DNA
teoricamente saggi biochimici per la diagnosi di malattie
metaboliche (dosaggi enzimatici su liquido amniotico o
direttamente su villi coriali)
questi ci riguardano quando si
parla di diagnosi prenatale di
malattie genetiche!!!!!
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Il liquido amniotico
Il liquido amniotico contiene cellule di origine fetale che possono essere messe in
coltura per i successivi tests diagnostici.
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Analisi citogenetica
Sia l’amniocentesi che il CVS forniscono cellule fetali
per l’analisi del cariotipo.
La preparazione e successiva analisi dei cromosomi puo’
richiedere da 1 a 2 settimane.
Si possono, in alternativa, usare nuclei interfasici da
cellule fetali non coltivate per diagnosticare le comuni
aneuploidie dei cromosomi 13, 18, 21, X ed Y immediatamente
dopo amniocentesi o CVS. Questo rapido test citogenetico
deve essere ancora realmente valutato come metodo
diagnostico da utilizzare di routine.
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METODICA D’INDAGINE
in situ
Il liquido amniotico viene centrifugato per la raccolta delle
cellule che sono risospese in opportuno terreno e poste in
coltura. Le cellule possono essere coltivate con due metodiche:
 in situ:. Essa avviene per colonie, presupponendo che ciascuna di esse
derivi da una singola cellula fetale. Tale tecnica permette una migliore
valutazione diagnostica in caso di mosaicismo cromosomico o di
contaminazione materna. I tempi di coltura sono piu’ brevi rispetto al
metodo dopo sospensione.
A crescita avvenuta, le colonie cellulari vengono trattate con colchicina.
Segue shock osmotico, fissaggio, colorazione e bandeggio per l’analisi delle
metafasi al microscopio
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Metodica d’indagine
sospensione mediante enzimi proteolitici
Dopo alcuni giorni di crescita, si rispospendono le cellule nella fiasca di
coltura mediante l’utilizzo di tripsina, si fanno riaderire e si prosegue la
coltura.
A crescita ultimata, si esegue il trattamento con colchicina, shock
osmotico, fissaggio, colorazione e bandeggio.
Questa tecnica permette di ottenere una maggiore crescita cellulare,
ma viene persa l’individualita’ dei cloni e quindi l’origine (singola o
multipla)
di eventuali mosaicismi.
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Villi coriali
coltura
I villi sono posti in coltura
previo trattamento con enzimi
proteolitici per disgregare le cellule
del cito e del sinciziotrofoblasto.
 A crescita avvenuta, si procede
al trattamento con colchicina, cui
segue shock osmotico, fissaggio dei
preparati su vetrino e analisi delle
metafase dopo colorazione.
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Villi coriali
mitosi spontanee
Si sfruttano le mitosi spontanee delle cellule del trofoblasto.
Si procede alla selezione dei villi idonei,eliminando eventuale sangue o
decidua aspirati durante il prelievo;
I villi vengono messi in coltura per 24-48 h a cui viene poi aggiunta
colchicina
Si effettua o shock osmotico con soluzione ipotonica per rompere le
membrane cellulari
Si esegue il fissaggio, e lo striscio del preparato sul vetrino
Colorazione ed analisi del cariotipo
 Vantaggi: tempi rapidissimi, minor inquinamento da cellule materne,
costi piu’ bassi
 Svantaggi: l’attivita’ mitotica e la qualita’ delle metafasi sono
inferiori al metodo della coltura.
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Sangue fetale
Si effettua la messa in
coltura del sangue per
72h. Dopo l’aggiunta di
colchicina,
centrifugazione,
trattamento con sol.
ipotonica (KCl),
fissaggio in soluzione,
preparazione del
vetrino e colorazione
per l’analisi del
cariotipo.
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Tecniche di bandeggio cromosomico
Permettono di identificare in maniera univoca una coppia di omologhi
Le tecniche di bandeggio sono varie:
Bande Q. Si utilizza un colorante fluorescente (quinacrina). Un
pattern
di bandeggio simile si può ottenere con il DAPI.
Bande G. Si trattano i cromosomi con enzimi proteolitici (tripsina)
oppure con alcali o con soluzioni a elevato pH. Quindi si colorano con
Giemsa. Le bande G corrispondono in larga misura alle bande Q.
Bande R. Si trattano i cromosomi con temperature elevate (87°C) e
si
colorano con Giemsa o acridina orange.
Le bande che si ottengono sono complementari alle bande G.
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Tecniche di bandeggio cromosomico
Bandeggio Q
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Bandeggio G
Bandeggio R
MOSAICISMO
Si riferisce alla presenza di due o piu’ linee cellulari in
un campione o tessuto.Si distinguono tre livelli di mosaicismo
nel liquido amniotico o nelle colture CVS:
MOSAICISMO VERO (elevato rischio di anomalie fetali)
MOSAICISMO CONFINATO ALLA PLACENTA (chorion,
amnion)
PSEUDOMOSAICISMO (una singola cellula anomala): viene
ignorato
La grande maggioranza dei mosaicismi in diagnosi prenatale non
si correla ad anomalie fenotipiche fetali
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problemi dell’analisi cromosomica prenatale:
Fallimento della coltura cellulare (rischio basso) Situazioni avverse inattese
riarrangiamento
cromosoma marker
de novo??
Analisi del cariotipo dei genitori
1. Genitori non portatori :“de novo”
2. Un genitore (sano) portatore di un riarr.bilanciato
Stesso riarrangiamento nel
feto
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Feto sano?
Riarrangiamento sbilanciato nel feto
Gravi anomalie fetali