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R ELA Z I O N E S CI EN T I F I CA
2011
Disposizione del lisozima (verde) e degli AGE (rosso) in cellule HK2
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IN FO R M A Z IO N I GEN ER A LI
L’attività di ricerca riportata nella presente relazione è stata svolta nei laboratori della Fondazione
Callerio Onlus e nell’ambito delle collaborazioni esistenti con ricercatori di altri Enti e di Atenei italiani
e stranieri nel periodo 1 gennaio 2011 – 31 dicembre 2011.
Oltre ai ricercatori dipendenti, al tecnico di laboratorio ed al personale amministrativo, nel 2011 la
Fondazione Callerio Onlus ha potuto contare su giovani laureati, per i quali ha investito risorse per
sostenere la loro formazione nella ricerca e favorendo la loro partecipazione a corsi di dottorato,
attivati in diversi atenei italiani. Globalmente sono state investite risorse per 9,5 anni/uomo (1
anno/uomo= 11 mesi; il Direttore Scientifico è escluso dal computo). Nel dettaglio, sono intervenuti, in
aggiunta al tecnico di laboratorio ed ai 2 ricercatori in servizio permanente, 4 ricercatori, inseriti nelle
attività ricerca programmate e svolte attraverso lo strumento del dottorato di ricerca o dell’assegno
post-dottorato. A questi si sono aggiunti 4 studenti interni dell’Università di Trieste che hanno
contribuito agli studi con il proprio lavoro per la preparazione della tesi di laurea, ed 1 dottorando
dell’Università di Lubiana (Slovenia) che ha trascorso 3 mesi nei laboratori della Fondazione Callerio.
Composizione del gruppo di ricerca
Prof. Gianni Sava
Direttore Scientifico
Dott. Moreno Cocchietto Biologo, ricercatore
Dott. Alberta Bergamo
Chimico e Tecnologo Farmaceutico, ricercatore
Dr. Chiara Pelillo
Biotecnologa, Assegnista di ricerca
Dr. Vania Vidimar
Chimico e Tecnologo Farmaceutico, dottoranda
Dr. Davide Gallo
Chimico e Tecnologo Farmaceutico, dottorando
Dr. Marianna Lucafò
Biologa, dottoranda
Ms. Selena Maggio
Studente di Farmacia, interno tesista
Ms. Giulia Mazzocato
Studente di Chimica e Tecnologia Farmaceutiche, interno tesista
Ms. Chiara Moro
Studente di Chimica e Tecnologia Farmaceutiche, interno tesista
Ms. Nina Fiorido
Studente di Chimica e Tecnologia Farmaceutiche, interno tesista
Ms. Rosana Hudej
Biologa, Dottoranda in Chimica Inorganica nell’Università di Lubiana
Sig. M. Zabucchi
Diploma maturità scientifica ad indirizzo sanitario, tecnico di laboratorio
La sottolineatura indica le persone con contratto a tempo indeterminato.
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R ICER CA S CIEN TIFICA
Temi di Ricerca della Fondazione Callerio
1. Coordinamento del WG003 del programma COST D39
La Fondazione Callerio è stata la sede principale del Working Group 003 dell’Azione COST D39, un
progetto di cooperazione europea nel campo dei farmaci basati sui metalli per la terapia dei tumori. Il
WG3 si è occupato del tema “New Targets for Metal-Based Drugs: Beyond DNA” ed è stato
coordinato dal prof. G. Sava. Al WG3 hanno partecipato altri 6 laboratori, rispettivamente
nell’Università di Sassari (prof. G. Pintus), nell’Università di Sheffield (prof. N. Bird), nell’Università di
Francoforte (prof. J. Eble), nell’Università di Valencia (prof. J. Estrela), nell’Istituto Nazionale di
Biologia di Lubiana (prof. T. Lah) e nel Centro Olandese del Cancro (prof. J. Schellens).
L’attività principale è stata quella di promuovere e coordinare ricerche per identificare target diversi
dal DNA per “costruire” nuovi farmaci basati sui metalli, più potenti e più selettivi rispetto quelli
tradizionalmente basati sul platino e di corrente uso clinico.
Nel corso del 2011 l’Azione COST D39 è giunta alla sua conclusione, i principali risultati ottenuti
durante l’intero svolgimento di essa sono stati presentati dai ricercatori di tutti i WG coinvolti, incluso
quello capitanato della Fondazione Callerio, al “Final Whole Action Meeting” svoltosi presso il Royal
College of Surgeons in Ireland, a Dublino il 5 e 6 luglio 2011.
Attualmente è in corso la preparazione di una nuova Azione Cost, cui la Fondazione Callerio sta
attivamente partecipando con la dott. Alberta Bergamo.
2. Identificazione di molecole di adesione coinvolte nella fase di metastatizzazione del
cancro colorettale nel tessuto epatico e possibili target molecolari per lo sviluppo di
nuovi farmaci antitumorali
Il progetto prevede l’identificazione di molecole di adesione cruciali per la metastatizzazione del
cancro al colon nel tessuto epatico per lo sviluppo di nuovi trattamenti farmacologici antitumorali.
In questa parte iniziale del progetto, lo studio è focalizzato a determinare il ruolo delle integrine nella
progressione del tumore nella fase d meta statizzazione con l’obiettivo di identificare quelle che tra
tutte risultano coinvolte nella migrazione e invasione delle cellule tumorali nel tessuto epatico per poi
approfondire la pathway molecolare attraverso cui le integrine d’interesse intervengono e identificare
altri target molecolari coinvolti nel processo di metastatizzazione.
3. METAPLATE: messa a punto di un prototipo per lo studio simulato del processo
della crescita e disseminazione tumorale per l’impiego nella selezione di farmaci
antitumorali innovativi.
Lo scopo della presente ricerca è quello di sviluppare un dispositivo biotecnologico capace di mimare
le condizioni fisiologiche proprie di un organismo vivente. In particolare il nostro interesse è rivolto
all’utilizzo di tale dispositivo in un ambito applicativo in oncologia.
Il primo e principale risultato atteso dalla ricerca proposta è la realizzazione di un dispositivo
biotecnologico specificamente progettato per l’analisi dall’attività anti-metastatica di farmaci nel
modello del carcinoma colorettale. Il dispositivo prodotto verrà brevettato e potrà essere oggetto di
commercializzazione come modello di studio per la valutazione dell’attività anti-metastatica dei
farmaci ‘biologici’ che oggi fanno parte degli obiettivi prioritari della ricerca farmacologia nel campo
dei tumori.
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4. Sviluppo di sistemi di oral delivery per peptidi antimicrobici per il trattamento di
infezioni da Salmonella enterica
Obiettivo del progetto è quello di ottimizzare l’applicazione terapeutica di peptidi antimicrobici in
termini di proprietà farmacocinetiche, mediante l’impiego di sistemi di nano e microincapsulazione per
il rilascio controllato di questi peptidi al fine di proporli come valida ed efficace alternativa ai comuni
agenti antibatterici per trattamenti orali e non solo per infezioni esclusivamente topiche.
La nostra attenzione è rivolta a un peptide di origine animale già testato in vivo per il trattamento di
infezioni da S. enterica. Scopo di questa prima fase di studio è quello di produrre diversi sistemi di
oral delivery per questo peptide, testarne le proprietà di release e durata in condizioni fisiologiche e
confermarne le proprietà antibatteriche mediante saggi in vitro. Successivamente si procederà alla
convalida del sistema oral delivary-peptide in vivo.
5. Sviluppo e validazione di vettori orali di vaccini per la pescicoltura del Friuli Venezia
Giulia
Il Progetto di Ricerca biennale è nato dall’impegno congiunto della Fondazione Callerio Onlus di
Trieste che lo ha proposto e lo coordina, di ricercatori dei Dipartimenti di Scienze della Vita e di
Scienze Farmaceutiche dell’Università degli Studi di Trieste e del Dipartimento di Scienze Animali
dell’Università degli Studi di Udine, grazie al supporto finanziario della LR 26/2005.
Obiettivo generale del Progetto è l’ingegnerizzazione e lo studio di sistemi orali di nuova generazione,
sviluppati grazie a micro- e nano-tecnologie, per utilizzi in campo vaccinale applicabili a livello
regionale nel comparto della pescicoltura in generale e della troticoltura in particolare. Tali sistemi
sono stati sviluppati con formulazioni e processi produttivi in un’ottica di rispetto del benessere
animale, dell’ambiente e del consumatore.
Nel periodo gennaio 2011 – 22 marzo 2011 e stata compilata la Relazione Scientifica attestante il
raggiungimento degli obiettivi di impatto sistemico di cui all’Articolo 7, Comma 1, Lettera A del
Regolamento del Progetto “Vettori orali di vaccini per la pescicoltura del Friuli Venezia Giulia”,
Strumento di Finanziamento: LR 26/2005, Art. 23 – DPReg 4 maggio 2007. La Relazione Scientifica è
stata ufficialmente consegnata all’Ufficio Regionale competente della Direzione Centrale Lavoro,
Formazione, Università e Ricerca in Via S. Francesco 37 in data 7 aprile 2011. Il rendiconto
finanziario è stato consegnato in data 26 maggio 2011.
6. Innovazione filiera trota iridea regionale per il miglioramento della qualità e per il
riconoscimento della tipicità di prodotto; acronimo: I.R.IDEA
Il progetto I.R.IDEA, al quale la Fondazione Callerio partecipa ed il quale è coordinato e diretto
all’Università di Udine, intende perseguire in maniera integrata i seguenti obiettivi:
1. Messa a punto di piani alimentari e modalità di razionamento per la troticoltura regionale in grado
di: assicurare elevata qualità nutrizionale (omega 3) ed organolettiche alle parti eduli sia sul fresco
che su prodotti trasformati innovativi di 2/3°tipo; migliorare la morfometria (appearence) e le rese
commerciali in parti eduli alla trasformazione; ridurre l’impatto ambientale dell’allevamento per il
minore rilascio di cataboliti organici; migliorare le proprietà organolettiche-sensoriali.
2. Promuovere la diffusione di gestione con basso impatto ambientale, attraverso la proposta e la
valutazione di metodi di abbattimento innovativo dei reflui rispetto ai metodi originali.
3. Promuovere lo sviluppo e la diffusione di procedure di gestione tecnica degli impianti che
assicurino il benessere animale, limitino la diffusione di malattie infettive, l’uso di farmaci, anche
attraverso l’uso di vaccini innovativi;
4. Individuare metodiche, indici, protocolli gestionali ed alimentari atti a meglio caratterizzare e
preservare il prodotto trota sotto il profilo degli attributi nutrizionali, microbiologici e di
tracciabilità/rintracciabilità, in funzione di variabili alimentari-ambientali, per meglio corrispondere alle
attese del consumo in termini di qualità del prodotto. Individuare e proporre metodi innovativi di
lavorazione delle carni di trota finalizzati all'estensione della shelf-life.
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5. Individuare dei parametri innovativi, oggettivi e documentabili, di produzione e di qualità che
caratterizzano la produzione della trota iridea regionale, per la definizione di una certificazione di
filiera della Trota iridea del Friuli Venezia Giulia.
6. Attuare una analisi della domanda attuale e potenziale della ristorazione collettiva, (scolastica);
individuare limiti e opportunità; definire meccanismi necessari per l’attuazione di filiere corte
produzione-ristorazione; somministrazione sperimentale di prodotti innovativi in alcune mense e
valutazione del gradimento da parte di consumatori e operatori della mensa.
7. Svolgere una efficace azione di divulgazione e disseminazione dei risultati del progetto nei
confronti degli allevatori, dei consumatori e delle istituzioni del Friuli Venezia Giulia, al fine di
valorizzare e promuovere un importante prodotto dell’acquacoltura del territorio.
Nel contesto del progetto la Fondazione Callerio ha l’obiettivo di migliorare il sistema vaccinale orale
(SVO) attraverso:
• Opportune implementazioni per venire incontro alle specifiche esigenze del Progetto IRIDEA.
• Ingegnerizzazione con formulazioni costituite da polisaccaridi e proteine completamente
naturali, già utilizzate nell’industria alimentare, per ottenere un prodotto “verde”, nel rispetto
del consumatore e dell’ambiente.
• Adattamento del preparato in base all’effettiva fisiologia digestiva della trota iridea, per poter
agire nell’intestino “quando e dove serve”.
• Predisposizione del preparato in modo da poter essere facilmente incorporabile e pellettabile
con i mangimi, senza alterarne l’appetibilità.
• Preparazione di SVO per i richiami vaccinali (singoli o multipli).
7. Studio degli eventi molecolari responsabili degli effetti nefroprotettivi del lisozima
nel contesto del diabete
Lo scopo della presente ricerca è fornire un contributo nella comprensione dei meccanismi molecolari
implicati nell’attività di prevenzione della nefropatia diabetica e valutare i meccanismi farmacocinetici
alla base di quanto finora riscontrato a livello sistemico dopo somministrazione orale del lisozima
microincapsulato in un modello preclinico.
Obiettivo della ricerca consiste nell’identificazione di una linea cellulare e di un marker molecolare
adatto. In questa fase del progetto, l’attenzione è stata focalizzata nei confronti della citotossicità degli
AGE, all’espressione del recettore per gli AGE (RAGE), alla produzione di specie reattive
dell’ossigeno (ROS) e ai livelli dell’interleuchina-6 (IL-6).
8. Nanostrutture di carbonio come vettori per farmaci antitumorali
Il progetto prevede lo studio di nuove nanostrutture di carbonio, quali fullereni, il cui impiego in campo
biomedico è di forte interesse grazie alla possibilità di essere funzionalizzati agendo come sistemi di
drug delivery per il trasporto di farmaci.
Il primo obiettivo che la ricerca si propone è di valutare il comportamento di fullereni, funzionalizzati in
maniera differente, nei confronti di più modelli sperimentali in vitro, allo scopo non solo di identificare
un potenziale veicolo per farmaci ma anche per comprendere i possibili target e meccanismi
molecolari che possono innescarsi in seguito all’interazione dei fullereni con un sistema cellulare.
Il secondo obiettivo prevede lo studio dei fullereni coniugati ad un farmaco antitumorale modello come
la doxorubicina al fine di analizzare l’attività e l’uptake del farmaco in seguito al legame con il carrier.
Collaborazioni in atto
Le attività di ricerca svolte nel corso del 2011 sono state condotte anche attraverso collaborazioni
attivate e/o mantenute con ricercatori di vari Enti italiani e stranieri.
- Ricercatori di Atenei Italiani:
Dall’Università di Trieste (Dipartimento di Scienze Chimiche, prof. Enzo Alessio; Dipartimento di
Scienze Farmaceutiche, prof. D. Voinovich, dr. F. Serdoz, dr. B. Perissutti, dr. T. Gianferrara, dr T.
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Da Ros, prof. M. Prato; Dipartimento di Scienze della Vita, prof. A. Cesàro, dr. M. Borgogna, dr. B.
Bellich, dr. S. Pacor, prof. S. Zorzet, dr. A. Pallavicini, prof. R. Gennaro, dr M. Scocchi, dr M.
Benincasa, dr. R. Bulla, dr. C. De Agostinis, dr. Gabriele Baj; Dipartimento di Chimica dei Materiali
e delle Risorse Naturali, prof. O. Sbaizero, dr S. Maggiolino, dr. B. Codan; Dipartimento
Universitario Clinico di Scienze Mediche, Tecnologiche e Traslazionali, prof. B. Fabris).
Dall’Università di Udine (Dipartimento di Scienze Animali, prof. Galeotti, dr. D. Volpatti, dr. B.
Contessi, dr. R. Ballestrazzi, dr. D. Bassignana; Dipartimento di Scienze degli Alimenti, prof. M.C.
Nicoli).
Dall’Università di Perugia (Dipartimento di Chimica e Tecnologia del Farmaco, dr. P. Blasi, dr. S.
Giovagnoli)
Dall’Università di Bologna (Dipartimento di Scienze Farmaceutiche, dr. G. Calogerà).
- Ricercatori di Istituti Zooprofilattici
Istituto Zooprofilattico dell’Abruzzo e del Molise “G. Caporale”, Teramo (prof. G. Giorgetti, dr. A.
Paolini, dr. D. Zezza, dr. V. Ridolfi).
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta, Torino (prof. M. Prearo).
- Ricercatori di altri Enti
Centro Diabete A.S.S. 1 Triestina, Trieste (dr. R. Candido).
Laboratorio SISSI, Sincrotone, Trieste (dr. L. Vaccari).
- Ricercatori di Atenei stranieri
Institut de Chimie Moleculaire et Biologique, Laboratoire de Chemie Organometallique EPFL-BCH,
Lausanne (prof. P. Dyson).
Bioanorganische Chemie, Ruhr-Universität Bochum (prof. N. Metzler-Nolte):
Department of Vascular Matrix Biology, Frankfurt University Hospital (prof. J.A. Eble).
INSERM U692 – Université de Strasbourg (dr. C. Gaiddon).
Fachbereich Chemie, Philipps Universität Marburg (prof. E. Meggers).
- Aziende
IMA S.p.A. Via I Maggio Ozzano 40010 (Bologna).
Sintesi dei risultati
I risultati di seguito sintetizzati si riferiscono alle ricerche svolte nei laboratori della Fondazione
Callerio Onlus e/o nei laboratori di ricercatori di altri Enti con i quali esistono collaborazioni e che
riguardano i temi di ricerca prioritari che la Fondazione Callerio Onlus ha attivato per l’anno 2011.
a) Attività di ricerca di LINFA (http://www.callerio.org/Linfa_i.htm)
L’attività di ricerca scientifica svolta in LINFA nel periodo 01 gennaio – 31 dicembre 2011 ha
riguardato i temi di seguito riportati.
a1) Complessi di coordinazione di rutenio(II) half sandwich.
Lo studio cominciato nel 2010 è stato terminato nell’anno in corso; i risultati conseguiti hanno permesso la
stesura di una tesi di laurea. I composti esaminati sono complessi di coordinazione di rutenio(II) halfsandwich, analoghi di organometallici del tipo [Ru(η6-arene)(en)Cl][PF6] e [Ru(η6-toluene)Cl2(PTA)], due
composti che hanno dimostrato interessanti proprietà antitumorali. Rispetto questi ultimi, l’arene è stato
sostituito sia da un ligando neutro face-capping, come i macrocicli 1,4,7-tritiaciclononano e 1,4,7triazaciclononano, sia da tre ligandi monodentati (dmso-S), che formano un frammento stabile facRu(dmso)3. L’idea che ha guidato la sintesi di questi derivati è stata quella di valutare come la natura del
ligando face-capping influenza l’attività di tali complessi. Questi derivati sono stati valutati in un modello di
studio pensato ed allestito appositamente per riuscire ad evidenziare in vitro la potenziale attività
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antimetastatica che un qualsivoglia composto potrebbe avere in vivo. Il modello si basa su una serie di
esperimenti che simulano le tappe del processo metastatico, quali il distacco della cellula tumorale dal
tumore primario, la migrazione, l’invasione, e la riadesione ad un sito secondario di crescita ricreando le
condizioni ideali per poter stabilire una relazione di continuità con quanto accade in un organismo vivente.
Tale modello è già stato applicato allo studio di un certo numero di derivati metallici e si è rivelato un mezzo
valido allo scopo. Infatti, i composti che interferivano con i processi di de-adesione, migrazione/invasione e
di riadesione sono stati poi capaci di inibire la crescita delle metastasi in vivo in un modello sperimentale
murino. I risultati ottenuti da questa ricerca dimostrano chiaramente che i complessi sono dotati di scarsa
capacità di interferire con i meccanismi di crescita delle cellule tumorali, rendendoli poco attraenti come
citotossici. Studiando dettagliatamente il loro comportamento nei singoli esperimenti che simulano le tappe
della metastatizzazione troviamo, in generale, risultati piuttosto deludenti. Infatti, nel test di de-adesione,
nella migrazione e nell’esperimento di ri-adesione delle cellule tumorali ad un nuovo substrato di crescita i
complessi studiati mostrano attività scarsa o assente, indipendentemente dagli schemi sperimentali
utilizzati. Dai dati ottenuti e, per confronto con i dati di letteratura, possiamo concludere che la sostituzione
dell’arene con i frammenti macrociclici caratterizzanti questa serie di composti, non conferisce proprietà
vantaggiose.
a2) Complessi di rutenio “organometallici” con fenantroline.
RDC11 è un composto organometallico di rutenio(II) che si è dimostrato più efficace del cisplatino nel
ridurre la crescita di diversi tipi di tumori (singenici o xenotrapianti) nei topi, causando ridotti effetti
collaterali rispetto al ciplatino stesso. Lo studio del meccanismo d’azione molecolare di RDC11 ha
mostrato come questo composto interagisca solo debolmente con il DNA causando danni limitati
rispetto al cisplatino, suggerendo, di conseguenza, vie di trasduzione alternative.
Grazie alla tecnologia del DNA microarray è stato possibile osservare come RDC11 sia in grado di
influenzare l’espressione di geni coinvolti nella regolazione di due vie di segnalazione particolarmente
rilevanti per lo sviluppo e la crescita dei tumori: la via di HIF-1 (Hypoxia Inducible Factor 1) e la via di
mTOR (mammalian target of rapamycin). Entrambe queste proteine sono frequentemente
sovraespresse nei tumori solidi e metastatici e sono spesso indice di aggressività e fallimento
terapeutico.
Analisi di western blot hanno dimostrato, come, contrariamente al cisplatino, RDC11 sia capace di
ridurre i livelli di espressione delle proteine HIF-1α e HIF-1β, i due monomeri che costituiscono la
proteina HIF-1, in due linee cellulari di adenocarcinoma colorettale (HCT116 e SW480) sia in
condizione di normossia (20% ossigeno) che ipossia (1%). NORMOXIA
HYPOXIA
6h
RDC11
Cisp
-
24h
+
+
-
-
+
6h
+
-
-
+
24h
+
-
-
+
+
-
HIF-1!
HIF-1"
Actin
HCT116
NORMOXIA
6h
RDC11
Cisp
-
+
HYPOXIA
24h
+
-
-
+
6h
+
-
-
+
24h
+
-
-
+
+
HIF-1!
HIF-1"
Actin
SW480
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Questi risultati ci hanno spinto ad indagare se RDC11 fosse in grado di influenzare l’espressione di
alcuni dei più importanti geni target di HIF-1α, implicati nella regolazione di processi quali
angiogenesi e metabolismo energetico. I nostri risultati indicano come RDC11 sia capace di ridurre i
livelli di mRNA di VEGF (principale regolatore del processo angiogenico) e di GLUT-1 ed ENO-1,
implicati nel metabolismo del glucosio (principale fonte energetica in condizione ipossiche), in
maniera più pronunciata rispetto al cisplatino. (***=p<0.001; **=p<0.01; *=p<0.05 vs rispettivo
controllo. One-way ANOVA+Tukey post-test).
Inoltre, abbiamo potuto osservare come la riduzione dei livelli proteici di HIF-1α, in seguito a
trattamento con RDC11, sia dovuta principalmente ad un effetto di RDC11 a livello trascrizionale
(RDC11 riduce l’mRNA di HIF-1α), piuttosto che a livello post-traduzionale. Abbiamo osservato,
infatti, come RDC11 sia solo in parte capace di indurre la degradazione via proteasoma della proteina
HIF-1α in seguito al blocco di quest’ultimo con l’inibitore MG132. Anche altre vie di degradazione
delle proteine, mediate da calpaine, catepsine e caspasi, sono state escluse in quanto non implicate
nella riduzione dei livelli di HIF-1α in seguito a trattamento con RDC11 ed inibitori delle stesse (non
riportato).
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(***=p<0.001; **=p<0.01; *=p<0.05 vs rispettivo controllo. One-way ANOVA+Tukey post-test).
RDC11 è anche in grado di ridurre l’attività di mTOR ed in particolare dei suoi effettori a valle, ovvero,
la proteina ribosomale S6 chinasi (S6K) e AKT. mTOR è un complesso costituito da due componenti:
mTORC1 ed mTORC2. mTORC1 controlla la proliferazione e sopravvivenza cellulare attraverso la
regolazione della traduzione delle proteine, del metabolismo e dell’autofagia ed il suo principale
effettore è la proteina S6 chinasi (S6K) che a sua volta fosforila e attiva la proteina S6, responsabile
della sintesi di HIF-1α. mTORC2, invece, controlla la crescita cellulare l’organizzazione del
citoscheletro attraverso l’attivazione, mediante fosforilazione, di AKT. Abbiamo osservato come
RDC11 riduca, sia l’espressione della proteina S6-P, contrariamente al cisplatino, sia l’espressione
della proteina AKT fosforilata (AKT-P), una delle più frequenti alterazioni nella maggior parte dei
tumori, lasciando pressoché inalterate le forme non fosforilate di entrambe le proteine.
NORMOXIA
HYPOXIA
6h
RDC11
Cisp
-
+
24h
+
-
-
+
6h
+
-
-
+
+
+
-
S6
Actin
-
S6-P
24h
+
-
SW480
RDC11
Rap
-
+
-
+
+
+
AKT-P
AKT
Actin
Dal momento che RDC11 si è dimostrato capace di ridurre gli effetti sia della via di HIF-1α che
mTOR, abbiamo voluto testare in vivo l’efficacia di RDC11 assieme alla rapamicina, uno dei più noti
inibitori della via mTOR. Effettivamente, abbiamo osservato come, alla fine del trattamento, la combinazione di RDC11 e rapamicina fosse più efficace nel ridurre il volume tumorale rispetto ad RDC11 da solo. (n=10; *=p<0.01 vs control; One-way ANOVA+Tukey post-test).
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Questi risultati forniscono nuove informazioni sul meccanismo d’azione del derivato di rutenio RDC11.
L’attività antitumorale di RDC11 sembra non essere dovuta all’interazione con il DNA, ma
all’inibizione di due vie di segnalazione (HIF-1α ed mTOR) che regolano la crescita e la proliferazione
tumorale. Ad oggi, non vi sono evidenze in letteratura circa altri organometallici capaci di interferire
con queste due vie. (articolo in preparazione).
a3) Identificazione di nuovi target tra le molecole di adesione nella fase di metastatizzazione
del cancro al colon nel tessuto epatico: valutazione del ruolo delle integrine.
Scopo del progetto di ricerca è quello di identificare nuovi target molecolari nella fase di
metastatizzazione del cancro al colon nel tessuto epatico per poter in seguito sviluppare nuovi
farmaci antitumorali che possano inibire la progressione del tumore. Le molecole di adesione
risultano i fattori principalmente coinvolti
E’ stato analizzato il profilo integrinico delle HCT-116 e come esso varia in presenza di fattori solubili
rilasciati dalle cellule del tessuto epatico IHH nel loro terreno di crescita delle HCT-116, nel loro
terreno di crescita e nel terreno condizionato dalle IHH
A)
B)
Fig.1 Profilo integrinico HCT-116 nel loro terreno di coltura (barra grigia), nel terreno delle IHH (barra bianca) e
nel terreno condizionato dalle IHH (barra nera). I dati sono rappresentativi di tre esperimenti differenti ripetuti in
duplicato. Analisi statistica mediante il test della varianza Tukey-Kramer (*) p<0,05; (**) p>0,01; (***) p<0,01.
Per approfondire i dati ottenuti dall’analisi del profilo integrinico delle HCT-116 e identificare le
integrine la cui espressione varia in presenza di terreno ricco di fattori rilasciati dalle IHH, sono stati
condotti saggi di adesione cellulare su diversi componenti della matrice extracellulare (fibronectina,
collagene I, collagene IV e laminina).
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Fig.2 Adesione HCT-116 in diverse condizioni di terreno, su componenti dell’ECM: tra le diverse componenti
testate fibronectina e collagene I risultano quelle “privilegiate” dalle HCT-116
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Valutando i risultati ottenuti dai saggi precedenti sono state identificate le integrine alfa5beta1,
alfa1beta1 e alfa3beta1 i cui livelli di espressione variavano significativamente a seconda della
condizione in cui erano tenute le cellule e che risultano principalmente coinvolte nell’adesione delle
HCT-116 alla fibronectina, collagene I e laminina, substrati a cui le cellule risultano preferenzialmente
legate soprattutto quando si trovano nel terreno condizionato dalle IHH.
Per verificare il ruolo delle integrine alfa5beta1 e alfa1beta1 nell’adesione delle HCT-116 alle
componenti dell’ECM, si è deciso di ripetere i saggi di adesione utilizzando anticorpi monoclonali che
riconoscano specificamente queste due integrine.
Dai risultati finora ottenuti, in presenza dell’anticorpo anti alfa5beta1 l’adesione delle HCT-116 è
significativamente inibita. Ciò conferma il ruolo predominante dell’integrina alfa5beta1 nell’interazione
delle HCT-116 con la fibronectina.
In presenza dell’anticorpo anti alfa1 invece l’adesione delle HCT-116 al collagene di tipo I è inibita
solo in parte suggerendo la compartecipazione di altre integrine in questa interazione quale ad
esempio l’integrina alfa2beta1 come descritto in letteratura.
Gli esperimenti attualmente in corso consentiranno di vedere se questi risultati variano quando le
HCT-116 si trovano in terreno condizionato dalle IHH. In parallelo si stanno conducendo analisi al
citofluorimetro per capire se l’aumentata adesione delle cellule alla fibronectina e al collagene I sia
dovuta ad un modulazione dell’espressione rispettivamente delle integrine alfa5beta1 e alfa1beta1 a
livello di traslocazione sulla membrana, traduzione o trascrizione di queste proteine.
a4) “The plastic mouse”
Dopo aver sostituito la linea cellulare di carcinoma colon rettale HT-29 con le HCT-116 e aver
verificato le capacità migratorie e di invasione di queste ultime con saggi funzionali, si è proceduto
con le prove di migrazione e di invasione delle cellule tumorali dal sito primario (cellule dell’epitelio
colon rettale) al sito secondario (cellule epatiche) utilizzando il secondo prototipo di plastic mouse
sempre realizzato dai ricercatori del gruppo del prof. Sbaizero del Dipartimento di Chimica dei
Materiali e delle Risorse Naturali. Le prove, che hanno attualmente lo scopo di ottimizzare il modello
prototipo per poi passare alla realizzazione del modello di plastic mouse finale, sono tuttora in fase di
svolgimento.
b) Microincapsulazione di principi attivi per uso farmacologico
b1) Sviluppo e validazione di vettori orali di vaccini per la pescicoltura del Friuli Venezia
Giulia.
I Sistemi Vaccinali Orali (SVO): composizione e produzione.
Nel corso dei 2 anni di Progetto sono stati studiati e sottoposti alle validazioni di laboratorio degli
originali ed avanzati Sistemi Vaccinali Orali (SVO) su micro-scala (SVO-1), nano-scala (SVO-2) e, a
livello preliminare, chimerici (microsistemi contenenti nanosistemi, denominati SVO-3). SVO-1 ed
SVO-2 sono stati, successivamente, validati sul campo.
SVO-1 è stato prodotto, partendo dai polimeri naturali alginato, chitosano ed
idrossipropilmetilcellulosa, dall’enzima lisozima da bianco d’uovo e da cellule separate di Lactococcus
garvieae mediante tecnologia airless spray-gun. La matrice di alginato, polimerizzata mediante
gelazione ionotropica, contiene al suo interno le cellule batteriche ed il lisozima ed è rivestita dal
chitosano mucoadesivo. SVO-1 si presenta come una polvere incolore ed inodore costituita da
microparticelle (di 70-80 µm di diametro) con un alto rapporto superficie/volume.
SVO-2 è costituito da una microemulsione doppia del tipo olio/acqua/olio, (olio: miscela di mono-ditrigliceridi e mono-diesteri del PEG 400 con acidi C8 e C10) prodotta con l’ausilio di tensioattivi
naturali derivati dall’olio di oliva e con lisozima addizionato. La microemulsione (200 nm di diametro)
viene mescolata con Lactococcus garvieae e caricata in rapporto 1:1 (peso su peso) su polvere di
polivinilpirrolidone (PVP) reticolato. SVO-2 si presenta come polvere dal colore leggermente ialino,
quasi inodore.
SVO-3 è costituito da SVO-2 mescolato ad un eccipiente lipidico fuso (acido stearico) il tutto poi
microincapulato mediante tecnologia spray-congealing. Si presenta come polvere bianca, inodore e
costituita da microsfere dal diametro medio di 200 µm circa.
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Scale-up produttivo pre-industriale. Ottimizzazione e caratterizzazione formulazioni.
La conoscenza dei vari livelli di struttura ottenuta consente di personalizzare la composizione del
sistema SVO-1 in base alle esigenze applicative e di ottimizzare la formulazione sia dal punto di vista
tecnologico che dal punto di vista del comportamento delle sostanze immobilizzate e delle proprietà di
ritenzione e rilascio del sistema. Per approfondimenti vedi pubblicazioni allegate i cui dati sono stati in
parte ottenuti nel contesto del presente Progetto (B. Bellich et al, 2009; M. Borgogna et al, 2010; B.
Bellich et al, 2011).
I lotti di particelle SVO-1, prodotte con il prototipo di impianto produttivo, mostrano caratteristiche
adeguate alla vaccinazione orale in acquacoltura. Tutti i lotti analizzati hanno, infatti, dimensioni
confacenti alla somministrazione per os e mostrano ottime proprietà gastroresistenti, con un rilascio
praticamente nullo durante le 8 ore di incubazione in ambiente acido (che simula quello dello stomaco
della trota) ed un rilascio sostenuto nelle successive 28 ore in tampone fosfato (in condizioni che
simulano quelle dell’intestino della trota). I tempi di rilascio analizzati rispecchiano i tempi di transito
gastrointestinale studiati in vivo nella trota iridea attraverso sonde fluorescenti (vedi Relazione del
primo anno di Progetto).
Grazie all’ottimizzazione dell’impianto airless spray-gun e dei protocolli di produzione i costi vivi di
produzione sono stati, in un primo momento, ridotti a circa 3,9 €/g di SVO-1 (dai circa 10 €/g
precedentemente all’inizio del presente Progetto) ovvero 39 €/kg di mangime medicato. Tali costi
potranno essere abbattuti ulteriormente, ed in modo sensibile, adottando un sistema industriale di
disidratazione alternativo all’alcol etilico che rappresenta la principale voce di spesa (83-84% circa).
Lotti sperimentali di SVO-1 sono stati prodotti senza disidratazione con alcool ed hanno portato
all’ottenimento di un prodotto facilmente stoccabile, durevole e facilmente miscelabile al mangime per
produrre il mangime medicato. I costi di produzione sono stati così abbattuti a circa 0,68 €/g di SVO-1
ovvero a circa 6,8 €/kg di mangime medicato con un ulteriore abbattimento dei costi vivi di produzione
dell’83%.
L’impianto produttivo airless spray-gun ed i modus operandi sviluppati nel corso del presente Progetto
sono stati brevettati in Italia con il titolo: “METODO ED APPARATO PER LA PREPARAZIONE DI
MICRO-PARTICELLE DI POLISACCARIDI” (9596PTIT). Tale brevetto Nazionale è stato esteso a
livello Internazionale con il titolo: “METHOD AND APPARATUS FOR PREPARING MICROPARTICLES OF POLYSACCHARIDES” (PCT/EP2010/062865) I testi del brevetto italiano e
dell’estensione Internazionale sono allegati in calce al presente Report.
Sono stati prodotti pellets contenenti SVO-2 che presentavano soddisfacenti proprietà tecnologiche e
si prestavano a manipolazione, confezionamento e stoccaggio per sei mesi. La pellettazione e
l’incorporazione delle formulazioni nel mangime non hanno alterato le nano strutture dei sistemi
vaccinogeni.
La tecnologia spray-congealing ha permesso di ottenere un innovativo sistema chimerico (che,
concettualmente, abbiamo definito SVO-3) costituito da SVO-2 microincapsulato in acido stearico. I
sistemi chimerici sono quanto è attualmente di più ambito da parte delle industrie farmaceutiche (e
non solo) per il fatto che ai vantaggi dei nanosistemi (ad es. altissimo rapporto superficie volume) si
uniscono i vantaggi dei microsistemi (migliore protezione, maneggevolezza durante i processi
produttivi fino al confezionamento). Le rese di produzione molto buone (76%) e le buone capacità
produttive (diversi kg al giorno di SVO-3 che corrispondono a diversi quintali di mangime medicato al
giorno) si possono considerare già a livello pre-industiale. L’ingegnerizzazione di SVO-3 va oltre agli
obiettivi originari prefissateci. La tecnologia produttiva utilizzata appare molto promettente per il
trasferimento tecnologico all’industria ed SVO-3 è “solo uno dei possibili risultati” (che necessitano di
future validazioni sul campo). Inoltre, i suddetti studi di scale-up hanno evidenziato come la forma
ideale commerciale del vettore orale per la vaccinazione potrebbe essere rappresentata da una
minicompressa molto versatile.
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Trials di vaccinazione: prove di campo e analisi dei campioni.
Le migliori risposte umorali nelle trote si hanno combinando la vaccinazione IP (primaria) con la
vaccinazione orale con SVO-1 (richiamo). Tali risposte sono significativamente superiori rispetto alla
sola vaccinazione IP. Tale azione potenziante è presente, ma non in maniera significativa, anche
utilizzando l’SVO-2.
I dati dell’infezione sperimentale indicano che i risultati migliori si hanno utilizzando la combinazione
IP+SVO-1 (RPS 22%) e SVO-1+SVO-1 (RPS 22%). SVO-1 senza cellule batteriche ha fornito un
interessante RPS del 30%.
L’SVO-1 privo di cellule batteriche fornisce un interessante livello di protezione pari o superiore al
vaccino stabulogeno ed ai sistemi contenenti il lattococco. L’efficacia di SVO-1 anche senza le cellule
di lattococco può essere attribuita alla presenza del lisozima, noto per le sue proprietà
immunomodulanti (Sava G et al Journal of Experimental Therapeutics Oncology, 1996, 1 (6): 342-9).
Tali risultati, relativamente inaspettati, aprono nuove prospettive di utilizzo del sistema “come tale”
(senza il bisogno dell’antigene) per applicazioni in campo della pescicoltura e di altri settori della
zootecnia e meritano di essere approfondite nel corso di studi futuri.
L’SVO-2, si è rivelato promettente per la veicolazione orale di antibiotici ad Oncorhynchus mykiss
(trota iridea). Fermo restando che tali principi attivi vadano somministrati solo come estrema ratio per
evitare consistenti morie di pesci e conseguenti gravi perdite economiche, la somministrazione orale
degli antibiotici con sistemi “tipo SVO-2” è finalizzata ad evitare che grosse quantità di antibiotico
vengano smaltite nelle acque a valle degli impianti. Infatti, essendo contenuti nel mangime, solo una
quantità irrisoria di prodotto contenente antibiotico permane nell’acqua, rendendo tale tipologia di
somministrazione molto efficiente, senza sprechi inutili ed il più possibile “verde”. I dati sono
presentati per esteso nella pubblicazione scientifica allegata (F. Serdoz et al. 2010).
Vista la semplicità di utilizzo e di gestione dei mangimi medicati contenenti SVO, riteniamo che,
opportune riformulazioni dei protocolli vaccinali standard in pescicoltura, possano contribuire ad
ottenere in futuro risultati migliori in termini di RPS. Nell’ambito delle riformulazioni possibili
proponiamo uno o più ulteriori richiami con SVO-1.
B2) “Innovazione filiera trota iridea regionale per il miglioramento della qualità e per il
riconoscimento della tipicità di prodotto” (I.R.IDEA).
L’impegno della Fondazione Callerio consiste nella continuazione ideale, nel contesto specifico di
I.R.IDEA, di quanto intrapreso nell’ambito del Progetto “Vettori orali di vaccini per la pescicoltura del
Friuli Venezia Giulia”, Strumento di Finanziamento: LR 26/2005, Art. 23 – DPReg 4 maggio 2007. Tra
le attività di cui la Fondazione Callerio si è fatta carico, nell’ambito del primo anno di Progetto, un
ruolo di primo piano riveste il perfezionamento del prototipo di impianto produttivo airless spray-gun.
Nel corso dei primi 10 mesi di Progetto, in un’ottica di ottimizzazione dei costi e dell’attività produttiva,
sono stati individuate le condizioni operative ottimali dell’impianto sotto vari aspetti.
Condizioni operative ottimali
Sono stati innanzitutto prodotti 9 lotti di microsistemi variando la concentrazione di alginato e calcio
cloruro, e utilizzando 2 ugelli di dimensioni differenti. È stata effettuata una valutazione “qualitativa” in
base ai seguenti aspetti macroscopici: eccessiva viscosità della soluzione alimentante, difficoltà di
scorrimento della stessa nei circuiti dell’impianto, presenza di agglomerati nel semilavorato,
scorrevolezza della polvere, ritenzione di umidità. Sono stati, in tale modo, individuati i lotti su cui
eseguire una caratterizzazione più approfondita. In tabella 2 è riportata la composizione dei MS
prodotti: le quantità di LZ, chitosano e HPMC sono identiche per tutti i lotti. È stato deciso di variare la
percentuale di alginato perché è il componente che più influenza la viscosità della soluzione
alimentante; è stata modificata la concentrazione di calcio cloruro perché è determinante per il
processo di gelificazione-rivestimento e influenza in modo rilevante i costi di produzione. Infine, sono
stati scelti 2 ugelli di dimensioni diverse perché le caratteristiche dei MS (dimensioni, morfologia)
dipendono anche da questi elementi meccanici.
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Alginato
Calcio cloruro
Scoring
(% p/V sol. alimentante)
(% p/V sol. gelificazione)
“qualitativo”
1
2
15
-
2
3
15
++
4
3
-
4
4
5
++
5
4
15
+++
6
5
15
---
7
2
15
+++
3
15
++
4
15
+
N° lotto
3
8
Ugello
Grande
Piccolo
9
Tab. 2 Composizione dei lotti di MS con LZ.
Per quanto riguarda i MS ottenuti utilizzando l’ugello grande, i lotti con caratteristiche più
soddisfacenti sono risultati essere i n° 2, 4 e 5. La soluzione alimentante del lotto n° 6 è risultata
talmente viscosa che non è stato possibile effettuare la produzione. La produzione dei lotti n° 1 e 3 è
avvenuta con difficoltà a causa dell’incompleta gelificazione dei MS, che comportava la formazione di
agglomerati grossolani di alginato nella soluzione di chitosano. Tra i lotti di MS prodotti con l’ugello
piccolo, il n° 7 presentava l’aspetto più soddisfacente; i n° 8 e 9 sono stati considerati accettabili.
Resa dell’impianto.
Sono stati individuati i differenti siti a livello dei quali si verificano le perdite dell'impianto e quantificare
la resa di produzione in base al volume di soluzione alimentante utilizzata. Parimenti, si sono voluti
individuare i limiti di operatività del processo produttivo (dalla preparazione della soluzione
alimentante fino all'ottenimento della particella secca) quantificando il volume minimo e il volume
massimo di soluzione alimentante processabile nel corso di una sessione lavorativa giornaliera.
Le perdite dell'impianto si sono verificate in diversi momenti del processo produttivo (Fig. 1) e
riguardavano principalmente la soluzione alimentante:
- residui che sono rimasti nel recipiente in cui sono stati miscelati i componenti
- quantità che è rimasta nel serbatoio della pompa
- micronizzato che è stato aspirato dalla cappa o che si è disperso nell'ambiente circostante
- residui all'interno dell'impianto dopo che è terminato il ciclo produttivo
Il confronto tra il peso secco della soluzione alimentante ed il peso secco dei MS prodotti (vedi tab. 3
e fig. 2) ha messo in evidenza che, aumentando il volume della soluzione alimentante, le perdite in
termini di massa si mantengono costanti e, di conseguenza, la resa aumenta con l'aumentare dei
volumi di soluzione alimentante, a parità di formulazione (vedi fig. 3).
Volumi
soluzione alimentante
(L)
Peso secco totale
Peso secco
soluzione alimentante (g)
prodotto finito (g)
Perdite (%)
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1
2
3
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25,4
12,0
50,8
35,5
76,2
66,7
52,8
30,1
12,5
Tab. 3. - Valori di peso secco e perdite percentuali.
RESA DI PRODUZIONE
90
80
Peso secco totale soluzione
alimentante
Peso secco (g)
70
Peso secco totale prodotto
finito
60
50
40
30
20
10
0
0
0,5
1
1,5
2
Volume soluzione alimentante (L)
2,5
3
3,5
Fig. 2 - Resa di produzione: le perdite di produzione in termini di peso secco sono costanti.
PERDITE DI PRODUZIONE
60
50
40
Perdite (%) 30
20
10
0
1
2
3
Volume di soluzione alimentante (L)
Fig. 3 - Perdite di produzione: la percentuale di perdite p/p cala con l’aumento di volume della
soluzione alimentante.
Caratterizzazione dei lotti prodotti.
I lotti di MS prodotti sono stati caratterizzati in vitro al fine di valutare la possibilità di utilizzarli come
veicoli di principi attivi per la somministrazione orale; sono state effettuate le seguenti analisi:
morfologia, dimensioni medie, efficienza di incapsulazione, rilascio del principio attivo in ambiente
acido e basico. Le prove sono state effettuate sui lotti la cui valutazione “qualitativa” era positiva.
Morfologia.
I MS si presentano sottoforma di polvere di colore bianco-crema, inodore e con una buona
scorrevolezza. Dall’analisi morfologica al SEM si è visto che hanno una forma irregolare con una
superficie corrugata. I lotti analizzati sono i n° 4, 5 e 9 (vedi fig. 4-6) sono stati formulati con la stessa
percentuale di alginato (4 %), ma differiscono per:
- concentrazione di calcio cloruro: il lotto n° 4 è stato prodotto con CaCl2 al 5 %, mentre il n° 5 e il n° 9
con CaCl2 al 15 %;
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- dimensioni dell’ugello: il lotto n° 9 è stato micronizzato con l’ugello “piccolo”, mentre i numeri 4 e 5
con l’ugello “grande”.
Fig. 4 - Morfologia del lotto n° 4.
Fig. 5 - Morfologia del lotto n° 5.
Fig. 6 - Morfologia del lotto n° 9
Efficienza di incapsulazione.
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L’efficienza d’incapsulazione e stata calcolata utilizzando il lisozima marcato con FITC come proteina
modello. L’efficienza d’incapsulazione media del lisozima è risultata essere del 65% che può ritenersi
buona per sistemi prodotti mediante prototipo in laboratorio.
Rilascio in ambiente acido ed in ambiente basico.
Per simulare il rilascio dal microsistema in condizioni simili a quelle gastriche ed a quelle intestinali è
stato effettuato un rilascio in tampone glicina a pH3 a 37°C per 4 ore ed in PBS a pH8, a 37°C per 24
ore, rispettivamente. I dati, riferiti al campione 5, sono riportati in fig. 7 ed in fig. 8, rispettivamente.
Release lotto n° 5 in tampone glicina pH 3
0,8
Lisozima (mg/mL)
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
Tempo (h)
Fig. 7 - Rilascio del lotto n° 5 in ambiente acido.
Release lotto n° 5 in PBS pH 8
0,8
Lisozima (mg/mL)
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
5
10
15
20
25
Tempo (h)
Fig. 8 - Rilascio del lotto n° 5 in ambiente basico.
Come si nota in fig. 7 i microsistemi prodotti sono gastroresistenti e rilasciano il loro contenuto a pH
simili a quelli intestinali (vedi fig. 8), peculiarità essenziali per sistemi di veicolazione orale.
b3) Microincapsulazione di un peptide antimicrobico per la produzione di un oral delivery
system per il trattamento di infezioni da Salmonella enterica.
E’ stato sfruttato il know how preesistente in Fodazione Callerio sulla produzione di sistemi di oral
delivery per la realizzazione di micro particelle contenenti come principio attivo un peptide
antimicrobico, Bac7, attivo contro batteri Gram negativi, per il trattamento di infezioni da Salmonella
enterica. Il sito d’infezione primario per questi batteri è l’intestito per cui la via di trattamento
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preferenziale di queste infezioni è quella orale. A causa della breve emivita e stabilità di questo
peptide in condizioni fisiologiche, si è pensato a due strategie tecnologiche:
1) microincapsulare il Bac7 in microparticelle di alginato rivestite da chitosano che proteggerebbe
il peptide dalla degradazione dovuta principalmente a proteasi presenti in diversi siti
dell’organismo e garantirebbe un rilascio prolungato nel tempo.
2) Incapsulare il Bac7 in nanoparticelle di olio-acqua e microincapsulare queste ultime in
particelle di alginato e chitosano; i vantaggi di questo sistema rispetto al precedente sono di
garantire una protezione al peptide anche dopo rilascio dalla microparticella consentendo di
aumentare l’emivita del peptide e di evitare possibili interazioni elettrostatiche con l’alginato
che potrebbero ostacolare il rilascio.
La produzione di questi due sistemi è avvenuta con l’utilizzo dell’impianto per la produzione in scala di
laboratorio di microsistemi presente in Fondazione Callerio, applicando un protocollo standard e
usualmente utilizzato in Fondazione, opportunamente adattato.
Si è poi valutato il rilascio del peptide nel tempo da questi microsistemi, incubando le microparticelle
in un buffer con lo stesso pH che si trova nell’intestino. I risultati preliminari ottenuti mostrano in
entrambi i casi un rilascio del peptide molto lento.
Gli esperimenti in vitro, attualmente in corso, sull’attività antibatterica del composto rilasciato dalle
micro particelle nel tempo, aiuteranno a capire come ottimizzare questi sistemi di delivery per
consentire al peptide di mantenere la propria attività antimicrobica magari potenziandola.
Sono altresì in programma ulteriori analisi fisico-chimiche per caratterizzare i due sistemi prodotti.
c) Studio degli eventi molecolari responsabili degli effetti nefroprotettivi del lisozima
nel contesto del diabete
In questa fase, il progetto è stato focalizzato: i) sull’individuazione delle cellule più adatte per allestire
in vitro un modello nel quale simulare effetti AGE-mediati; ii) sulla ricerca di un possibile marker per
valutare il danno cellulare. Per quel che riguarda le cellule, si è optato inizialmente, per due linee
cellulari ed una coltura primaria. Le linee cellulari scelte e le motivazioni della scelta sono le seguenti:
LLC-PK1, cellule di tubulo renale prossimale suino, le HK-2, cellule di tubulo prossimale renale
umano, per la loro origine renale; la coltura primaria è rappresentata dalle cellule ADMEC (adul
dermal microvascular endothelial cells), per i noti effetti del diabete sul sistema cardiovascolare.
Utilizzando come parametri discriminanti per le linee cellulari la semplicità delle procedure operative
specifiche, la loro stabilità in vitro e la bibliografia correlata esistente, si è deciso di focalizzare il
lavoro sulla linea renale umana, HK-2.
È stata innanzitutto valutata la vitalità cellulare, in seguito a trattamento con AGE. Dopo aver
focalizzato l’attenzione su quello che in letteratura è considerato il principale effetto degli AGE a livello
cellulare, vale a dire lo stress ossidativo, si è valutata l’espressione del recettore per gli AGE, RAGE.
Si può notare come le cellule trattate con concentrazioni crescenti di AGE per 24 h, 48 h e 72 h
mostrino variazioni significative in termini di vitalità saggiata con il test MTT, che misura l’attività
mitocondriale. Il trattamento contemporaneo con le stesse concentrazioni di lisozima non ha mostrato
un recupero del parametro valutato.
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***
***
G
E
20
G
E
A
1
10
-40
G
E
20
E
-20
A
A
G
G
G
A
24h Treatments [uM]
0
A
% viability vs cells in own medium
***
M TT assay
20
A
20
***
-60
A
G
E
A
G
E
10
1
G
E
-40
10
***
-60
-20
E
***
0
1
-20
20
E
0
-40
MTT assay
% viability vs cells in own medium
M TT assay
20
A
% viability vs cells in ow n medium
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72h Treatments [uM]
48h Treatments [uM]
Figura 1: Effetti degli AGE sulla vitalità delle cellule HK-2
Uno dei principali effetti riportati per gli AGE, in vivo ed in vitro, è rappresentato dallo stress ossidativo
e quindi, in questa prima fase, abbiamo voluto considerare la variazione di ROS intracellulari come
marker dell’attività cellulare degli AGE. Dopo trattamento con concentrazioni diverse per un per un
lasso di tempo più breve (6 h) e per un periodo più prolungato (24 h) , non è stato riscontrato un
aumento statisticamente significativo nella produzione di ROS rispetto alle cellule non trattate con
AGE (Ctrl-) nelle tre linee cellulari (di seguito sono riportati i risultati relativi alla linea HK-2).
ROS detection
ROS detection
3×10 0 5
2×10 0 5
RFU
1×10 0 5
5×10 0 4
Ctrl Ctrl +
AGE 10
AGE 20
AGE 50
2×10 0 5
RFU
Ctrl Ctrl +
AGE 10
AGE 20
AGE 30
1×10 0 5
0
0
6h Treatments [uM]
24h Treatments [uM]
Figura 2: Effetti degli AGE sulla produzione di ROS nelle cellule HK-2
Il passo successivo è consistito nello studio dell’espressione di RAGE, recettore principalmente
coinvolto negli effetti citotossici AGE-indotti. Contrariamente a quanto ottenuto con gli studi in vivo, il
trattamento con lisozima, sia da bianco d’uovo (hewLZ), sia ricombinante umano (hrLZ), non ha
mostrato la capacità di influenzare l’espressione di RAGE, misurata mediante tecnica RT-PCR.
RAGE mRNA RT-PCR
Fold induction/18S
1.5
TC
hewLZ 1
hewLZ 2
hewLZ 5
hrLZ 1
hrLZ 2
hrLZ 5
1.0
0.5
0.0
96h Treatments [uM]
Figura 3: Quantificazione di mRNA per RAGE mediante RT-PCR
Nel nostro modello cellulare, il marker rappresentato dalla produzione di ROS non appare coinvolto.
Inoltre, contrariamente a ciò che ci si aspettava considerando i dati ottenuti in vivo, il LZ non modifica
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i livelli di mRNA per RAGE. É possibile che in coltura le cellule abbiano perso la capacità di esprimere
questo recettore o che i tempi di esposizione non siano in grado di indurre variazioni dell’espressione
genica del recettore. Abbiamo quindi focalizzato l’attenzione sulla ricerca di un altro marker di effetti
AGE-indotti: l’infiammazione gioca un ruolo fondamentale nello sviluppo della nefropatia diabetica,
l’attenzione, quindi, è stata posta su uno dei principali marker infiammatori, la produzione di citochine.
In particolar modo, è stato approfondito lo studio su IL-6, citochina particolarmente coinvolta nel
contesto della nefropatia diabetica. Un saggio ELISA ha messo in evidenza come il trattamento con
gli AGE incrementa significativamente la produzione di IL-6, mentre il trattamento con hrLZ è in grado
di prevenire l’effetto degli AGE sulla produzione di IL-6.
2000
1500
1000
500
AGE 20+LZ 20
AGE 20+LZ 1
AGE 20+LZ 10
AGE 10+LZ 20
AGE 10+LZ 1
AGE 10+LZ 10
AGE 1+LZ 20
AGE 1+LZ 1
AGE 1+LZ 10
LZ 20
LZ 1
LZ 10
AGE 20
AGE 10
TC
0
AGE 1
IL-6 production (ng/ml)
IL-6 De te ction
24h Tre a tme nts [uM]
Figura 4: Quantificazione di IL-6 mediante ELISA assay
Il dato ottenuto con il saggio ELISA è stato poi confermato mediante uno studio di RT-PCR per
l’mRNA di IL-6. Come emerge dal grafico si può infatti notare che il trattamento di 96 h con gli AGE
induce un aumento significativo dei livelli di IL-6. HrLZ, invece, è in grado di prevenire completamente
l’effetto degli AGE sulla produzione di IL-6.
IL-6 mRNA RT-PCR
Fold induction/18S
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
TC
AGE 10
LZ 10 AGE 10+LZ 10
96h Treatments [uM]
Figura 5: Quantificazione livelli mRNA per IL-6 mediante RT-PCR
Al fine di indagare se la capacità del lisozima di prevenire la produzione di IL-6 AGE-indotta fosse
legata alla sua attività di scavenger extracellulare o ad un meccanismo intracellulare, sono state
effettuate delle analisi di microscopia confocale dopo pre-trattamento delle cellule con AGE coniugati
con la rodamina B e successivo trattamento con hrLZ coniugato con FITC. Le foto acquisite mettono
in evidenza come gli AGE (rosso) siano in grado di entrare nella cellule, localizzandosi sia a livello
citoplasmatico che nucleare. Per quel che concerne il lisozima (verde), invece, si può notare che si
accumula perlopiù a livello di membrana. Tuttavia, osservando in ingrandimenti maggiori (60x), non è
da escludere che il lisozima sia anche in grado di penetrare all’interno della cellula.
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A
B
C
Figura 6: Microscopia confocale. Cellule HK-2 trattate con AGE marcati con rodamina B (rosso) e LZ marcato
con FITC (verde). Ingrandimento. Pannello A: 20x; pannello B e C: 60x
Complessivamente, i dati ottenuti ci permettono di concludere che la linea cellulare HK-2, selezionata
in questa prima fase, è adatta per gli studi che si stanno effettuando. In secondo luogo, è emerso il
ruolo che il lisozima svolge nel contesto della risposta infiammatoria associata agli AGE. Le prime
immagini ottenute mediante tecnologia di microscopia confocale, dimostrano la capacità degli AGE di
penetrare la membrana e di localizzarsi a livello intracellulare e nucleare. Per quel che concerne il LZ,
d’altro canto, non è possibile asserire con certezza che il LZ non entri nella cellula. Una possibile
prospettiva futura sarà quella di utilizzare un marker più sensibile da coniugare al LZ al fine di
indagare in maniera più precisa se l’azione del LZ è riconducibile ad un’azione intracellulare e quindi
alla modulazione di qualche pathway coinvolta nella risposta infiammatoria AGE indotta.
d) Nanostrutture di carbonio come vettori per farmaci antitumorali
Durante il corso di questo secondo anno sono stati condotti studi in vitro su fullereni funzionalizzati
impiegando diverse linee cellulari con l’obiettivo di valutare se gli effetti tossici o meno di questi
composti possano variare a seconda dalla linea cellulare utilizzata. I modelli di studio utilizzati sono
linee cellulari neoplastiche di carcinoma mammario umano MCF7, MCF7/ADR (rispettivamente
sensibile e resistente all’adriamicina) e MDA-MB231, di adenocarcinoma umano di colon HT-29 ed
HCT116, e di adenocarcinoma polmonare umano non a piccole cellule H460.
Gli studi di citotossicità hanno permesso di individuare un fullerene che presenta una limitata/assente
tossicità (denominato F2) e quello con una tossicità medio/elevata (denominato F3), nelle linee
cellulari utilizzate ed i risultati sono riportati in Figura 1. Mediante tecniche citofluorimetriche è stato
confermato che il fullerene F3 è maggiormente tossico in quanto causa una consistente
depolarizzazione mitocondriale già dopo 24 ore di trattamento [25 µM].
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Figura 1- MTT per le diverse linee cellulari dopo 72h di incubazione con F2 o F3. Si riportano istogrammi
rappresentativi di un esperimento.
Per le caratteristiche di minor tossicità di F2 rispetto ad F3, è stato scelto di proseguire gli studi con il
composto più adatto a svolgere la funzione di vettore.
Sulla base di questi risultati sono state eseguite prove citofluorimetriche sulla linea MCF7 che hanno
dimostrato come F2 sia in grado di attraversare le membrane plasmatiche e di accumularsi nelle
cellule già dopo un’ora, aumentando in quantità fino a 12 ore. L’analisi è stata condotta fino alle 72
ore, tempo in cui il valore di fluorescenza del fullerene sembra rimanere stabile. Queste
considerazioni portano ad affermare che F2 potrebbe essere un buon vettore per farmaci con
clearance rapida: potrebbe aumentare il tempo di permanenza, ad esempio, di un antineoplastico
nelle cellule tumorali. Mediante microscopia a fluorescenza, sono stati condotti una serie di studi di
distribuzione sub-cellulare, dai quali è emerso che F2 non colocalizza né a livello mitocondriale nè
lisosomiale; quest’ultima evidenza lo renderebbe un vettore stabile per farmaci acido-labili dato che
non è indirizzato nel lisosoma, il cui ambiente potrebbe causare degradazione del farmaco ad esso
coniugato. Inoltre, la mancata internalizzazione del fullerene a livello nucleare, sempre esaminata
mediante microscopia a fluorescenza, escluderebbe la possibilità di un danno diretto a carico del
materiale genetico (Figura 2).
In parallelo sono stati condotti i primi esperimenti sul coniugato F2-DOXORUBICINA studiato
innanzitutto per verificare se l’attività del farmaco legato al fullerene rimane equiparabile a quella della
doxorubicina libera. E’ stato interessante inoltre verificare se la sovraespressione della pompa
estrusiva P-gp, che determina la resistenza della linea tumorale MCF7/ADR alla doxorubicina, possa
provocare un calo di internalizzazione anche del coniugato F2-DOXORUBICINA rispetto alla linea
sensibile MCF7.
Le prove di citotossicità hanno indicato che il coniugato, pur venendo internalizzato da entrambe le
linee cellulari in maniera concentrazione dipendente, ha attività irrilevante rispetto alla doxorubicina
libera in entrambe le linee, risultato che denota l’assenza di scissione del legame del coniugato che
rimane a livello citosolico impedendo l’attività nucleare della doxorubicina.
Tuttavia risulta che la doxorubicina trasportata dal fullerene viene internalizzata maggiormente nella
linea MCF7/ADR rispetto alla linea MCF7, contrariamente a quanto avviene con la doxorubicina
libera.
È stato quindi possibile affermare che F2 si potrebbe dimostrare un valido vettore per eludere il
problema della multidrug resistence nei confronti di farmaci antitumorali causata dall’attività estrusiva
della pompa P-gp.
L’ostacolo da superare rimane quindi la scelta del farmaco da coniugare visto che questo ipotetico
vettore non entra nel nucleo (e che quindi la doxorubicina e altri antitumorali ad azione nucleare non
potrebbero svolgere le proprie funzioni) nelle linee studiate. In alternativa si potrebbe pensare di
legare il farmaco al fullerene attraverso un legame più debole in modo da facilitarne il rilascio
citosolico.
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Figura 2- Immagini acquisite al microscopio a fluorescenza dello studio di colocalizzazione di F2-FITC con il
nucleo colorato con HOECHST 33342 Nuclear Stain sulla linea MCF7.
Pubblicazioni Scientifiche (copia in appendice)
I risultati riportati brevemente nel paragrafo precedente, sono stati organizzati in lavori scientifici
pubblicati su riviste specialistiche a carattere internazionale, con sistema di peer reviewing. I lavori
sono il risultato dello svolgimento dei progetti di ricerca della Fondazione Callerio che, come si può
dedurre dagli autori degli stessi, sono state condotte nell’ambito di strette collaborazioni con
ricercatori di altre istituzioni. Copia dei lavori è riportata in appendice.
1. Quiroga AG, Ramos-Lima FJ, Alvarez-Valdes A, Font-Bardia M, Bergamo A, Sava G, NavarroRanninger C. Synthesis, characterization and tumor cell growth inhibition of new trans platinum
complexes
with
phosphane
derivatives.
Polyhedron,
30:
1646-50,
2011.
doi:
10.1016/j.poly.2011.03.034. ISBN/ISSN: 0277-5387.
2.
Alberta Bergamo and Gianni Sava. Ruthenium anticancer compounds: myths and realities of the
emerging metal-based drugs. Dalton Trans, 40: 7817-23, 2011. doi: 10.1039/c0dt01816c. ISBN/ISSN:
1477-9226.
3.
I. Bratsos, C. Simonin, E. Zangrando, T. Gianferrara, A. Bergamo, E. Alessio. New half sandwich-type
Ru(II) coordination compounds characterized by the fac-Ru(dmso-S)3 fragment: influence of the facecapping group on the chemical behaviour and in vitro anticancer activity. Dalton Trans, 2011, 40: 953343. DOI: 10.1039/c1dt11043h.
4.
Sava G, Bergamo A, Dyson PJ. Metal-based antitumour drugs in the post-genomic era: what comes
next? Dalton Trans, 40: 9069-75, 2011.
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5. Mendes F, Groessl M, Nazarov AA, Tsybin YO, Sava G, Santos I, PJ Dyson, Casini A. Metal-based
inhibition of poly(ADP-ribose) polymerase – the guardian angel of DNA. J Med Chem 2011, 54:21962206.
Presentazioni orali e/o posters a convegni e congressi
th
1. 9 International Symposium on Targeted Anticancer Therapies, TAT 2011, Paris, France, March
7-9, 2011. Modulation of the tumour cell microenvironment with the ruthenium compound NAMI-A in a
breast cancer model. A. Bergamo, L. Brescacin, A. Masi, G. Sava.
2. 5° Meeting Nuove Prospettive in Chimica Farmaceutica. Functionalized Fullerenes as
Nanocarriers for Anticancer drugs. M. Lucafò, Pacor S., Fabbro C., Da Ros T., Prato M.,
Sava G.
3. 35° Congresso Nazionale Della Società Italiana di Farmacologia. Functionalized
Fullerenes as Nanocarriers for Anticancer drugs. M. Lucafò, Pacor S., Fabbro C., Da Ros T.,
Prato M., Sava G.
4. Nanotechnology Summer School 2011. Functionalized Fullerenes as Nanocarriers for
Anticancer drugs. M. Lucafò, Pacor S., Fabbro C., Da Ros T., Prato M., Sava G.
5. COST D39 “Metallo-Drug Design and Action” Final Whole Action Meeting, Royal College of
Surgeons in Ireland, Dublin 5-6 July, 2011. What can be learnt from the development of the ruthenium
anticancer drug NAMI-A. G. Sava and A. Bergamo
6.
COST D39 “Metallo-Drug Design and Action” Final Whole Action Meeting, Royal College of
Surgeons in Ireland, Dublin 5-6 July, 2011. Interaction of RAPTA-type complexes with cell cytoskeleton
and consequences for tumour invasion. A. Bergamo, A. Masi, and G. Sava.
7.
International Workshop on “Molecular Pathways in the Response of Tumours to Photodynamic
Therapy”, September 9-10, 2011, Udine. Ruthenium-Porphyrin Conjugates with Cytotoxic and
Phototoxic Antitumor Activity. A. Bergamo, T. Gianferrara, C. Spagnul, I. Bratsos, B. Milani, G. Sava,
and E. Alessio.
Brevetti
Estesione a livello Internazionale del brevetto 9596PTIT sull’impianto produttivo airless spray-gun con
il titolo: “METHOD AND APPARATUS FOR PREPARING MICRO-PARTICLES OF
POLYSACCHARIDES” (PCT/EP2010/062865).
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A TTIVITA ’ FO RM A TIVA
Sostegno per la frequenza a Dottorati di Ricerca
Nell’ambito di collaborazioni di ricerca, la Fondazione Callerio ha sostenuto l’onere di contribuire
borse di studio a giovani neolaureati, risultati idonei per la frequenza della Scuola di Dottorato in
Scienze Farmacologiche, Scuola di Dottorato interuniversitaria con sede amministrativa presso
l’Università di Padova.
In particolare, nel corso del 2011 nei laboratori della Fondazione Callerio sono ospitati:
Dott. Vania Vidimar al terzo anno della Scuola di Dottorato in scienze Farmacologiche dell’Università
di Padova, che sta conducendo ricerche sul tema “Studio del meccanismo d’azione molecolare di
complessi di rutenio antitumorali”. Supervisor, prof. Gianni Sava; Tutor, dott. Alberta Bergamo, dott.
Christian Gaiddon.
Dott. Davide Gallo al secondo anno della Scuola di Dottorato in scienze Farmacologiche
dell’Università di Padova, che sta conducendo ricerche sul tema “Studio del meccanismo d’azione
nefroprotettiva del Lisozima”. Supervisor, prof. Gianni Sava; Tutor, dott. Moreno Cocchietto.
Dott Marianna Lucafò al secondo anno della Scuola di Dottorato in Nanotecnologie dell’Università di
Trieste, che sta conducendo ricerche sul tema “Nanostrutture di Carbonio come vettori per farmaci
antitumorali”. Supervisor, prof. Gianni Sava; Tutor, dott. Sabrina Pacor, prof. Sonia Zorzet e dott.
Tatiana Da Ros.
Organizzazione di convegni-congressi-seminari
In collaborazione con la Società Italiana di Farmacologia e con il Dipartimento di Scienze della Vita
dell’Università degli Studi di Trieste è stato organizzato un Convegno Monotematico intitolato:
“Farmacogenomica e cancro: dal laboratorio alla clinica” tenuto il 8 ottobre 2001 presso il Grand Hotel
Astoria di Grado (GO). Il convegno ha visto la partecipazione di più di 60 ricercatori e studiosi,
perlopiù giovani, provenienti da Università e Centri di Ricerca di tutta Italia e degli Stati Uniti.
PROGRAMMA
08:30 – 9:00:
Sessione 1:
Moderatore:
9:00 – 9:30
Apertura del meeting e saluti delle Autorità
Progettazione e sviluppo preclinico
Armando Genazzani (Università del Piemonte Orientale)
“Farmacogenomica nello sviluppo di nuovi farmaci antitumorali: single target vs
multi-target”
Silvana Canevari, Istituto Nazionale dei Tumori, Milano.
9:40 – 10:40
Comunicazioni libere:
9:40 – 10:00
Eva Dreussi
“microRNA and pharmacogenetics: focus on neoadjuvant treatment for rectal cancer”
10:00 – 10:20
Paola Poma
“Restoration of Raf-1 Kinase Inhibitor Protein levels as a possible therapeutic approach
in the hepatocellular carcinoma”
10:20 – 10:40:
Sara De Iudicibus
“Genetic predictors of glucocorticoid response in paediatric patients with inflammatory
bowel diseases”
10:40 – 11:20 Coffee Break
11:20 – 12:00 Comunicazioni libere:
11:20 – 11:40:
Valentina Boscaro
“Knock in of cancer mutations in human cells predicts pharmacological response to
targeted therapies”
11:40 – 12:00
Gabriele Stocco
“Genome-wide identification of determinants of leukaemia cell sensitivity to
mercaptopurine”
12:00 – 13:00 Pranzo
Moderatore:
Giuseppe Toffoli (CRO Aviano)
13:00 – 13:50
Keynote lecture: “Pharmacogenomics and the Pediatric Cancer Genome Project”
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William Evans, St. Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA
13: 50 – 14:30
Discussione dei poster a cura di Mary Relling (St. Jude Children’s Research Hospital,
Memphis, USA)
14:30 – 14:50 Coffee Break
Sessione 2:
Moderatore:
14:50 – 15:20
15:20 – 16:40
15:20 – 15:40
15:40 – 16:00
16:00 – 16:20
16:20 – 16:40
16:40 – 17:00
Farmacogenomica nei Trial Clinici
Enrico Mini (Università di Firenze)
“Targeted therapy, proof of principle e ruolo dei marcatori”
Federica Di Nicolantonio (Università di Torino)
Comunicazioni libere:
Gloria Ravegnini
“Association between genotypes and response to the treatment in a subset of previously
untreated chronic myeloid leukemia patients”
Raffaella Franca
“Childhood acute lymphoblastic leukaemia (ALL): role of polymorphisms in the GST-µ,
GST-θ and ABCC1 genes on relapse”
Paola Biason
“Pharmacogenetics in osteosarcoma: the role of nucleotide excision repair gene
variants in survival after neoadjuvant chemotherapy”
Eva Cuzzoni
“Role of GST-M deletion in azathioprine metabolism in pediatric patients with IBD”
Chiusura del Convegno
10 maggio 2011 – La Fondazione Callerio, con il supporto della Associazione Piscicoltori Italiani, ha
organizzato presso la Sala Convegni di Villa Manin di Passariano un Workshop dal titolo: “Vaccini
orali hi-tech per la pescicoltura del Friuli Venezia Giulia”. Tema del Workshop era la
rendicontazione alle parti interessate del lavoro svolto dal Capofila Fondazione Callerio, dai Partner di
Progetto Università degli Studi di Trieste ed Università degli Studi di Udine.
PROGRAMMA
10:00-10:15 REGISTRAZIONE
10:15-10:30 SALUTI DI APERTURA
Prof. Gianni Sava, Direttore Scientifico Fondazione Callerio, vice-Direttore del
Dipartimento di Scienze della Vita dell’Università degli Studi di Trieste.
Pier Domenico Stefanuto (Consigliere Associazione Piscicoltori Italiani)
Sessione scientifica
Moderatore: Prof. Gianni Sava (Direttore Scientifico Fondazione Callerio Onlus; vicedirettore
Dipartimento di Scienze della Vita, Università degli Studi di Trieste).
10:30-10:50 Dott. Moreno Cocchietto (Ricercatore Fondazione Callerio Onlus, Trieste)
VETTORI ORALI DI VACCINI PER LA PESCICOLTURA DEL FRIULI VENEZIA GIULIA
10:50-11:10 Dott.ssa Beatrice Albertini (Dipartimento di Scienze Farmaceutiche, Università
degli Studi di Bologna)
SCELTE TECNOLOGICHE PER LA VACCINAZIONE ORALE IN PISCICOLTURA
11:10-11:30 Prof. Marco Galeotti (Dipartimento di Scienze degli Alimenti, Facoltà di Medicina
Veterinaria, Università degli Studi di Udine)
PROGETTO IRIDEA: VALORIZZAZIONE DELLA RICERCA PER LO SVILUPPO
ECONOMICO DEL SETTORE ITTICO DEL FRIULI VENEZIA GIULIA
11:30-11:50 Pier Domenico Stefanuto (Consigliere Associazione Piscicoltori Italiani)
MERCATO ITTICO REGIONALE NELLA PROSPETTIVA DELLA VALORIZZAZIONE DEL
PRODOTTO
11:50-12:00 BREVE DISCUSSIONE E RINGRAZIAMENTI FINALI
12:00-12:30 RINFRESCO E RILASCIO DEGLI ATTESTATI DI PARTECIPAZIONE
Aggiornamento e perfezionamento per ricercatori e borsisti
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Dott. Alberta Bergamo
9th International Symposium on Targeted Anticancer Therapies, TAT 2011, Paris, France, March 7-9,
2011.
European Symposium on Experimental Metallodrugs, ENSCP, ParisTech, 11 March, 2011, Paris.
5° Meeting NUOVE PROSPETTIVE IN CHIMICA FARMACEUTICA, Trieste, Savoia Excelsior Hotel,
28-30 marzo 2011.
International Workshop on “Molecular Pathways in the Response of Tumours to Photodynamic
Therapy”, September 9-10, 2011, Udine.
35° Congresso Nazionale SIF, Bologna 14-17 settembre 2011.
Farmacogenetica: dalla teoria alla pratica, Trieste, Palazzo dei Congressi della Stazione Marittima, 7
ottobre 2011.
III Convegno Monotematico SIF “Farmacogenetica e cancro: dal laboratorio alla clinica” Grado (GO),
Grand Hotel Astoria, 8 ottobre 2011.
Dott. Moreno Cocchietto
28 febbraio 2011 – Nel contesto del Progetto I.R.IDEA si è tenuto il Workshop: “Innovazione della
filiera della trota iridea: il progetto I.R.IDEA, una opportunità per la troticoltura regionale” presso la
Sala Convegni di Villa Manin di Passariano, a cui la Fondazione Callerio ha partecipato a titolo di
Partner di Progetto.
Forum della Borsa della Ricerca, Bologna, Palazzo Re Enzo, 18-20 maggio 2011.
10 giugno 2011 - “Optical and CT Imaging for Biomedical Applications”: seminario organizzato dal
Dipartimento di Scienze della Vita dell’Università degli Studi di Trieste. Relatori: dott.ssa Stefania Biffi
e dott. Simeone dal Monego del CBM Scrl, Trieste.
27 giugno 2011 – “Giornata Nazionale di presentazione del bando 2012 “Prodotti Alimentari,
agricoltura e pesca, e biotecnologie” (FAFB) MIUR – P.le Kennedy, 20, Roma.
Dott. Marianna Lucafò
Workshop of the School of Nanotechnology, 17-20 Gennaio 2011, Trieste
35° Congresso Nazionale Della Società Italiana di Farmacologia, 14-17 Settembre 2011, Bologna
Nanotechnology Summer School 2011, 20-23 Settembre 2011, Trieste
Chiara Pelillo
8 ottobre- III Covegno Monotematico SIF 2011 “Farmacogenomica e Cancro: dal laboratorio alla
clinica”, organizzato dalla Fondazione Callerio, Grado (GO).
7 ottobre- “Farmacogenetica:dalla teoria alla pratica” organizzato da IRCCS Burlo Garofolo, IRCCS
CRO di Aviano e dall’Università di Trieste presso il Palazzo dei Congressi, Trieste
10 giugno-“ Optical imaging for biomedical applications” and “MicroCT and phase contrast microCT
lung applications” seminario tenuto dalla Dott. Stefania Biffi e il Dott Simeone dal Monego, CBM,
presso l’Università di Trieste.
26-28 maggio- Italian Society of Biophysics and Molecular Biology 7th Annual Seminar, organizzato
dalla Società Italiana di Biofisica e Biologia Molecolare presso l’Università di Trieste.
10 maggio- “Vaccini orali hi-tech per la pescicoltura del Friuli Venezia Giulia” convegno organizzato
dalla Fondazione Callerio, con il supporto della Associazione Piscicoltori Italiani presso la Villa Manin
di Passariano (UD).
28-20 marzo –V Meeting “Nuove prospettive in chimica farmaceutica” organizzato dall’Università di
Trieste, Hotel Savoy, Trieste.
Dott. Davide Gallo
28-30 Marzo 2011 – Trieste – V Meeting “Nuove prospettive in chimica farmaceutica.
8 Aprile 2011 - Università degli Studi di Padova – Nuovi modelli murini di alterazione della motlità
intestinale indotta da neuropatia del sistema nervoso enterico – Prof Ignazio Castagliuolo, Dr.ssa
Paola Brun, Dr.ssa Maria Cecilia Giron.
13 Aprile 2011 - Università degli Studi di Padova – Adherence: Pharmacists’ CSF? (A bottom
approach) - Dr. Andrea Manfrin.
5 Maggio 2011 – Università degli Studi di Padova – Introduction to miRNAs: basics, logics and loops
– Dr. Stefano Piccolo.
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5 Maggio 2011 – Università degli Studi di Padova – miRNA in embryonic development and
metastatsis – Dr. Stefano Piccolo.
17 Maggio 2011 – Università degli Studi di Padova – miRNAs, metabolim and disease – Dr. Markus
Stoffel.
10 Giugno 2011 – Università degli Studi di Trieste – Optical imaging for biomedical applications –
Dr.ssa Stefania Biffi.
10 Giugno 2011 – Università degli Studi di Trieste – MicroCT and phase contrast microCT lung
applications – Dr. Simeone dal Monego.
14-17 Settembre 2011 – Bologna – 35° Congresso Nazionale SIF, XV Seminario Nazionale per
Dottorandi in Farmacologia e Scienze Affini.
27 Settembre 2011 – Università degli Studi di Padova – Use of a large panel of cell lines as a tool for
anticancer drug discovery. From gene signature to clinical phases – Dr. Dario Ballinari.
Dott. Vania Vidimar
10-11 Gennaio 2011 – College Doctoral European - Università di Strasburgo – All roads lead to RNA:
news and perspectives.
17-18 Gennaio 2011 – College Doctoral European - Università di Strasburgo – Stem cells.
4 Febbraio 2011 – Università di Paris-Descartes – Journée Jeunes Chercheurs Chimie
Therapeutique.
21-23 Marzo 2011 - College Doctoral European - Università di Strasburgo – Effective Writing.
4 Maggio 2011 – INSERM U692 - Università di Strasburgo – Study of the stearoyl CoA desaturase 1
in ALS and motoneurons survival (Dr. Florent Schmitt) - Phospholipids and derivates - Do they take
part in ALS? (Dr. Alexandre Henriques).
14-17 Settembre 2011 – Palazzo dei Congressi – Bologna - XIV° seminario nazionale per dottorandi
in Farmacologia e Scienze Affini, Congresso della Società Italiana di Farmacologia.
8 Ottobre 2011 – Hotel Astoria Grado – III convegno monotematico SIF: Farmacogenomica e cancro:
dal laboratorio alla clinica.
2-3 Novembre 2011 – Palazzo dei congressi – Strasburgo – Canceropole du Grand-Est.
Tesi di Laurea e di dottorato in Fondazione Callerio
I laboratori della Fondazione, in particolare LINFA (colture cellulari, preparazioni istologiche, e citometria a
flusso) sono stati oggetto di frequenza da studenti della Facoltà di Farmacia dell'Università degli Studi di
Trieste, sotto la guida di docenti di quelle Facoltà ed autorizzati alla frequenza nella Fondazione, per la
messa a punto della tesi di laurea sperimentale. I ricercatori della Fondazione Callerio onlus sono stati
direttamente responsabili dell’assistenza tutoriale al lavoro svolto da parte degli studenti, come risulta dalla
firma apposta sulla tesi in qualità di correlatori.
Tesi di laurea interamente svolte nei laboratori della Fondazione Callerio Onlus
Laureanda: Chiara Moro
Laurea Magistrale in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche
Ottimizzazione della produzione di microsistemi di alginato e chitosano con impianto airless
spray-gun
Relatore Gianni Sava; Correlatori: Moreno Cocchietto, Paolo Blasi (UniPG).
Laureanda: Isabella Nogaretto
Laurea Magistrale in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche
Effetti di complessi di rutenio su cellule di carcinoma mammario in vitro
Relatore: Gianni Sava; Correlatore: Alberta Bergamo
Tesi di dottorato interamente svolte nei laboratori della Fondazione Callerio Onlus
Tesi di laurea contenenti dati ottenuti con attrezzature della Fondazione Callerio Onlus
Laureando: Roberta Orlando
Laurea Magistrale in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche
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Nanovettori per farmaci antitumorali: studio di un fullerene funzionalizzato ed analisi preliminare
del coniugato con la doxorubicina
Relatore: Sabrina Pacor; Correlatore: Marianna Lucafò
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APPENDICE
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