Diss. ETH No. 10162
The Interaction of the
Calmodulin-binding Site
Pump
with the Plasma
Membrane Ca2+
A dissertation submitted to the
SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY ZURICH
for the
of
degree
Doctor in Natural Sciences
presented by
Rocco Falchetto
Dipl.
Natw. ETH
born 19th
April
1965
Bellinzona,
in
TI
citizen of Lindau, ZH
Accepted
on
the recommendation of
Prof. E. Carafoli, examiner
Prof. H. Zuber, co-examiner
Zurich 1993
1
SUMMARY
with the Plasma
Calmodulin-binding Site
Membrane Ca2+ Pump
The Interaction of the
Ca2+ is
important
an
gradient
Stimulation of cells
produces
in
second messenger in
by hormones,
the
original
or
other first messengers
are
important points
intracellular Ca2+ concentration, i.e., in
terminating the
compartments, while those of the plasma membrane pump
into the extracellular space. The
are
signals
function.
endo(sarco)plasmatic enzymes pump Ca2+ back into
The
signal.
intracellular
have
electrical
The steep Ca2+
signalling
Ca2+ flow into the cell cytoplasm. Ca2+ pumps
a
restoring
calcium
pump
biological systems.
downhill into the cell is essential for its
major
it out
differences between the two types of
found in their C-terminal domains:
membrane Ca2+ pumps
plasma
addition of about 200 amino acids at their C terminus. A calmodulin-
an
site has been located within this domain in
binding
Calmodulin is
several
an
intracellular modulator
enzymes.
conformation upon
It
is
responsible
calcium-binding protein
a
Ca2+-binding.
for the activation of
which
These conformational
calmodulin-binding proteins. Binding
interaction with
studies.
previous
its
changes
changes permit
its
of calmodulin to the
Ca2+ pump increases its ATPase activity and affinity for Ca2+. Previous studies
suggested
a
role for the
calmodulin-binding
Ca2+ pump: the domain binds
inhibition of its
conformational
to
that
remove
Ca2+-dependent protease calpain
terminal
portion containing
activated
enzyme
calmodulin-binding
fragment
the
domain
as
internal inhibitor of the
within the enzyme
producing
of calmodulin to the domain
activity; binding
changes
region
a
this inhibition. In the present
was
used to
remove
study
from the pump
calmodulin-binding domain, generating
fragment. Synthetic peptides corresponding
site of the pump
and shown to inhibit its
were
then added to this
activity, bringing it
their
made
peptides
inhibitory
had to bind to
effects. To
a
specific region
identify
this
photoactivatable by replacing
portion
or
containing
coupling
peptides
a
in the C-terminal
a
portion
diazirine group. These
[3H]acetyl
were
a
the
C-
fully
a
the
to
to about the same level as
within the ATPase to
"receptor" region
the
implied
produce
peptides
were
Phe residue either in the N-terminal
of the
peptides
peptide
were
with
calpain-truncated
a
Phe
radioactively
function to their N terminus. The
shown to inhibit the
a
calpain-truncated
that of the intact enzyme in the absence of calmodulin. These results
that the
an
produces
pump
analogue
labeled
by
photoactivatable
fragment
with the
2
same
efficiency
as
those which
then cross-linked to the
diazirine group
bonds with any
region.
To
generates
a
neighbouring
identify
this
mapping
of the
amino acid,
anchoring the peptide
the cross-linked
ATP-splitting site, i.e.,
a
products
digests separated by
"receptor" region.
labeled
region
was
the
reactive carbene which forms covalent
of the radioactive fractions
binding peptide
peptide
highly
region
different proteases and the
Sequencing
modified. The truncated pump
were not
peptides by photoactivation. Upon photolysis
by
to its
reversed-
phase
degradation
Edman
N-terminally modified
The
located between the
within the second
a
region within
domain which is assumed to be involved in the
coupling
HPLC.
led to the
calmodulin-
ATP-binding
cytoplasmic loop
modified at the C terminus labeled
receptor
cleaved with
were
and the
of the enzyme. The
the first
of ATP
cytoplasmic
hydrolysis
to
Ca2+ translocation (transduction domain). The picture that emerges from these
studies shows that the
its first and second
hinder the free
calmodulin-binding
cytoplasmic units;
access
domain in the
it is easy to
resting pump bridges
imagine
of the substrates to the active site
causing
how this could
inhibition.
3
RIASSUNTO
L'interazione del sito di
legame
per la calmodulina
(Ca2+)
importante
e un
ripido gradiente di Ca2+ diretto
sua
origine
elettrica
o
secondo messagero in sistemi
verso
1'interno della cellula
primi messaggeri produce
da altri
cellulare. Le pompe del Ca2+
citoplasma
concentrazione intracellulare dello ione
nel
importanti
il
terminare
endo(sarco)plasmatico pompano
quelli
della membrana
differenze
loro
maggiori
porzione
sito
plasmatica
responsabile
in
per il
legame
Gli
lo pompano nello
con
precedents
e
cambia la
lo ione. Questi cambiamenti conformazionali
proteine
con
che
legano
la calmodulina. II
hanno
suggerito
producendo
che il sito di
la
e
produce
impiegata per
contenente il sito di
Peptidi
per la calmodulina della pompa
con
calpaina
e tornata
ad
dell'enzima intatto in
peptidi
la calmodulina,
attivato.
legame
la calmodulina
dovevano
produrre
un
livello
assenza
legarsi
ad
a una
generando
della
stati
un
frammento
aggiunti
e
al sito di
al frammento
stata dimostrata:
approssimativamente corrispondente
regione specifica
il loro effetto inibitore. Per identificare
che
C-terminale
corrispondenti
di calmodulina. Questi risultati
una
agisca
regione
legame
porzione
un' inibizione della sua attivita
e
lega
proteasi Ca2+-dipendente
sintetici
sono
sua
affinita per il Ca2+.
rimuovere dalla pompa la
legame per
completamente
la
alia pompa
dei cambiamenti conformazionali
rimuovono l'inibizione. Durante questa tesi la
e stata
permettono
attivita; il
sua
una
quando
sua
legame per
inibizione della
un
calmodulina al dominio
l'attivita
modulatore
suo
inibitore intrinsico della pompa del Ca2+: il dominio si
generato
un
conformazione
propria
come
legame
hanno
reticolari. Un
stato localizzato aU'interno
e
La calmodulina
precedenti
enzimatico
mentre
plasmatica
quelle
a
Studi
calpaina
reticolo
extracellulare. Le
spazio
rispetto
del calcio aumenta l'attivita ATPasica dell'enzima
dell'enzima
del
enzimi
di pompa si trovano nella
tipi
della calmodulina
di
cioe
sono
compartimenti intracellulari,
al loro C terminale
piu
responsabile
lega Ca2+ la quale
che
interazione
segnale.
Ca2+
segnale,
del
presente prima
suo
segnali
flusso di Ca2+ nel
un
dell'attivazione di diversi enzimi. Si tratta di
intracellulare
interagisce
e
carbossiterminale: le pompe della membrana
di questo dominio in studi
proteina
il
II
essenziali nel ristabilire la
sono
che si riscontrano nei due
circa 200 amino acidi in
biologici.
essenziale per la
La stimolazione di cellule da ormoni, da
segnale.
funzione di
la pompa
plasmatica
del calcio della membrana
Lo ione calcio
con
a
quello
suggerivano
che i
aU'interno dell'ATPasi per
questa regione "recettrice"
si
4
sono
sintetizzati dei
fenilalanina sia nella
analogo
contenente
fotoattivabili
peptidi
un
peptidi
calpaina
pompa
erano
in
stato
dunque modificato
del gruppo diazirinico genera
covalenti
alia
sua
sono
con
un
quelli
coi
peptidi
con un
con
gruppo acetilico triziato. I
differenti
degradazione tipo
Edman
"recettrice". II sito di
legame
terminale
regione
catalitico
marca
una
responsabile per
secondo dominio
terminale
rappresenti
nell'accoppiamento
un
ponte
riposo;
e
tra la
prima
facile
e
sono state
situata tra il dominio
una
dell'enzima. II
aU'interno del
il dominio di
primo
con
la seconda unita
come
il
legante
regione
peptide
dominio
trasduzione,
mostra che il sito di
immaginarsi
marcati
prodotti
separati
sequenziate
all'identificazione della
portando
dell'idrolisi dell'ATP
emergente da questi studi
i
regione
i frammenti risultanti
e
l'idrolisi dell'ATP,
regione
legami
vicinanze, ancorando il peptide
sue
proteasi
da
regione
per la calmodulina sintetico modificato all'N
citoplasmatico
marca una
si suppone
generato
carbene altamente reattivo che forma
tramite HPLC in fase inversa. Le frazioni radioattive
tramite
con un suo
stati marcati
tramite fotoattivazione. La fotolisi
"recettrice". Per idenbficare questa
digeriti
sono
modificati. II frammento della
non
peptidi
residuo di
un
C-terminale
di inibire il frammento
aminoacidi situati nelle
gli
regione
stati
grado
la stessa efficienza di
con
e
quella
gruppo diazirinico. Questi
radioattivamente modificando l'N terminale
fotoattivabili
rimpiazzando
N-terminale che in
regione
una
trasporto
legame per la
citoplasmatica
questo impedisca
substrati al sito attivo, causando un' inibizione.
ATP
e
il sito
che si trova nel
modificato al C
citoplasmatico
che
regione implicata
di Ca2+. II
quadro
calmodulina forma
dell'enzima in stato di
il libero
accesso
dei
5
ZUSAMMENFASSUNG
Die
Wechselwirkung zwischen
der
Calmodulinbindungsdomane
und'der Kalzium Pumpe der Plasmamembran
(Ca2+)
Das Kalzium Ion
Systemen.
ist ein
Das steile Ca2+-Gefalle
unentbehrlich fur seine
Hormone, elektrische
sekundarer Botenstoff in
wichtiger
Signalfunktion.
Signale
Ca2+-Fluss ins zellulare Zytoplasma. Die
ursprungliche
Die
oder andere
Enzyme
des
intrazellulare
Botenstoffe erzeugt einen
Ca2+-Pumpen
Konzentration des Ions, die
wiederherzustellen, d.h., sie sind wichtig,
endo(sarko)plasmatischen
der Zelle durch
Stimulierung
primare
biologischen
das Innere der Zelle ist
gerichtet gegen
vor
dem
um
sein
sind essentiell,
vorhanden war,
Signal
Signal
Retikulum
zu
beenden. Die
Ca2+
pumpen
wahrend die der Plasmamembran
Kompartimente,
die
um
in
in den
es
extrazellularen Raum pumpen. Die grossten Unterschiede zwischen den beiden
Pumpen
findet
man
in ihrem C-terminalen Teil
Pumpen, verglichen
zusatzliche
mit den retikularen
bindungsdomane
ihrem
in
Aminosauren
wurde durch
C
vor:
die Plasmamembran
haben
Enzymen,
Eine
Terminus.
vorhergehende
ungefahr
200
Calmodulin¬
Studien in dieser
Region
identifiziert. Calmodulin ist ein intrazellularer Modulator, der fur die
Aktivierung
verschiedener
Ca2+-bindendes Protein
Ion
Wechselwirkung
Ca2+-Pumpe
Affinitat.
,
verandert,
wenn es
Bindung
vergrossert die ATPase-Aktivitat des Enzyms und
Vorhergehende
die Domane bindet
Inhibition seiner
Studien
Aktivitat; die
konformationellen
Veranderungen,
wurden dem
im
Protease
dass
an
die Domane fiihrt
Calpain,
zu
um
den C-
entfernen,
wurde
erzeugt.
Calmodulinbindungsdomane entsprachen,
festgestellt:
und eine Inhibition
die Aktivitat kehrte
zu
einem Zustand
zuriick, der ungefahr dem des intakten Enzyms in Abwesenheit
Calmodulin
vergleichbar
war.
die
Ca2+-Pumpe wirkt:
Enzymfragment
Calpain-erzeugten Fragment zugegeben
seiner Aktivitat wurde
die
der
die die Inhibition aufheben. Wahrend
aktiviertes
die der
an
und verursacht eine
Enzym
Calmodulin
Ca2+-abhangige
vollstandig
Synthetische Peptide,
von
ein
seine Ca2+-
Vorschlag,
Calmodulinbindungsdomane enthalt,
terminalen Teil, der die
ein
Region
Bindung
dieser Doktorarbeit wurde die
benutzt, und
zum
als intrinsischer Inhibitor der
eine bestimmte
an
fuhrten
um
mit dem
erlauben
Veranderungen
mit Calmodulin-bindenden Proteinen. Seine
Calmodulinbindungsdomane
zu
verantwortlich ist. Es handelt sich
konformationelle
Diese
interagiert.
Enzyme
das seine Konformation
Diese
Ergebnisse
von
deuteten darauf hin, dass die
6
Peptide
an
eine
spezifische Region
inhibitorische
ihre
Wirkung
identifizieren, wurden
Phenylalanin
Analog,
die
"Rezeptorregion"
photoaktivierbare Peptide synthetisiert,
das eine Diazirin
Gruppe enthielt,
photoaktivierbaren Peptide
erzeugte ATPase Fragment
inhibieren. Das
photoaktivierung
mit derselben
eingeht
verankert. Um diese
Peptide
Region
zu
der Diazirin
Peptid
"Rezeptorregion"
"Rezeptorregion".
synthetische, N-terminal-modifizierte,
markiert
Bindungsdomane
und
der
und dies fuhrte
eine
die
Region,
Asparaginsaure,
Reaktionzyklus phosphoryliert wird, liegt,
zytoplasmatischen
Fragmente
Die radioaktiven Fraktionen wurden
sequenziert
Die
ein
markierten Produkte
mittels Edman-Abbau
bindungsdomane
durch
Peptiden
Gruppe erzeugt
der
an
identifizieren, wurden die
Umkehrphasen-HPLC aufgetrennt.
Calpain-
mit den benachbarten
Bindungen
und dadurch das
Acetyl Gruppe
wie die unmodifizierten
Wirkung
Photolyse
wurden durch
mit verschiedenen Proteasen verdaut und die daraus resultierenden
Peptid
zu
in denen ein
konnten das
wurde dann mit den
Fragment
modifiziert. Die
hoch reaktives Carben, das kovalente
Aminosauren
ersetzt. Diese
des N Terminus mit einer trizierten
radioaktiv markiert. Die
mit
um
Rest sowohl im N- als auch im C-terminalen Teil mit einem Phe-
Modifizierung
Peptide
innerhalb der ATPase binden mussten,
auszuuben. Um diese
eine
zur
Identifizierung
Calmodulin¬
zwischen
welche
Region,
der
ATP-
der
durch
ATP
im
die sich in der zweiten
Domane der ATPase befindet. Das C-terminal-modifizierte
markiert eine
Region,
die sich innerhalb der ersten
zytoplasmatischen
Domane befindet. Man vermutet, dass diese die Transduktionsdomane
darstellt, d.h.,
eine
Ca2+-Transport
dass
die
Region,
die in der
involviert ist. Das
Kopplung
aus
Calmodulinbindungsdomane
zytoplasmatische
Einheit des
Enzyms
ATP-Hydrolyse
die
erste
und
im ruhenden Zustand
einfach, sich vorzustellen, wie das den freien
Steile verhindert und eine Inhibition
der
mit dem
diesen Studien entstehende Bild
zur
Zugang
Folge
hat.
die
uberbruckt;
der Substrate
zur
zeigt,
zweite
es
ist
aktiven