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Unità Operativa: CNR-ISPA
Bioindustry Park S. Fumero
Colleretto Giacosa (TO)
Metodi di analisi di secondo livello mediante
spettrometria di massa per la conferma di
campioni contenenti tracce di allergeni
Maria Gabriella Giuffrida
Roma , 25 settembre 2013
Metodi di analisi di secondo livello mediante spettrometria di massa per la conferma di campioni contenenti tracce di allergeni
Messa
a punto
del metodo per
per la
ricerca di latte in
Fare
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inserire
tracce mediante spettrometria di massa
R
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un'immagine
Il concetto dei “signature peptides”
ü
ü
ü
ü
L’idea è di seguire alcuni peptidi appartenenti a proteine allergeniche
o semplicemente a proteine dell’alimento che si voglia cercare in
tracce attraverso l’uso della spettrometria di massa.
Le proteine vengono estratte dagli alimenti che si vogliono testare e
digerite con un enzima (di solito tripsina) in modo da generare un
“pool” di peptidi
I peptidi vengono separati mediante un sistema cromatografico
HPLC accoppiato a spettrometri di massa (trappola ionica o tripli
quadrupoli) e caratterizzati in base al loro rapporto massa/carica e il
loro spettro di frammentazione
Fra tutti i peptidi generati si cercano solo quelli che in precedenza
sono stati prescelti come peptidi caratteristici delle proteine
dell’alimento in tracce e per aumentare in sensibilità si cercano
soprattutto frammenti specifici della loro frammentazione (Multiple
Reaction Monitoring MRM)
Metodi di analisi di secondo livello mediante spettrometria di massa per la conferma di campioni contenenti tracce di allergeni
dei “signature
peptides”
FareIl concetto
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Le
proteine vengono digerite di solito con l’enzima tripsina che taglia
un'immagine
specificatamente dopo le lisine (K) e le arginine (R) liberando i peptidi
R triptici
I
D-D-W-H-T-S-S-A-G-T-R-A-P-NC
N-K-D-K-N-D-L-L-G-G-I-V-H
E
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K
K
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K
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S
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S K
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Pool di
peptidi
triptici
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un'immagine
R
Caratteristiche ottimali per la selezione dei
I“signature peptides” teorici
C
E
R Grandezza compresa fra 800-2000 Dalton
C Assenza di cisteine
ASe è possibile assenza di metionine
F Assenza di modifiche post-trasduzionali (siti di glicosilazione e fosforilazioni)
I No “missed cleavage” ossia una sola arginina o lisina nella sequenza
NUna sequenza aminoacidica unica e caratteristica per l’alimento
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Studio delle sequenze aminoacidiche dell’α-S1 caseina e della
β-lattoglobulina di latte vaccino
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1-DE SDSI PAGE Latte
Nmagro NIST
(SRM 1549)
A
L
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200
116.3
97.4
66.3
55.4
36.5
31.0
21.5
α S1-caseina
1
mklliltclv avalarpkhp ikhqglpqev lnenllRffv apfpevfgKe
51
kvnelsKdig sestedqame dikqmeaesi ssseeivpns veqkhiqked
101
vpseRylgyl eqllrlkkyk vpqleivpns aeerlhsmke gihaqqKepm
151
igvnqelayf ypelfrqfyq ldaypsgawy yvplgtqytd apsfsdipnp
201
igsensektt mplw
14.4
6.0
β-lattoglobulina
1
livtqtmKgl diqkvagtwy slamaasdis lldaqsaplr vyveelkptp
51
egdleillqK wendecaqkk iiaektkipa vfkldainen Kvlvldtdyk
101
kyllfcmens aepeqslvcq clvrtpevdd ealekfdKal kalpmhirls
151
fnptlqeeqc hi
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Studio delle sequenze aminoacidiche dell’α-S1 caseina e della
β-lattoglobulina di latte vaccino
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Schema di uno spettrometro di massa
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La formazione dello ione molecolare
un'immagine
R
Esempio di peptide triptico: SPAFDSIMAETLK
I
C Peso molecolare: 1409.6 D
E Per effetto della protonazione può prendere un solo protone e pesare
R 1410.6 D oppure prendere 2 protoni e pesare 1411.6. Poiché gli
C spettrometri di massa registrano un rapporto massa su carica,
A i valori saranno:
F 1410.6 m/z
705.8 m/z
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Analisi MS/MS di un peptide da cui si ottiene lo ione molecolare
[M+H]+ (a), lo spettro di frammentazione (b) e, quindi la sequenza
amminoacidica (c).
y4
y3
y2
y1
c)
Relative Abundance
Ile---Phe---Val---Gln--Lys
b1
b2
b3
634.4
100
95
85
80
b2 261.0
95
[M+H]
+
a)
90
100
b4
b)
90
85
y3
80
75
75
70
70
65
65
60
60
55
55
50
50
45
45
40
374.2
y2
275.2
b3 375.1
40
635.4
35
35
30
30
25
25
20
20
15
15
10
10
5
5
632.5
0
200
250
300
350
400
450 500
m/z
550
600
650
700
750
360.0
258.2
257.1
233.1
b4 y4
488.1521.3
315.1
617.4
403.1 460.2
506.2
339.2 377.3 443.7
616.4
522.2
618.4
555.3
287.2
194.1
0
200
250
300
350
400
450
500
m/z
550
600
650
700
750
R
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Fare clic sull'icona
perla inserire
Caratteristiche
ottimali per
selezione dei
“signature
peptides” in pratica
un'immagine
ü
Buon recovery della proteina di partenza dalle matrici alimentari
ü
Buona capacità di ionizzazione ed un alto segnale m/z
ü
Buona separazione cromatografica
ü
Buon spettro di frammentazione
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un'immagine
Analisi dei peptidi triptici del latte in polvere NIST
(SRM 1549) mediante LC/MSD Trap XCT Plus Agilent in
modalità FullScan-Auto-MS(n)
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m
8.7
5
4
/z
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C
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Fare clic sull'icona per inserire
un'immagine
2.9
69
m/
z
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Fare clic sull'icona per inserire
un'immagine
m
0.6
8
8
/z
Fare clic sull'icona per inserire
Messa a punto del metodo MRM
un'immagine
(Multiple
Reaction Monitoring) sui 3 peptidi selezionati
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Fare clic sull'icona per inserire
Messa a punto del metodo MRM sui 3 peptidi selezionati
un'immagine
R
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I
m
8.7
45
m
0.6
8
8
m
2.9
9
6
/z
/z
/z
Curva di
Fare per
clicilsull'icona
calibrazione
latte inun'immagine
polvere NIST
R 1549)
(SRM
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per inserire
Fare clic sull'icona per inserire
un'immagine
PROTOCOLLO di ESTRAZIONE DEI BISCOTTI FORNITI DAL DFS
Università Piemonte Orientale
R
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C
E
R
Provati diversi protocolli di estrazione delle proteine (kit ELISA o Home
C •made)
A•Utilizzati 10 mg di polvere di biscotto e sciolti in 200 µLdi tampone
Scelto un tampone home made contenente NH4HCO3/(NH4)2CO3 +1%
F •SDS
I •La temperatura di estrazione ottimale è di 60 °C
delle proteine in Metanolo/Cloroformio
N••Precipitazione
Ridisciolto il pellet in NH4HCO3 e pronto per la digestione triptica
A
L
I
Curva di calibrazione
Fare
sull'icona
ottenuta
con clic
i biscotti
prodotti
per il progetto
un'immagine
R
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per inserire
300 ppm
Nist
R
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N
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Fare clic sull'icona per inserire
un'immagine
150 ppm
Nist
75 ppm
Nist
25 ppm
Nist
Fare clic
sull'icona
inserire
Analisi
di fette
biscottateper
commerciali
dichiarate
senza latte (ma in etichetta “può
un'immagine
R contenere tracce di latte”)
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Analisi di biscotti commerciali dichiarati senza latte
Fare clic sull'icona per inserire
(ma in etichetta “può contenere tracce di latte”)
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un'immagine
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un'immagine
RINGRAZIAMENTI
Lo staff del LIMA
presso il Bioindustry
Park
S. Fumero
-Elena Acquadro
-Davide Corpillo
I colleghi dell’ISPACNR
-Cristina Baro
-Cristina Lamberti
-Lorenzo Napolitano
GRAZIE per l’ATTENZIONE