Gli Organismi Estremofili:
dalla Inesplorata Biodiversità
alla Biotecnologia del Futuro
Mosè Rossi
Dipartimento di Biologia Strutturale e
Funzionale
Università Federico II Napoli
Istituto di Biochimica delle Proteine
CNR Napoli
In oltre 3.8 miliardi di anni di vita sulla terra, i
microrganismi
hanno
avuto
un’influenza
determinante
sull’equilibrio
ecologico
e
geochimico del pianeta, sono testimoni della
storia dell’evoluzione biologica e agiscono da
veri e propri biosensori della Natura.
Infatti, le attività metaboliche, le dinamiche
evolutive e i processi ecologici delle popolazioni
microbiche hanno effetti sui flussi di energia e
materia nel mare, sulla terra e nell’atmosfera, e
perfino sui cambiamenti globali del clima. I
microrganismi catturano e processano l’energia
e guidano i maggiori cicli degli elementi.
Grazie ai progressi tecnologici e alla convergenza
di microbiologia, ecologia, genomica, geologia e
oceanografia, lo studio dei microrganismi ha
avuto negli ultimi anni uno sviluppo esplosivo ed
ha
permesso
di
valutare
la
diversità
e
l’importanza dell’attività microbica nelle nicchie
ecologiche più remote.
Ma quali sono i limiti della biosfera microbica?
•
Una visione antropocentrica dell’Universo ha fatto ritenere, per il
passato, che le condizioni chimiche e fisiche che permettono ai viventi
di crescere e riprodursi siano comprese tra le temperature di 10 e 40°C,
comprendano soluzioni saline non superiori a quelle dell’acqua del mare
e abbiano una moderata acidità o alcalinità alla pressione atmosferica.
•
L’esplorazione di habitat estremi considerati, un tempo, al di fuori della biosfera,
ha rivelato che essi sono ricchi di vita. Sono stati trovati organismi in grado di
crescere e riprodursi soltanto in condizioni ritenute non compatibili con la vita.
•
Tali scoperte hanno rivoluzionato la concezione dei limiti di temperatura, di
salinità, di acidità o alcalinità, di pressione che consentono la vita stessa.
•
Questi microrganismi sono stati denominati “estremofili” e sono stati
trovati dovunque siano stati cercati.
CATALOGAZIONE DEI MICRORGANISMI
Mesofili: temperature moderate
Termofili / Ipertermofili: alte temperature
Acidofili / Alcalofili: condizioni acide/ basiche
Alofili: alte concentrazioni saline
Psicrofili: basse temperature
Barofili: alte pressioni
Temperature limits for life
The highest and lowest temperature for each major taxon is given. Archaea are in red, Bacteria in blue, algae in
light green, fungi in brown, protozoa in yellow, plants in dark green and animals in purple.
Habitats degli ipertermofili terrestri …
Hydrothermal sites on Earth
Solfataric fields
Hydrothermal vents
Marine “Black smokers”
Greetings from Vulcano Solfatara
Pozzuoli (Napoli) - Italy
Pozze di fango
bollente
Fumarola
S. solfataricus home
Sorgenti calde
Sulfolobus solfataricus 80°C
Archaeoglobus fulgidus 80°C
“Black smokers”
Pyrodictium occultum 110°C
Pyrococcus furiosus 90°C
“Lost city” (white smokers)
Methanopyrus kandleri 90°C, 2000 m
- T= 40-90 °C
- pH molto basico
- camini di carbonato bianco
- Archaea metanogeni
Proteobacteria 0°C,
Proteobacteria 0°C, - 3000 m
Ferroplasma acidophilum pH 1
Bacillus sp. pH 10.5
Halobacterium salinarium
20% NaCl
Halobacterium japonicum
30% NaCl
Methanobacter 40-60°C
La recente pubblicazione della sequenza del genoma del più
abbondante e diffuso batterio marino il Pelagibacter ubique ci
ricorda il vasto universo microbiologico che ancora deve essere
esplorato.
Questo genoma, di 1.3 milioni di coppie di basi, è il più piccolo di
tutti gli organismi noti viventi non parassiti sul pianeta e la sua
altamente essenziale sequenza genica gli dà una grande
competizione per riprodursi negli ambienti in cui la
concentrazione dei nutrienti è bassa come nel mar dei Sargassi.
Analisi di DNA di carotaggi a differenti profondità sotto il Pacifico
hanno indicato la presenza di attive comunità di microrganismi e
cambiamenti nella biodiversità microbica che è accoppiata alle
variazioni nella composizione chimica dei sedimenti.
Nel 2002 fu scoperto un nuovo archeon ipertermofilo
chiamato Nanoarcheum equitans che vive nei camini
sottomarini a 90°C.
Le sue cellule colorate di rosso misurano solo 400
nm e crescono attaccate a un altro archeon del
genere Ignicoccus.
Il genoma del nanobatterio è di 0.49 milioni di coppie
di basi con 552 sequenze di DNA codificanti di circa
800 paia di basi per gene.
I meccanismi che consentono il mantenimento delle funzioni
cellulari in condizioni di vita estrema sono oggetto di intensi
studi.
Importanti
innovazioni
tecnologiche
nei
metodi
di
campionamento e filogenesi molecolare, che non richiedono la
coltivazione dei microrganismi, hanno reso possibile una
valutazione della diversità ed importanza dell’attività microbica
nelle nicchie ecologiche più remote.
Tali studi hanno chiarito che, per esempio, il sottosuolo sia
terrestre che marino, rappresenta l’habitat di elezione di miliardi
di microbi che costituiscono circa il 50%della biomassa totale
della terra.
Le dimensioni di questi organismi sono di circa 500-600 nm.
Recentemente sono stati scoperti organismi che per le loro
dimensioni sembrano sfidare le leggi della biologia.
I nanoarchea ed i nanobatteri hanno dimensioni paragonabili o
addirittura inferiori ad alcuni virus.
Un po’ di numeri: dimensioni
Parvovirus
(il più piccolo virus)
20 nm
Nanoarchaeum equitans
(il più piccolo archaeon)
400 nm
Pelagibacter ubique
(il batterio più abbondante)
500 nm
Nanobacterium
(il più piccolo batterio)
20-150 nm
Mimivirus
(il più grande virus)
400 nm
Escherichia coli
2000-6000 nm
Un po’ di numeri
Numero e biomassa di procarioti nel mondo
HABITAT
Numero di cellule
(x1028 )
Contenuto in carbonio della
biomassa (x1015 g)
Acque
12
2.2
Sottosuolo oceanico
355
303
Suolo
26
26
Sottosuolo terrestre
25-250
25-215
Totale
415-640
353-546
I procarioti costituiscono circa metà del protoplasma dei
viventi .
Contengono, rispetto alle piante:
- il 60% del C
- 10 volte più N e P
Un po’ di numeri
Abbondanza dei procarioti in differenti ecosistemi
HABITAT
Numero di cellule
Acqua di mare (superficiale)
5x105 cellule/ml
Acqua di mare (profonda)
5x104 cellule/ml
Acqua dolce
1x106 cellule/ml
Suolo
1x107 cellule/g
Rumine
1x1015 cellule/individuo
Intestino umano
1x1015 cellule/individuo
L’apparato digerente animale è uno degli ecosistemi più popolati da
microrganismi
Un po’ di numeri
Coltivabilità dei procarioti da differenti ecosistemi
HABITAT
Coltivabilità (% di specie
coltivabili sul totale)
Acqua di mare
0.001-0.1
Fiumi
0.25
Laghi
0.1-1
Fanghi attivati
1-15
Sedimenti
0.25
Suolo
0.3
I TRE DOMINI DEI VIVENTI
Bacteria
Archaea
Eucarya
Sulla scala temporale, la comparsa dei procarioti
(prima Archaea e poi Batteri) ha preceduto di molto
quella degli Eucarioti
Tra tutti gli
organismi
viventi, i
procarioti
(sia Batteri
che Archaea)
presentano la
maggiore
diversità
genetica e
metabolica
Tecniche classiche per l’isolamento di specie microbiche
Campioni da differenti habitats
Differenti terreni di coltura
Tecniche classiche per l’identificazione di specie microbiche
E’ noto che solo una minima parte dei microrganismi è
stata identificata e si stima che solo circa 1% sia
coltivabile.
Per ovviare a questa limitazione, si è sviluppata la
Metagenomica, cioè il sequenziamento dei genomi
mediante estrazione diretta o clonaggio del DNA da
comunità di microrganismi estratti dal suolo o da
filtrati di acqua di mare.
La metagenomica, sfruttando la Biodiversità, ha anche
una grande potenzialità d’impatto sulla ricerca
industriale a tutti i livelli per lo sviluppo di nuove
molecole e di tecnologie rispettose dei problemi
ambientali.
La metagenomica, sfruttando la Biodiversità, ha anche una grande
potenzialità d’impatto sulla ricerca industriale per lo sviluppo di
nuove molecole e di tecnologie rispettose dei problemi ambientali.
Approcci high throughput per lo studio
della biodiversità molecolare dei microganismi
Campione ambientale
COLTIVAZIONE
Strategie Selettive
di isolamento
METAGENOMICA
Estrazione del DNA
Costruzione di una libreria
Analisi delle sequenze
Con questa tecnologia il gruppo di Craig Venter, che
dopo il sequenziamento del genoma umano, ha
fondato
l’Institute
for
Biological
Energies
Alternatives, alla ricerca di microrganismi che
producono idrogeno, ha isolato da filtrati di acqua di
mare migliaia di nuove specie batteriche e milioni di
geni sconosciuti.
Inoltre, grazie alle tecniche di sequenziamento
ultraveloce su larga scala, è stato finora sequenziato
il genoma completo di centinaia di microganismi
marini.
Il gruppo di Venter sta ora affrontando un’altra sfida
che ha sollevato molte discussioni ed opinioni
controverse: creare la vita e utilizzarla per produrre
energia pulita.
L’idea è di creare un microrganismo sintetico con un corredo genico
minimo, a cui aggiungere geni per la produzione di energia pulita.
Il Gruppo di Craig Venter sta cercando di introdurre in questo
microbo, creato in laboratorio, le sequenze dei geni delle vie
metaboliche per degradare la cellulosa fino alla produzione di
etanolo, partendo da materiale vegetale di scarto, senza aggravio per
l’agricoltura, come invece accade con gli attuali metodi che utilizzano
mais o grano.
Scoperte attese dallo studio
della biodiversità molecolare dei microrganismi
 Inventario degli organismi viventi e ricostruzione della storia
dell’evoluzione.
 Informazioni sull’origine della vita e sulla possibilità che la vita esista al
di fuori della Terra (esobiologia).
Dettagli dei meccanismi biochimici, genetici e fisiologici
dell’adattamento a diversi ambienti.
 Identificazione di nuovi metaboliti ed enzimi per applicazioni in campo
medico, agroalimentare ed industriale.
 Sviluppo di sistemi genetici per utilizzare i microrganismi come
“fabbriche cellulari”.
Biodiversità e Biotecnologie
Nelle Biotecnologie, sono le caratteristiche dei sistemi biologici
usati, in relazione alla loro specificità funzionale e stabilità, a
fissare i limiti operazionali di un processo.
La scoperta di nuovi organismi che vivono in maniera ottimale
in ambienti particolari, con il conseguente adattamento delle
biomolecole indispensabili alla loro vita, allargano i limiti delle
condizioni operative nell’industria sia per implementare
processi tradizionali, sia per disegnarne nuovi per prodotti
innovativi.
Un approccio importante è l’utilizzo della biodiversità poiché la
diversità dei microrganismi, le molecole che contengono ed i
processi che essi svolgono sono realmente immensi.
.
• I risultati ottenuti negli ultimi anni dallo studio degli
enzimi isolati da microrganismi estremofili hanno
generato approcci innovativi per la comprensione del
rapporto tra struttura e funzione delle proteine e portato
al convincimento che la loro utilizzazione nei processi
industriali apre una nuova era nel campo delle
Biotecnologie.
• Si sono trovati enzimi stabili ed attivi da pH 1 a 11 a
temperature tra 0°C e oltre 100°C, a elevate
concentrazioni saline, nei solventi organici, nei
detergenti, etc.
• Si prevede che il loro utilizzo potrà ridurre la distanza
tra processi chimici e biologici.
ENZIMI
• Gli enzimi da ipertermofili sono termostabili e attivi ad alte
temperature (termoattivi)
geneticamente codificate
e
le
loro
proprietà
sono
• Sono stabili e spesso attivi in solventi organici
• Sono generalmente stabili verso i comuni denaturanti delle
proteine (urea, guaridinio idrocloruro, SDS, etc.)
• Hanno un’attività ottimale ad una temperatura vicina a quella
di crescita ottimale dell’organismo da cui derivano
• Sono esempi naturali di enzimi termostabili, termofilici e
resistenti ai solventi e possono essere usati come modelli
naturali per disegnare e costruire proteine con nuove
proprietà.
Proprietà richieste per il
processo
Produzione di una
libreria di enzimi
Enzimi candidati
Evoluzione in vitro
ingegneria enzimatica
Enzimi con le
proprietà richieste
Applicazione degli
enzimi nei processi
biocatalitici
screening secondario
Enzimi da estremofili
FONTE
CRESCITA
ENZIMI
APPLICAZIONI
Termofili/
60-80 C (termofili)
80
(ipertermofili)
Proteasi
Detergenti, industria alimentare, della birra,
panificazione
Degradazione di amido, cellulosa, pectina,
chitina, industria tessile e della carta
Detergenti, reazioni stereo-specifiche,
biosintesi organica
PCR
Reazioni di ossido-riduzione
ipertermofili
Glicosil idrolasi
Lipasi, esterasi
DNA polimerasi
Deidrogenasi
Psicrofili
15
Proteasi
Glicosil idrolasi
Lipasi
Detergenti, industria alimentare
Degradazione di amido, cellulosa, pectina,
chitina, industria tessile e della carta
Detergenti, industria alimentare e cosmetica
Alofili
2-5 M NaCl
Proteasi
Deidrogenasi
Produzione di peptidi
Biocatalisi in solventi organici
Alcalofili
pH 9
Proteasi, cellulasi
Detergenti, industria alimentare
Acidofili
pH 3
Amilasi
Proteasi, cellulasi
Ossidasi
Degradazione di amido
industria alimentare
Desulfurizzazione del carbone
Piezofili
fino a 130 MPa
Idrolasi
Vari
Industria alimentare
Produzione di antibiotici
LA POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
L’ amplificazione dei frammenti di DNA con questa tecnologia ha portato ad una
rapida espansione della Conoscenza nelle scienze della vita, in particolare nella
biologia molecolare e cellulare, nell’ ingegneria genetica e nelle biotecnologie.
La Polymerase Chain Reaction (PCR)
Una molecola
21
22
23
24
Consiglio Nazionale delle Ricerche
Institute of Protein Biochemistry
La “Polymerase Chain Reaction” (PCR)
•La scoperta di una nuova polimerasi dal batterio termofilo Thermus aquaticus
eliminò il problema dell’aggiunta dell’enzima ad ogni ciclo dopo il passo dii
denaturazione, portando ad un rapido sviluppo della tecnica PCR .
• Successivamante, dagli Archaea sono state isolate e portate sul mercato varie
DNA polimerasi che differiscono dalla Taq in quanto:
• le DNA polimerasi da Archaea posseggono attività ”proofreading “, mancano
dell’associata attività esonucleasica 3’-5’, anche se hanno una processività
limitata in vitro;
• Il problema della bassa processività è stato superato con l’isolamento di una
DNA polimerasi archeale da Thermococcus kodakaraensis, che mostra velocità di
estensione più elevate (106-138 s-1) con bassi errori ed alta processività.
Consiglio Nazionale delle Ricerche
Institute of Protein Biochemistry
Idrolisi enzimatica dell’amido
OH
O
OH
HO
amilosio
O
O
O
HO
a(1,4)
O
OH
OH
O
O
HO
OH
OH
OH
a(1,4)
O
HO
O
H
OH
O
a(1,4)
O
O
HO
amilopectina
O
HO
OH
H
O
O
O
O
OH
O
a(1,4)
HO
O
a(1,6)
H
O
H
O
O
a(1,4)
HO
OH
H
O
O
1
3
O
a(1,4)
HO
O
1 b-amilasi
2 a-amilasi
3 pullulanasi
glucoamilasi
1
glucosio
2
H
O
Consiglio Nazionale delle Ricerche
Institute of Protein Biochemistry
Liquefazione e saccarificazione dell’amido (starch)
LIQUEFACTION
Starch slurry
35% dry solids (DS), pH 6.5
Ca++ > 40 ppm
a-amylase
Gelatinization
103 - 105°C; 3 - 7 min
Dextrine Syrup
8-15% DE
Dextrinization
95°C; 1 - 3 hrs
fungal
a-amylase
Maltose syrup
L’amido insolubile in acqua si rigonfia e gelatinizza alle
alte temperature, permettendo l’attacco delle amilasi.
glucoamylase
SACCHARIFICATION
60°C; pH 4.2 - 4.5; 48 hrs
.
L’utilizzo di una alfa-amilasi termostabile ed attiva alle
alte temperature permette che il processo di
gelatinizzaziene
e
saccarificazione
avvenga
contemporaneamente con riduzione dei costi e
dell’impatto ambientale.
Glucose syrup
95-96% DE
Consiglio Nazionale delle Ricerche
Institute of Protein Biochemistry
Produzione di High Fructose Corn Syrup
Lo sciroppo di Glucosio può essere venduto in forma liquida o cristallizato per varie applicazioni.
La maggior parte dello sciroppo di glucosio negli USA è convertito nello high fructose corn syrup
(HFCS).
Paragone del potere dolcificante
Saccarosio
Glucosio
Fruttosio
Maltosio
Lattosio
Saccarina
Aspartame
100
70
130
40
16
30,000
20,000
Una soluzione al 42% di fruttosio ha lo stesso potere dolcificante di una al 100% di saccarosio
xylose
isomerase
xylose
…ma ad alta
temperatura
(90-95 ºC)
xylulose
xylose
isomerase
glucose
fructose
SISTEMA BIOMIMETICO ENZIMATICO PER LA
CATTURA DELLA CO2
Il
crescente
aumento
nell’atmosfera
della
concentrazione della anidride carbonica (CO2)
prodotta dalle attività antropiche è ritenuta una delle
principali cause dei cambiamenti climatici della terra.
Pertanto lo sviluppo e l’impiego di tecnologie per
ridurne la concentrazione, mediante cattura e
stoccaggio, avranno un ruolo essenziale a livello
internazionale per poter produrre l’energia necessaria
allo sviluppo di ogni paese riducendo il danno
ambientale.
DIMENSIONE DEL PROBLEMA
•
Prendiamo in considerazione una centrale di 300 MW che utilizza
carbone e dà energia ad una cittadina di circa 10.000 abitanti,
•
Essa brucia circa 125 tonnellate di carbone per ora, circa 3000 T
al giorno.
•
Produce circa 290 tonnellate di CO2 per ora (2,32 T di CO2 per T di
carbone) cioè 6960 T al giorno.
•
Da questi dati si evince che la quantità di CO2 da considerare
è molto grande e che, se si sequestrasse la CO2 come carbonato di
Calcio, si produrrebbero 666 T di sale per ora e circa 16.000 T per
giorno.
•
Un automobile di cilindrata media produce circa 130 gr di C02 per
Km percorso. Ogni 100 Km un’auto produce 13 Kg di C02.
• Sorge la necessità di catturare e sequestrare la CO2 in loco
utilizzando opportune tecnologie e associando la produzione di
energia alla cattura della CO2. .
• La tecnologia più sviluppata sembra essere quella
dell’assorbimento chimico della CO2 su alcanolammine, seguite
dallo stripping con vapore, per produrre gas concentrato con
successiva sua compressione nella forma liquida che può essere
portato a un sito di sequestro generalmente geologico o marino.
• Comunque questo processo è costoso ed è problematico sia il
sequestro geologico che quello marino anche per ragioni
ecologiche e di sicurezza.
• Il sequestro della CO2 in forma di sale per uno stoccaggio di
lunga durata è molto interessante in quanto i minerali carbonato,
tipo calcite, dolomite, aragonite etc rappresentano la più grande
riserva di CO2 della terra e la geologia dimostra che se ne
possono conservare indefinitamente grandi quantità.
Ho un progetto con l’ENEL per sviluppare un sistema biomimetico per il
sequestro della CO2 prodotta in impianti di combustione.
Abbiamo isolato da organismi termofili, anidrasi carboniche stabili , che
con la loro specificità, selezionano la CO2 dagli altri gas e ne catalizzano
la velocità di idratazione per la successiva fissazione in minerali stabili
con dei contro ioni di sali, utilizzando varie sorgenti saline di scarto o
acqua di mare.
L’anidrasi carbonica è un metallo-enzima antico molto diffuso anche nei
procarioti. Fisiologicamente l’anidrasi carbonica facilita la rimozione della
CO2 dal corpo dei mammiferi.
E’ uno degli enzimi più efficienti conosciuti. Infatti una molecola di
enzima idrata circa 1.000.000 di molecole di CO2 per secondo.
E’ considerato un enzima vicino alla perfezione.
Nella Figura è riportato il meccanismo di azione dell’enzima e il principio
per l’utilizzo dell’enzima stesso immobilizzato nel processo.
Anidrasi carbonica
CO2 + H2O
HCO3- + H+
Tale sistema biomimetico offre indubbi vantaggi in quanto il processo è effettuato
in soluzione acquosa, è specifico per il sequestro della CO2, è ambientalmente
compatibile e la concentrazione della CO2 e il trasporto sono relativamente poco
costosi.
Biodiversity
Gene library
Screen
Discovery
Recover clone
Evolution
Enzyme
Small molecule
Production