CAPITOLO 3.
FARMACI ANTIRETROVIRALI:
ANTI-AIDS
3.1. Introduzione
Una fase importante per lo sviluppo di nuovi farmaci è la ricerca dinamica dei targets
molecolari con cui interagiscono.
I farmaci antiretrovirali attualmente utilizzati, o ancora in fase di studio, nella terapia
dell’AIDS possono essere classificati sfruttando le conoscenze riguardanti questi targets [1a,b] in:
1)
Modulatori dell’espressione del recettore cellulare CD4;
2)
Inbitori della fase di attacco del virus all’ospite;
3)
Antagonisti dei recettori delle chemochine;
4)
Inibitori della fusione cellulare;
5)
Inibitori della trascrittasi inversa:
5.1) Inibitori nucleosidici della trascrittasi inversa (NRTIs);
5.2) Inibitori nucleotidici della trascrittasi inversa (NtRTIs);
5.3) Inibitori non nucleosidici della trascrittasi inversa (NNRTIs);
6)
Inibitori dell’integrasi;
7)
Inibitori della trascrizione;
8)
Inibitori della proteasi (PIs);
9)
Inibitori della ribonucleasi H.
In questo capitolo è stata dedicata principale attenzione ai farmaci che inibiscono la
retrotrascrizione dell’HIV ed è stata riportata una breve trattazione delle prime quattro classi di
farmaci sopra citate. Infatti quest’ultimi potrebbero, “in futuro”, avere un ruolo importante nella
prevenzione dell’infezione virale.
29
3.1.1. Modulatori dell’espressione del recettore cellulare CD4
Per infettare una cellula l’HIV deve prima di tutto legarsi superficialmente ad essa tramite
uno specifico recettore, denominato CD4. I recettori di superficie CD4 potrebbero, quindi,
rappresentare un bersaglio farmacologico per prevenire l’attacco del virus nei confronti dell’ospite.
Recentemente, è stato notato che una molecola, la Ciclotriazadisulfonamide (CADA) (Figura 3.1),
nonché una ampia serie di suoi derivati [3], è in grado di evitare l’infezione da HIV regolando
l’espressione di questo recettore [2].
Figura 3.1: Struttura della Ciclotriazadisulfonamide.
L’azione specifica di CADA (che non altera l'espressione di alcun altro recettore cellulare)
differisce da quella dell’acido aurintricarbossilico, che lega direttamente il CD4, e da quella
dell’acetato forbol miristato che invece agisce attivando una proteina chinasi C [2].
Inoltre, si presume che CADA regoli l'espressione di CD4 a livello (post)translazionale [3],
il che renderebbe promettente un eventuale futuro impiego di questa molecola, nella terapia
antiretrovirale, in associazione con altri farmaci.
Da alcuni studi è emerso che sinergismo d’azione si può ottenere associando la
Ciclotriazadisulfonamide con NRTIs (zidovudina, lamivudina, zalcitabina, abacavir), NtRTIs
(tenofovir), NNRTIs (nevirapina, delavirdina), PIs (lopinavir, saquinavir, indinavir, nelfinavir,
amprenavir e ritonavir), inibitori della fusione (T-20 o enfuvirtide), antagonisti del corecettore
CXCR4 (AMD3100) e Lecitine estratte da Galanthus Nivalis (GNA) ed Hippeastrum (HHA) [4].
3.1.2. Inibitori della fase di attacco del virus all’ospite
Le lecitine vegetali estratte dalle piante su menzionate (Bucaneve ed Amarillo) sembrano
essere efficaci inibitori dell’attacco virale interferendo con la glicoproteina gp120 [5], presente
sull’envelope, responsabile del legame al recettore cellulare CD4, ma non con la glicoproteina
30
gp41, situata più internamente all’envelope, responsabile invece delle fasi successive al legame.
Questo meccanismo d’azione è stato confermato da evidenze sperimentali su virus mutanti per la
glicoproteina gp120. Infatti,
l’N-glicosilazione di residui T ed S (treoninici e serinici) di
quest’ultima, e non della gp41, ha portato alla selezione di ceppi mutanti resistenti alle lecitine
vegetali ma non agli antagonisti dei recettori per le chemochine (AMD3100) o agli inibitori della
fusione (T-20) [6].
Le lecitine vegetali rappresentano una classe unica di molecole per ciò che concerne il loro
profilo di resistenza [6], ma sono anche dotate di interessanti proprietà (biodisponibilità, stabilità
della formulazione, efficacia e sicurezza) che le rendono i principali agenti antivirali candidati ad un
eventuale utilizzo topico per la prevenzione della trasmissione sessuale dell’HIV [5].
Altrettanto qualificata come potenziale microbicida sembra essere la Cianovirina-N (Figura
3.2), una proteina di 11 KDa isolata originariamente dal Cyanobacterium Nostoc Ellipsosporum [7].
Figura 3.2: Cianovirina N.
La Cianovirina-N presenta un’alta affinità per la gp120: blocca il legame di quest’ultima alle
cellule bersaglio, sia che queste esprimano il recettore CD4 sia che non lo esprimano, ed inoltre
blocca il legame della gp120 al corecettore CXCR4 [8].
La Cianovirina-N può esistere in forma monomerica o dimerica come dimostrano le analisi
di cristallografia ed NMR [9].
È stato notato da altri ricercatori che anche gli agliconi di alcuni antibiotici glicopeptidici
(vancomicina, teicoplanina, eremomicina), sostituiti con gruppi di natura idrofobica, possono
presentare attività anti-HIV-1 e HIV-2, anche a basse concentrazioni molari ( M), ed essere
utilizzati per prevenirne la trasmissione sessuale [10]. Esperimenti eseguiti con alcuni prototipi
dell’aglicone della teicoplanina (Figura 3.3) hanno dimostrato la loro capacità di interferire con le
prime fasi di assorbimento virale, probabilmente legandosi alla gp120.
31
Figura 3.3: Aglicone di alcuni antibiotici di natura glicopeptidica.
I prototipi, invece, non hanno mostrato la stessa efficacia quando inoculati dopo 1-2 ore
dall’inizio dell’infezione.
Recentemente è stata identificata una nuova classe di inibitori della fase di attacco del virus
HIV-1 [il prototipo è il 4-benzoil-1-[4-metossi-1H-pirrolo[2,3-b]-piridin-3-il)ossoacetil]-2-(R)metilpiperazina (BMS - 378806) (Figua 3.4 a)], che sembra interferire con il legame tra il recettore
CD4 e la glicoproteina gp120 [11].
Figura 3.4: a) Struttura del prototipo BMS-378806; b) Composto BMS-488043.
Questo composto si lega direttamente alla gp120 in rapporto stechiometrico di 1:1, con
un'affinità di legame molto simile a quella del CD4 solubile. Il sito di binding del composto 4a è
stato localizzato su una specifica regione all'interno della tasca del recettore CD4 ove
presumibilmente si dovrebbe legare la glicoproteina gp120.
Sembra inoltre essere inattivo contro infezioni virali CD4-indipendenti e contro ceppi
mutanti per il recettore CD4; ciò conferma quanto è stato dimostrato sulla sua specificità d’azione
[12].
Le varianti resistenti presentavano il sito di binding per la gp120, sul recettore CD4,
sostituito con altri residui amminoacidici (M426L e M475I).
32
Infine, il prototipo ha mostrato un profilo farmacologico molto vantaggioso: scarso legame
ad altre proteine, buona biodisponibilità orale e bassa tossicità (negli studi preliminari su animali)
[13].
La prova che gli inibitori della fase di attacco possano effettivamente essere efficaci in vivo
contro l’infezione dell’HIV è arrivata in seguito alla progettazione del composto BMS-488043
(Figura 3.4 b), strutturalmente simile al prototipo 4a.
Anche il BMS-488043 sembra interagire, in maniera specifica, con la glicoproteina gp120
modificandone la conformazione e bloccandone il legame con il recettore CD4 [14]. In adulti
infetti, inoltre, è stato dimostrato che la sommministrazione orale di 1800 mg di BMS-488043 ogni
12 h per 8 giorni di terapia portava, dopo 14 giorni, ad una riduzione della carica virale >1.0 log10
nel 67% dei pazienti trattati.
Infine, sono stati notati: una buona tollerabilità e l’assenza di seri eventi avversi.
3.1.3. Antagonisti dei recettori per le chemochine (CCR5 e CXCR4)
Per infettare l’ospite, in seguito al legame con il recettore CD4, le particelle di HIV devono
interagire, attraverso la gp120, con un recettore cellulare CXCR4 o CCR5 (recettori per le
chemochine). CXCR4 è il corecettore presente sui linfociti-T, mentre CCR5 è il corecettore
macrofagico. Possiamo quindi distinguere, in funzione dei corecettori, due sottotipi virali: HIV Tlinfotropico (o X4) e HIV M-tropico (o X5).
CXCR4, normalmente, funziona come recettore per la chemochina SDF-1 (Stromal cell
Derived Factor), mentre CCR5 per RANTES (Regulated upon Activation, Normal T-cell
Expressed, and Secreted), MIP-1a e MIP-1b (Macrophage Inflammatory Proteins); quindi, queste
chemochine potrebbero inibire l’infezione da parte dei due rispettivi sottotipi virali (X4 e X5).
La scoperta che i recettori per le chemochine vengono utilizzati dall'HIV come corecettori
durante la fase di penetrazione all'interno della cellula bersaglio ha portato a considerare lo sviluppo
di una nuova classe di farmaci che, a differenza di quelli attualmente disponibili, andrebbero ad
interagire con molecole cellulari e non direttamente con il virus. Vari studi hanno infatti evidenziato
che il blocco farmacologico dell'entrata del virus nella cellula bersaglio potrebbe essere utilmente
associato alle terapie antiretrovirali attualmente disponibili. Con questo preciso obiettivo sono
quindi in fase di studio varie molecole che antagonizzano i recettori su menzionati:
1) Antagonisti del corecettore CXCR4;
2) Antagonisti del corecettore CCR5;
3) Antagonisti dei corecettori CXCR4 e CCR5.
33
3.1.3.1. Antagonisti del corecettore CXCR4
Il prototipo degli antagonisti del recettore CXCR4 è una molecola biciclica che è stata
denominata AMD3100 (AnorMED Inc) (Figura 3.6).
Figura 3.6: Struttura del AMD3100.
Tale composto ha mostrato specificità per il recettore CXCR4, quindi efficacia contro l’HIV
di tipo X4. Non sembra interagire, invece, con l’altro recettore per le chemochine [15].
Durante la prima fase di studi clinici, su alcuni volontari, è stato notato che la suddetta
molecola apporta un significativo miglioramento, nel tempo, della conta linfocitaria (WBC) [16].
È stato dimostrato, inoltre, che lo stesso composto è in grado di mobilitare le cellule
ematopoietiche dal midollo verso la circolazione sanguigna e, poiché si è riscontrato sinergismo
d’azione con il G-CSF (Granulocyte-Colony Stimulating Factor),
è attualmente in atto una
seconda fase di studi clinici su pazienti affetti da mieloma multiplo e linfoma non-Hodgkin.
Gli antagonisti del recettore CXCR4 sembrano essere in grado di sopprimere in vivo anche
la replicazione di virus con duplice tropismo (X4/R5 HIV) [17].
Anche in individui affetti da X4/R5 HIV o X4 + R5 HIV, si è notata, infatti, una riduzione
della carica virale dopo 10 giorni di trattamento (per infusione continua) con basse dosi di
AMD3100 [17].
AMD3100, però, è disponibile solo per via parenterale (endovenosa o sottocutanea) ed è
attivo verso ceppi virali che utilizzano il corecettore CXCR4 e non verso ceppi che impiegano il
corecettore CCR5.
Sfortunatamente gli studi di fase I/II sono stati interrotti a causa del riscontro di tossicità
cardiaca (episodi di tachicardia ventricolare).
Recentemente è stato candidato per gli stessi studi clinici un derivato di AMD3100,
AMD070.
Quest’ultimo ha mostrato importanti proprietà: oltre quella di presentare una buona
biodisponibilità dopo somministrazione orale sembra possedere una potente attività anti-HIV come
antagonista del recettore CXCR4 [18,19].
Studi di relazione struttura-attività (SAR) con analoghi biciclici hanno dimostrato che :
34
- il biciclo non è un requisito indispensabile per l’esplicazione dell’attività antivirale;
- l’apertura di uno dei due cicli con formazione di un guppo piridinometilen-amminico
comporta il mantenimento dell’attività nei confronti di HIV di tipo X4 [20].
Esempio tipico ne è dato dal composto AMD3465 (Figura 3.7). Come si può notare dalla
figura non c’è più il biciclo ma la struttura è solo parzialmente conservata.
Figura 3.7: Composto AMD3465.
Anche KRH-1636 (Figura 3.8), un altro antagonista del corecettore CXCR4, sembra essere
dotato di attività anti-HIV con un profilo farmacologico simile a quello di AMD3100.
Figura 3.8: Composto KRH-1636.
Inoltre, sembra essere ben assorbito a livello duodenale nei ratti [21] e, come AMD070, può
essere somministrato oralmente.
3.1.3.2. Antagonisti del corecettore CCR5
Tra gli antagonisti del recettore CCR5, il derivato ammonico quaternario TAK-779 (Figura
3.9.) è stato il primo nonapeptide ad avere mostrato efficacia comprovata contro la replicazione del
virus HIV-1 M-tropico (X5) (in concentrazioni nanomolari) [22]. Il sito di binding per tale
composto è stato identificato all'interno delle eliche transmembranarie (TM) 1, 2, 3, e 7 del
corecettore CCR5 [23].
35
Figura 3.9: Struttura di TAK-779.
Sfortunatamente TAK-779 non è somministrabile per via orale e provoca irritazione al sito
di iniezione.
Un’ulteriore ricerca ha condotto, quindi, all'identificazione di un’altra molecola, TAK-220
(da parte della Takeda), un antagonista del recettore CCR5, somministrabile oralmente e con
potente attività anti-HIV-1 R5 o X5 [24].
TAK-220 blocca la replicazione di HIV-1 R5 con una EC50 di 1.1 nM ed una EC90 di 13
nM. Secondo alcuni studi, la disponibilità orale di TAK-220 in ratti e scimmie, a digiuno, è stata
rispettivamente del 9.5% e del 28.5% e si è trovata maggiormente concentrata a livello linfatico,
rispetto al plasma.
Recentemente è stata riportata, in uno studio condotto da alcuni ricercatori [25], la struttura
di un composto analogo di TAK-220 (Figura 3.10).
Figura 3.10: Analogo di TAK-220.
SCH-351125 (SCH-C) (Schering-Plough) (Figura 3.11) è stato, invece, il primo
antagonista del recettore cellulare CCR5 testato clinicamente. Quest’ultimo ha mostrato potente
attività in vitro contro HIV-1 R5 ed in vivo su topi SCIDhu Thy/Liv infetti; inoltre si è notato che il
composto possiede un profilo farmacocinetico favorevole (buona somministrazione orale in ratti,
cani e scimmie) [26].
36
Figura 3.11: Composto SCH-C.
Alcuni esperimenti clinici preliminari, condotti somministrando oralmente 25 mg del
composto in esame, due volte al giorno per 10 giorni di terapia, ad un certo numero di adulti
infattati con HIV-1, hanno indicato che questo composto è in grado di ridurre la carica virale di 0.51.0 log10 [27].
Più recentemente lo studio di questo farmaco è stato abbandonato a causa del riscontro di
cardiotossicità (anomalie della conduzione cardiaca) in corso degli studi di fase I.
Partendo dal composto precedente, sono stati studiati nuovi antagonisti del recettore CCR5,
somministrabili oralmente, contenenti due gruppi simmetrici: 2,6-dimetilisonicotinamide e 2,6dimetilpirimidino 5-carbossamide.
Questi composti hanno mostrato uguale, o in alcuni casi migliore, affinità per il recettore
CCR5 rispetto a SCH-351125 [28,29].
SCH351125 e SCH-350581 (AD101) si legano su siti diversi della stessa tasca recettoriale
formata dalle eliche transmembranarie (TM) 1, 2, 3 e 7 del recettore CCR5. Questo legame
comporta un cambiamento conformazionale a livello della seconda ansa recettoriale, che sfavorisce
l’attacco della glicoproteina virale gp120 [30].
Un'altra classe di antagonisti del recettore CCR5 a basso peso molecolare è rappresentato
dalle Spirodichetopiperazine, come E913 (Figura 3.12), che inibiscono il legame di MIP-1a al suo
recettore, il flusso del Ca++ MIP 1a-dipendente e la replicazione in vitro sia del virus primario che
di alcuni suoi ceppi resistenti ad altre terapie farmacologiche [31].
Figura 3.12: Struttura di E913.
37
Tra i composti appartenenti alla classe delle spirodichetopiperazine, soltanto l’E913 sembra
possedere attività nei confronti dell’HIV, legandosi parzialmente al recettore CCR5.
Questo composto, inoltre, blocca la replicazione di HIV-1 R5 in topi HIV-1 (JRFL)-infetti
di hu-PBM NOD-SCID e possiede una biodisponibilità orale molto favorevole [32].
UK-427857 (Pfizer) (Figura 3.13), un altro antagonista del recettore CCR5, è stato
recentemente selezionato tra i farmaci candidati per la sperimentazione clinica nella terapia
dell’infezione da HIV.
Figura 3.13: Struttura di UK-427857.
Tale molecola ha mostrato una potenza eccellente nei confronti di un’ampia serie di virus
isolati che utilizzano il recettore CCR5 per entrare nell’ospite (ad una IC90 <10 nM); mentre si è
visto che è inattiva nei confronti di ceppi CXCR4-tropici [33].
È stata inoltre valutata la sua efficacia in più di 400 volontari e pazienti HIV-1 R5 infetti.
I risultati sono stati molto positivi: ben tollerato anche a dosi superiori a quelle necessarie a
bloccare il recettore CCR5.
Ancora, la somministrazione pro-die di 200 mg di UK-427857 sembra provocare, in 10
giorni di terapia, una diminuzione media della carica virale di 1.42 log10 al giorno, mentre a dosi
di 25 mg pro-die i risultati non sono altrettanto soddisfacenti: solo 0.42 log10 al giorno [34].
Infine, è stato dimostrato che la carica virale dell’R5 HIV-1 rimane bassa per almeno 10
giorni dopo l’interruzione della terapia, la qual cosa suggerisce che per il trattamento con UK427857 (e forse anche quello con gli altri antagonisti del recettore CCR5) può essere suffiente una
singola somministrazione settimanale.
Oltre agli antagonisti del recettore CCR5 su menzionati, una numerosa serie di composti
appartenenti alla classe delle pirrolidin-1,3,4-trisostituite sembra possedere buona disponibilità
orale ed elevata attività antiretrovirale [35-39].
Il composto più rappresentativo di questa serie è riportato in figura 3.14.
38
Figura 3.14: Struttura di un pirrolidina 1,3,4-trisostituita.
Il sito di legame per tale molecola sembra trovarsi a livello di una tasca del recettore
CCR5, vicino la superficie extracellulare, formata dalle eliche TM 2, 3, 6 e 7 [40].
Ulteriori studi di modellistica molecolare (Molecular Modeling) potrebbero essere incisivi
nella progettazione di nuovi composti con attività antagonista nei confronti del recettore cellulare
CCR5.
La prova del fatto che gli antagonisti del recettore CCR5 possono essere efficaci in vivo
contro l’HIV R5 è stata dimostrata per CMPD 167, in un primo momento designato come MRK-1
(Figura 3.15).
Figura 3.15: Struttura del MRK-1 o CMPD 167.
Questo composto, secondo alcuni studi, causerebbe una rapida e sostanziale diminuzione (4200 volte) della viremia nel plasma di scimmie infettate cronicamente con il SIV (Scimmian
Immunodeficiency Virus). La replicazione virale potrebbe essere parzialmente inibita in seguito alla
somministrazione vaginale del composto sotto forma di gel.
Ciò pone le basi per un potenziale utilizzo dello stesso, come componente microbicida, per
prevenire la trasmissione sessuale dell’HIV-1 [41].
L'infezione virale di cellule linfoidi umane può essere inibita anche da:
-
bacitracina;
-
anticorpi per PDI (Protein-Disulfide Isomerasi) [42].
39
PDI è un enzima cellulare che apporta legami disulfidici sulla gp120 virale, provocandone
cambiamenti conformazionali indispensabili per i successivi processi di fusione del virus [43,44].
Circa due dei nove disulfidi della gp120 subiscono la riduzione durante la sua interazione con la
superficie linfocitaria dopo il legame al recettore CXCR4 [45]. Le riduzioni PDI-mediate, che
avvengono a livello del complesso gp120/CD4/corecettore, probabilmente rappresentano lo step
finale che porta all’attivazione della gp41 che, così, diverrebbe in grado di fondersi con la
membrana cellulare aprendo la porta d'ingresso al virus.
Questo processo PDI-mediato, attualmente non ancora esplorato, potrebbe essere un
importante obiettivo farmacologico.
3.1.3.3. Antagonisti dei corecettori CCR5 e CXCR4
Questi farmaci (es. NSC-651016), come i precedenti, agiscono solo sulla fase replicativa del
virus e pertanto non sono in grado di colpire il virus nella sua fase di latenza all'interno dei
reservoirs.
Gli inibitori della fusione e gli antagonisti dei recettori per le chemochine potrebbero essere
utilizzati anche in associazione in quanto è prevedibile un loro effetto sinergico.
40
3.1.4. Inibitori della Fusione
L'interazione della glicoproteina gp120 con i corecettori CXCR4 e CCR5 è seguita da
un'azione specifica della glicoproteina gp41 che si ancora, tramite la sua porzione amminoterminale, all’interno della membrana cellulare dando l’avvio al processo di fusione dell’envelope
virale con la membrana plasmatica. Durante questo processo le tasche idrofobiche sulla superficie
del dominio interno della glicoproteina gp41 divengono disponibili per l’eventuale legame da parte
di ligandi esogeni come l’Enfuvirtide (T-20, DP-178, pentafuside o Fuzeon®) (Figura 3.16), un
peptide sintetico di 36 aminoacidi che corrisponde ai residui aminoacidici 127-162 della gp41 e
643-678 del precursore gp160.
Figura 3.16: Sequenza aminoacidica del peptide Enfuvirtide.
Dopo un trial clinico eseguito somministrando in adulti HIV-infetti quattro diverse dosi del
composto (3, 10, 30, e 100 mg rispettivamente) due volte al giorno per 14 giorni, si è notato che
alla dose più alta (100 mg) il composto causava, dal quindicesimo giorno, una riduzione della carica
virale plasmatica di 1.5 - 2.0 volte. Questo risultato dimostra che gli inibitori della fase di fusione
sono capaci di ridurre la replicazione virale in vivo [46].
Due studi clinici di fase III, TORO 1 e 2 (T-20 Optimized Regimen Only), condotti
rispettivamente in Nord e Sud America [47] ed Europa e Australia [48], hanno dimostrato, dopo un
periodo di trattamento durato 24 settimane, che l’enfuvirtide offre un significativo beneficio
antiretrovirale (riduzione della carica virale di 0.932 e 0.781 log10 copie per millilitro
rispetivamente) ed un beneficio immunologico (aumento della conta linfocitaria di 44 e 275 cellule
per microlitro rispettivamente).
Successivi studi, durati più di 48 settimane, hanno confermato questi risultati [49,50].
L’enfuvirtide deve essere somministrato due volte al giorno attraverso iniezione
sottocutanea. Ciò comporta inevitabilmente lo scatenarsi di reazioni al sito di iniezione come
eritemi, noduli e cisti. Un altro inevitabile inconveniente è il suo costo di produzione. Si da il caso,
infatti, che il farmaco sia un peptide con peso molecolare pari a 5000 Da [51] e come tale richieda
elevati costi di produzione.
41
Inoltre, come per tutti i farmaci anti-HIV che agiscono attraverso specifici meccanismi,
anche per l’enfuvirtide si rende necessario il continuo ed attento monitoraggio della comparsa di
eventuali fenomeni di resistenza virale.
La monoterapia ha infatti facilitato la selezione di ceppi mutanti per la glicoproteina gp41,
nelle posizioni 36-38 della catena ammino-terminale (G36D e V38A) [52,53].
Esistono ben sette varianti di HIV-1 enfuvirtide-insensibili in una popolazione enfuvirtidenaïve e questo può comportare la resistenza del virus al trattamento farmacologico [54].
Tuttavia, visto che l'enfuvirtide, così come SCH-C e RANTES, inibisce la replicazione di
ceppi primari isolati da molti tipi di cellule che usano il corecettore CCR5, dovrebbe essere valutato
un suo potenziale utilizzo nella prevenzione della trasmissione verticale e sessuale dell’HIV [55].
Recentemente è stato desritto un nuovo meccanismo di inibizione della fusione cellulare che
coinvolge il medesimo target molecolare [56,57] e che prevede lo sfruttamento di analogie
strutturali tra alcuni derivati terpenici tri-sostituiti (Figura 3.17) e le regioni N-elicoidali esposte
della glicoproteina gp41.
Figura 3.17: Derivato Terpenico Trisostituito.
42
3.1.5. Farmaci che inibiscono la Trascrittasi Inversa
La Trascrizione Inversa è il processo con il quale le informazioni genetiche del virus,
contenute in una singola catena di RNA, vengono copiate in una doppia catena di DNA. Questo
processo, che avviene nel citoplasma della cellula nelle prime ore successive all'infezione, necessita
dell'intervento di un enzima virale multifunzionale, la Trascrittasi Inversa (RT) (Figura 3.18
[102]). La trascrizione inversa si svolge, infatti, in tre fasi:
1) prima fase: sintesi di una catena di DNA complementare all'RNA virale (attività DNAPolimerasica RNA-Dipendente della RT );
2) seconda fase: degradazione della catena di RNA originaria (attività Ribonucleasica della
RT );
3) terza fase: costruzione della seconda catena di DNA complementare alla prima (attività
DNA-Polimerasica DNA-Dipendente della RT).
Il risultato è un DNA a doppia catena che contiene tutte le informazioni genetiche presenti
nel genoma originario ad RNA.
Sito catalitico: 3 residui Aspartici 8586-110
Figura 3.18: Struttura della Trascrittasi Inversa.
Come si può notare dalla figura, la trascrittasi inversa dell’HIV-1 è un eterodimero,
strutturalmente simile ad una mano chiusa, costituito da due subunità molecolari molto ingombranti
di 66 e 51 KDa rispettivamente, denominate p66 (560 aa) e p51 (440 aa).
43
Quest’ultima subunità deriva dalla scissione proteolitica, ad opera di una proteasi virale,
dell’estremità carbossi-terminale di p66 che comporta la perdita del dominio dell’Rnasi H (aa 427560). Entrambe le subunità hanno in comune quattro sottodomini definiti: fingers (aa 1-85 e 118155), palm (aa 86-117 e 156-237), thumb (aa 238-318) e connection (aa 319-426) ma assumono
una diversa conformazione spaziale. Inoltre, le attività catalitiche (DNA-Polimerasica e
Ribonucleasica) sono svolte dalla subunità enzimatica p66 (sito catalitico: D185-186-110), mentre
la p51 è essenziale per stabilizzare il legame del primer del tRNA all’inizio della retrotrascrizione,
per lo spostamento della catena e la fase di processazione durante la sintesi del DNA.
La figura 3.19 evidenzia i siti enzimatici più importanti ai fini dello svolgimento e/o
dell’inibizione delle attività catalitiche della Trascrittasi Inversa HIV-1.
NRTI mutations
NNRTI mutations
Figura 3.19 a: Struttura della trascrittasi inversa HIV-1 indicante il sito attivo polimerasico ed i siti
di legame degli inibitori.
C’è solamente un sito attivo in ciascuna trascrittasi inversa ed è caratterizzato da una triade
di residui aspartici (D185-186-110) in prossimità dei quali termina il gruppo ossidrilico-3’ del
primer [103].
La subunità p66 è organizzata a formare una larga fenditura all’interno della quale si legano
la catena di RNA (Templato) e il DNA primer (Figura 3.19b). La subunità p51 non possiede la
fenditura e i residui coinvolti nella catalisi (D185, D186, D110) sono nascosti.
44
Figura 3.19 b: Particolare del sito attivo dell’RT.
Una volta legati primer e dNTP inducono un cambiamento conformazionale della subunità
p66. In particolare si è visto che, in seguito a questo legame, il sottodominio fingers shifta verso la
regione palm. Questo movimento porta nuovi residui aminoacidici in contatto con il dNTP. In
particolare, il sito per il dNTP, descritto bene da alcuni ricercatori [104] (Figura 3.19 c), mostra
chiaramente che la coordinazione di una lisina, una arginina e due ioni magnesio (A e B)
caratterizza il complesso attivo che incorpora il nucleotide.
Figura 3.19 c: Coordinazione di una lisina, una arginina e due ioni magnesio nel complesso attivo
che lega il nucleotide.
45
Una ulteriore immagine del sito attivo dimostra che il Mg (B) può presentare una geometria
di tipo ottaedrica che somiglia molto al dominio T7 della DNA-Polimerasi (Figura 3.19d fr. gialla).
Crystal
Figura 3.19 d: geometria ottaedrica del Mg (B) a livello del sito attivo.
Essendo un enzima virale essenziale, la RT è uno tra i principali obiettivi farmacologici
sfruttati nelle attuali terapie antiretrovirali.
A tale proposito, possiamo distinguere due importanti categorie di farmaci che inibiscono
l’azione di questo enzima:
1) Inibitori Nucleosidici e Nucleotidici della Trascrittasi Inversa (NRTIs e NtRTIs);
2) Inibitori Non Nucleosidici della Trascrittasi Inversa (NNRTIs).
I primi sono anologhi del substrato naturale (dNTP) e, competendo con il suo sito di legame
(dTTP), si comportano da terminatori di catena (Figura 3.19e). Per esplicare questo meccanismo
devono necessariamente possedere un gruppo ossidrilico in 3’. Hanno però lo svantaggio di essere
dannosi per le cellule.
Figura 3.19e: Sito di binding degli NRTIs (freccia blu) e NNRTIs (freccia gialla) .
46
Invece gli inibitori non nucleosidici sono molecole, chimicamente diverse dal substrato
naturale, che bloccano l’attività polimerasica dell’enzima interagendo con esso in maniera non
competitiva. Infatti si legano su un sito allosterico (NNIBP) distante quasi 10Å dal sito catalitico
(Figura 3.19e). Questo è formato da due residui di triptofano che circondano la molecola di NNRTI
e la incorporano [105]. Si pensa che gli NNRTIs prevengano i cambiamenti conformazionali
essenziali per l'allungamento del filamento di DNA. Inoltre, rispetto agli NRTIs, non causano
citotossicità a dosi terapeutiche.
47
3.1.5.1. Inibitori Nucleosidici della Trascrittasi Inversa (NRTIs)
Sono attualmente tra i farmaci più usati nella terapia dell’AIDS anche se mostrano diversi
effetti collaterali e nelle terapie prolungate producono, per mutazione, ceppi virali resistenti al
trattamento farmacologico.
I farmaci più importanti appartenenti a questa classe sono (Figura 3.20):
-
3’-azido-2’,3’-dideossinucleosidi: AZT (Zidovudina, Retrovir®);
-
2’-3’-dideossinucleosidi: DDI (Didanosina,Videx®) e DDC (Zalcitabina, Hivid®);
-
2’,3’-dideidro-2’,3’-dideossinucleosidi: d4T (Stavudina, Zerit®);
-
3TC (Lamivudina, Epivir®), anche introdotto sul mercato in combinazione con
Zidovudina (Combivir®) e con Abacavir (Epzicom®);
-
ABC o 1592U89 (Abacavir, Ziagen®), anche presente sul mercato in combinazione con
Zidovudina e Lamivudina (Trizivir®);
-
Emtricitabina (2’,3’-dideossi-3’-tio-5-fluorocitidina, (-)- FTC), inizialmente introdotto
sul mercato come Coviracil® ed attualmente presente come Emtriva®, è il settimo analogo
2’,3’-dideossinucleosidico ufficialmente approvato (dal 2 luglio 2003) per il trattamento
dell’infezioni da HIV.
Figura 3.20: Analoghi Nucleosidici utilizzati nella terapia dell’HIV (NRTIs).
48
Essendo strutturalmente analoghi nucleosidici, competono con i substrati naturali e vengono
incorporati dalla Trascrittasi Inversa nelle catene del DNA virale in crescita, bloccandone
l’ulteriore sviluppo. Per fare questo le molecole devono per prima cosa subire fosforilazione
sequenziale in 5’ da parte di apposite chinasi e venire trasformate nei loro trifosfati (specie attive).
La fosforilazione è una tappa importante per esplicare l’azione anti-HIV data la maggiore affinità
verso la trascrittasi inversa e verso altri enzimi virali manifestata dai nucleotidi in confronto ai
nucleosidi.
I requisiti strutturali necessari per l’attività si possono definire sulla base di studi di
relazione struttura-attività (SAR):
1) in 5’ deve essere presente un OH;
2) in 3’ devono essere presenti un gruppo azidico, un atomo di H o uno di F o in alternativa
il legame 2’,3’ deve essere doppio;
3) al posto di un metilene dello zucchero può esserci un eteroatomo (zolfo).
L’ AZT o zidovudina (3’-azido-2’-3’-didesossitimidina) è un analogo della timidina in cui
al C3 del desossiribosio è presente un gruppo azidico. Essa è altamente efficace nel bloccare la
riproduzione di HIV ed è utile nel trattamento dell’AIDS e del complesso AIDS-correlato (ARC)
per tenere sotto controllo le infezioni opportunistiche.
Questa molecola per esplicare la sua azione deve prima essere fosforilata ad opera di una
timidina chinasi cellulare. Dopo essere stata convertita a mono-, di- e trifosfato da parte della
chinasi va a competere con i dedossinucleotidi naturali per il legame con il DNA.
Questo processo previene il normale legame 5’-3’-fosfodiestereo e la catena di DNA cessa
di allungarsi a causa della presenza del gruppo azidico. A dosi adeguate l’AZT trifosfato blocca la
moltiplicazione dell’HIV per inibizione selettiva della DNA-polimerasi virale.
I 2’-3’-dideossinucleosidi (DDC e DDI) sono nuovi nucleosidi che presentano diversi
vantaggi rispetto l’AZT quali la minore tossicità, la maggiore tollerabilità e l’attività inibente nei
confronti dei mutanti resistenti all’AZT.
Anche i nucleosidi solforati quali 3TC e FTC hanno mostrato potente attività nei confronti
dell’HIV.
Tra gli NRTIs sopra citati, l’emtricitabina, è stata introdotta recentemente in terapia ed è
stata considerata “Farmaco Ideale” in quanto mostra:
-
sinergismo d’azione con altri farmaci antiretrovirali, soprattutto con didanosina ed efavirenz
[60,61];
49
-
eccellente tollerabilità dopo lunghi periodi di terapia, sia da sola che in combinazione con
altri agenti anti-virali [61];
-
lunga emivita intracellulare anche dopo singola somministrazione giornaliera (200 mg)[59];
-
efficacia in vitro circa 4-10 volte più elevata rispetto alla lamivudina [62, 63].
Altri composti appartenenti alla classe degli analoghi nucleosidici (NRTIs) sono attualmente in fase
di sviluppo (Figura 3.21)(in questa sede verranno solo citati e per un approfondimento si fa
riferimento a quanto riportato in letteratura):
-
2’-deossi-3’-ossa-4’-tiocitidina (dOTC, BCH-10652) [64];
-
il derivato 5-fluoro-sostituito di dOTC: FdOTC (Racivir) [64];
-
l’'enantiomero levo-giro di dOTC (Figura 3.21), detto anche SPD754 [65];
-
-D-2’,3’-dideidro – 2’,3’-dideossi-5-fluorocitidina ( - D-d4FC, RVT, Reverset).
Figura 3.21: nuovi analoghi nucleosidici.
L’enantiomero (-) - dOTC ha mostrato una promettente attività nei confronti di ceppi virali
mutanti (singole mutazioni, come M184V, ma anche mutazioni multiple a carico della timidina,
TAMs). Tuttavia questo farmaco può essere antagonizzato dal composto 3TC, quindi è
controindicata una loro co-somministrazione in terapia [66].
L’RVT (Figura 3.21) corrisponde al derivato 5-fluoro-sostituito di -D-d4C ( - D-2’,3’dideidro-2’,3’-dideossicitidina), composto già considerato, nel 1986, un potente e selettivo farmaco
anti-HIV [67]. L’RVT è in grado di esplicare la sua azione contro ceppi virali resistenti al
trattamento con 3TC e AZT [68], mentre sembra essere meno efficace nei confronti dei virus
resistenti a molti farmaci NRTIs, in modo particolare verso ceppi che portano la mutazione Q151M
sul gene della trascrittasi inversa [69]. Inoltre lo stesso composto causa, in vitro, la selezione di
ceppi mutanti (K65R) [69]. In studi di Fase I è stato dimostrato che possono essere ottenute
concentrazioni plasmatiche ottimali, del composto, somministrando 50 mg per via orale [70, 71,
72].
Tra i nuovi analoghi 2’,3’-dideossinucleosidici (con base purinica) il migliore sembra
essere l’amdoxovir ((-) - D-2,6-diaminopurina diossolano, DAPD) (Figura 3.21). DAPD viene
convertito ad opera di una adenosina deaminasi nel derivato diossolano guanina (DXG), che a sua
50
volta viene fosforilato in 5’ al livello intracellulare [73]. Il metabolita attivo (DXG-TP) agisce da
substrato alternativo e quindi inibisce la trascrittasi inversa di HIV-1 [74, 75].
DAPD/DXG si è dimostrato molto attivo contro ceppi mutanti, di HIV-1, resistenti al
trattamento con zidovudina (M41L/D67N/K70R/T215Y/K219Q) e lamivudina (M184V) [73],
tuttavia si è da poco notata una sua minore attività nei confronti dei virus che presentano le
mutazioni K65R e Q151M [76] ed è stato causa esso stesso della selezione di nuovi ceppi mutanti
[77].
3.5.2. Inibitori Nucleotidici della Trascrittasi Inversa (NtRTIs)
Contrariamente agli NRTIs, gli Inibitori Nucleotidici della Trascrittasi Inversa (NtRTIs),
quali:
-
Adefovir (9-2-fosfonilmetossietiladenina, PMEA) e
-
Tenofovir (R-9-(2-fosfonilmetossipropiladenina, PMEDAP) (Figura 3.22),
sono dotati di un gruppo fosfonico laterale, quindi hanno bisogno solo di due fosforilazioni, in vivo,
per essere convertiti nei rispettivi metaboliti attivi (PMEApp, PMEDAPpp). Quest’ultimi,
sostituendosi al substrato naturale (dNTP), durante le fasi di retrotrascrizione, agiscono da
terminatori di catena e inibiscono la replicazione virale [78].
R = H PMEA
R = NH2 PMEDAP
Figura 3.22: Fosfonilmetossietilderivati.
Studi recenti hanno messo in evidenza che questi fosfonilmetossietilderivati sono più attivi
dell’AZT, manifestano una azione molto duratura e hanno uno spettro allargato anche agli herpes
virus.
PMEA è efficace quanto l’AZT nell’infezione retrovirale ed è attivo quanto l’aciclovir nel
trattamento delle infezioni da virus herpes simplex (probabilmente per la somiglianza strutturale).
L’inserimento di un gruppo fluorometilico nella catena laterale della PMEA ha dato origine a
derivati purinici più selettivi di PMEA e PMPA sia in vitro che in vivo.
Da poco si è notato che, come lamivudina, emtricitabina, ed amdoxovir, gli NtRTIs
adefovir e tenofovir non solo sono attivi contro l’HIV, ma sembrano essere efficaci contro il virus
51
dell’epatite B (HBV). Questa scoperta non ha sorpreso i ricercatori, in quanto l’HBV utilizza,
durante le fasi di replicazione, un enzima piuttosto simile alla RT dell’HIV. Adefovir e tenofovir
sono stati, quindi, ufficialmente approvati, rispettivamente, per il trattamento del HBV e dell’HIV,
sotto forma di profarmaci somministrabili oralmente (Figura 3.23):
-
Adefovir Dipivoxil (bis(pivaloyloxymethyl)-PMEA, Hepsera®)
-
Tenofovir Disoproxil (il bis(isopropyloxycarbonyloxymethyl)-PMPA, Viread®).
Figura 3.23: Struttura dei profarmaci somministrabili oralmente.
Del Tenofovir Disoproxil Fumarato (TDF) è sufficiente una singola dose giornaliera di
300 mg per ottenere un buon effetto antivirale, inoltre il composto sembra, secondo alcuni studi,
essere efficace contro ceppi virali mutanti (K65R) anche in seguito ad uso prolungato [79].
Molti altri studi sono stati portati avanti con lo scopo sia di valutare ulteriormente
l’efficacia di questo composto che di confrontarla attraverso vari regimi terapeutici [80-89].
52
3.5.3. Inibitori Non-Nucleosidici della Trascrittasi Inversa (NNRTIs)
Gli Inibitori Non Ncleosidici della Trascrittasi Inversa interagiscono con la trascrittasi
dell’HIV-1, a livello di un sito di legame diverso da quello del substrato naturale. L’inibizione di
HIV-1 è specifica (non sono altrettanto attivi nei confronti di HIV-2 o di altri retrovirus) e si ottiene
a concentrazioni significativamente più basse di quelle citotossiche [90]. La potenza e la selettività
degi NNRTIs si evince dai valori di EC50 e dall’indice di selettività (EC50/CC50).
Sulla base di queste premesse, possono essere considerate più di 30 differenti classi di
composti [90] (Tabella 6). Tre NNRTIs: Nevirapina (Viramune®), Delavirdina (Rescriptor®),
ed Efavirenz (Sustiva®) sono stati finora formalmente autorizzati per l’uso clinico nel trattamento
delle infezioni da HIV-1. L’Emivirina (MKC-442) [91] sarebbe dovuto essere il quarto, ma il suo
sviluppo è stato al momento interrotto.
Tra quelle riportate in tabella le classi più rappresentative sono:
1. HEPT (idrossi etossi feniltio timina) e derivati;
2. DABO (diaril butil ossi) derivati;
3. TIBO (tetraidro metil imidazo benzodiazepin one);
4. PETT (fenil etil tiazol tiouree);
5. NVP (Nevirapina)
6. Derivati piridonici: piridone (L-697661);
7. BHAP [bis(eteroaril)piperazine]: delaviridina, atervidina;
8. a-APA (alfa-anilinofenilacetamide);
9. TSAO (spiro – Si);
10. Solfoni.
53
Code
TABELLA 6
Composto e/o Classe
Abbr.
Sperimentale
Nome
Laboratori
Attività
Farmaceutici
contro
commerciale
HIV-1 RT
IC50 µM
Tivirapina
8-cloro-
(Tetraidrometil-Imidazo-
TIBO
Citotossicità
EC50
CC50
(µM)
(µM)
IS
R86183
0.05
0.0046
138
30000
MKC-442
0.012
0.014
>100
>7000
0.084
0.048
>50
>1000
0.019
0.012
>60
>4800
0.26
0.01
>100
>10000
BenzodiazepinOne)
Emivirina
HEPT
(Idrossi-Etossi-Feniltio-Timine)
I-EBU
Nevirapina
NVP
BI-RG-587
Viramune®
Boehringer
Ingelheim
Piridinone
Delavirdina
L-697,66
BHAP
U-90152
Rescriptor®
Pfizer
(Bis(eteroAril)Piperazine)
4.7
0.034
139
4088
a-APA
R89439
0.2
0.013
710
54615
PETT
LY300046
0.007
0.016
87
5438
Tiocarbossanilide
UC-78
0.02
0.002
>100
>50000
Chinossalina
HBY 097
0.08
0.001
200
20000
NSC625487
0.5
0.21
60
292
Tiazoloisoindolinone
BM+51.0836
0.016
0.01
>50
>5000
Indolo carbossamide
L-737.126
0.003
<0.003
Benzotiadiazina
NSC 287474
1.2
4
>130
>32
0.012
<0.025
0.003
0.001
80
80000
0.07
0.1
20
200
TSAO-m3 T
Loviride
(alfa-Anilino-Fenil-Acetamide)
Trovirdine
(Fenil-Etil-Tiazolo Tiourea)
Tiazolobenzimidazolo
TBZ
Chinazolinone
Efavirenz (Benzossazinone)
DMP266
Sustiva®
Bristol-Myers
Squibb
Canolide A
Pirrolobenzodiazepinone
Imidazodipiridodiazepina
UK-129.485
0.04
<0.3
10
>33
0.156
<0.002
>10
>5000
0.0006
0.01
26
2.600
RD 4-2024
0.5
0.012
28
2280
MEN 10979
0.18
0.0025
38
15000
DABO
1.8
0.8
>335
>418
HEPT-
0.1
0.01
>10
>1000
Benzilossimetilpiridinone
12
100
8
Alcossi(ariltio)uraxile
12.3
0.064
33
Imidazopiridazina
TDA
(Di-Aril-Butil-Ossi) Derivati
Piridinone
516
0.028
Indolildipiridodiazepinone
Pirrolobenzoazepinone
0.25
0.47
4.9
10
Pirrolo sostituiti
0.64
2.3
175
76
50-80
0.3
>16
>50
Benziltiopirimidine
U-31355
54
Studi SAR su 10 classi importanti di NNRTIs [101]:
1. Il capostipite di nuovi composti antiretrovirali dotati di potente attività inibente nei
confronti di RT HIV-1 è rappresentato da un derivato aciclouridinico 6-sostituito, denominato
HEPT, ossia 1-[(2-idrossietossi)metil]-6-(feniltio) timidina (Figura 3.24).
Figura 3.24: Struttura HEPT.
Da studi di relazione struttura attività (SAR) si è notato che:
-
L’introduzione di un gruppo alchilico (metile, etile, isopropile) in 5 nella struttura del
derivato uracilico HEPU inattivo fornisce prodotti altamente attivi;
-
La sostituzione del gruppo -CH2OH con il gruppo -CH3 porta ad un forte incremento
dell’attività;
-
I composti contenenti due gruppi metilici nelle posizioni 3’,5’ del benzene sono molto più
attivi dei corrispondenti composti privi dei metili;
-
La conversione del CO in posizione 2 con il gruppo CS porta ad un debole incremento di
attività (HEPT-S risulta più attivo di HEPT, ma è anche citotossico);
-
La sostituzione dell’atomo di zolfo con il gruppo -CH2- fornisce prodotti più potenti di
quella della serie HEPT.
2. Con la scoperta di HEPT e di E-BPU-dM è stata avviata una ricerca nella sintesi di
isomeri di HEPT, ossia i composti DABO, che differiscono dai primi per la presenza di una catena
alchilossi in posizione 2 invece che in posizione 1 del nucleo pirimidinico, di cui mimano però la
parte benzilica in 6 (Figura 3.25).
Gli studi SAR indicano che:
-
la sostituzione della catena butilossi con catene alchiliche (lineari e ramificate, sature ed
insature) e cicloalchiliche è ammissibile;
-
l’Introduzione di uno o due metili nel nucleo benzenico nelle posizioni 3 e 5;
-
la sostituzione della catena alchilossi con quella alchltio; introduzione di un gruppo etilico in
5;
55
6-feniltio aciclotimidina
HEPT
Isomero HEPT
6-benzil 5-etil aciclouridina
E-BPU-dM
DABO
Figura 3.25.
I DABO sono altamente selettivi nei confronti di HIV-1. In associazione con AZT ne
potenziano l’azione e diminuiscono la formazione di ceppi mutanti resistenti.
3. Il lead compound dei derivati TIBO è R14458. Tale composto (Figura 3.26) è costituito
da una struttura triciclica imidazobenzodiazepinica e ha dato origine a nuovi derivati per
omologazione della catena insatura in 6, trasformazione del -CO- ureidico in -CS nella posizione 2
del nucleo imidazolidonico e introduzione di un atomo di alogeno nella posizione 9, tipica delle
benzodiazepine ad attività ansiolitica, o nella posizione 8
Figura 3.26: Lead Compound dei derivati TIBO.
TIBO e HEPT sono selettivi verso l’HIV-1 e non inibiscono l’HIV-2 a differenza di AZT,
DDI e DDC.
56
Tra i composti con un elevato indice di selettività sono i derivati: R82150, R82913, R86183
(tivirapina) e R86775 (Figura 3.27).
Figura 3.27: Derivati TIBO.
Relazione Struttura-Attività (SAR):
-
I derivati TIBO hanno potenza simile a quella dell’AZT, ma con selettività maggiore. Il
capostipite agisce su un sito allosterico e inibisce l’attività della RT a livello della
polimerizzazione del DNA;
-
Un derivato con Cl in 9 può inibire differenti ceppi di HIV-1. Anche gli 8-alogeno derivati
sono molto potenti;
-
Il gruppo ureico ciclico è indispensabile per l’attività, ma l’ossigeno carbonilico può essere
sostituito da S e Se.
4. In seguito ad alcuni studi di semplificazione molecolare dei TIBO è stato trovato un
nuovo lead compound (Figura 3.28), LY73497 (N1-fenil-N3-tiazol-2-il-tiourea) e quindi dei
derivati PETT (fenil etil tiazol tiouree). Tale composto presenta una modesta attività inibente
l’RT, per cui è stato deciso di avviare la ricerca di nuovi analoghi più potenti. Tale ricerca
consisteva nel sezionare la molecola in 4 parti (parte aromatica benzenica, catena alchilica legante,
tiourea e parte eterociclica tiazolica) modificandole via via per giungere a nuovi prodotti da
saggiare contro il virus dell’AIDS.
57
Figura 3.28: Scoperta di un nuovo lead compound (e dei derivati PETT).
Studi SAR e computazionali hanno portato a stabilire che:
-
una struttura conformazionale rigida era da preferirsi alla struttura a catena lineare
completamente aperta;
-
i derivati dell’urea risultavano meno attivi dei corrispondenti composti della tiourea;
-
opportuni gruppi sostituenti (-F,-Cl, -CH3, -OCH3) portavano ad un forte incremento
dell’attività anti-HIV;
-
il nucleo tiazolico poteva essere sostituito da altri gruppi eterociclici.
Il composto MSC-127 è uno tra i più potenti della serie.
5. L’identificazione di un lead compound su composti correlati con la pirenzepina e la sua
ottimizzazione mediante studi SAR, indagini sul metabolismo e sulla farmacocinetica hanno portato
alla scoperta della Nevirapina (NVP).
La nevirapina (Figura 3.29) appartiene alla classe dei dipiridodiazepinoni ed è un potente
inibitore dell’attività polimerasica di HIV-1 RT. Agisce non-competitivamente nei confronti dei
nucleotidi (nucleosidi trifosfato) legandosi alla RT in prossimità del sito d’azione ed inibisce la
moltiplicazione dell’HIV-1.
58
Figura 3.29: Struttura della Nevirapina.
Studi SAR per la Nevirapina:
-
In associazione con AZT presenta sinergismo d’azione e manifesta azione inibente nei
confronti dei mutanti HIV-1 resistenti all’AZT;
-
il punto di unione tra l’anello piridinico ed il nucleo benzodiazepinico è cruciale per
l’attività;
-
l’attività ottimale si ha quando uno dei due anelli laterali del sistema triciclico è un
eterociclico di tipo piridinico, meglio ancora se entrambi sono piridine, ed in tal caso è
importante la posizione dei due atomi di azoto. Il massimo della potenza si raggiunge come
nel composto lead, se la posizione 4 porta un piccolo gruppo lipofilo (un metile) e l’azoto
lattamico ha un idrogeno libero;
Come verrà successivamente accennato gli studi di molecular modeling hanno permesso di
confrontare i composti TIBO e la nevirapina in cui sono presenti elementi strutturali comuni:
due sistemi
orientati tra di loro come le ali di una farfalla (Figura 3.30), una regione
lipofila intermedia tra di essi e un gruppo carbonilico o tiocarbonilico ecc.
Figura 3.30: modello molecolare attivo che permette di prevedere se un nuovo sistema triciclico risulta
bioisosterico e quindi presenta attività anti-HIV come TIBO e Nevirapina.
59
Questo modello molecolare è stato confermato da molti studi ed è attualmente sfruttato per il
drud desing di nuovi composti attivi [106].
I primi studi dimostravano, infatti, che le strutture di alcune classi di NNRTIs,
apparentemente, divergono tra loro, ma da una analisi più attenta si è notato che la maggior parte
possiede delle caratteristiche comuni:
-
un “corpo” di natura idrofila rappresentato da un gruppo (tio) carbossamidico o (tio)
acetamidico o ureidico, circondato da
-
due “ali” idrofobiche, una delle quali è spesso sostituita da un atomo di alogeno.
Quindi, la struttura complessiva ricorda molto quella di una farfalla, con un corpo (idrofilo) e due
ali (idrofobiche).
Questo modello “Butterfly-like” è stato confermato, da analisi cristallografiche, durante gli studi
sulla Nevirapina e TBZ.
Sulla base di quanto scoperto, è stato in seguito dedotto anche un modello farmacoforico (3D)
attraverso l’utilizzo di ben otto farmaci noti (Nevirapina, Delavirdina, Efavirenz, Trovirdine,
Loviride, Indolo Carbossamide, Benzotiadiazina-1-ossido e Tiocarbossanilide). Tutti i ligandi sono
stati ottimizzati geometricamente tramite la determinazione dell’energia interna ottenuta a sua volta
attraverso calcoli di meccanica molecolare (parametrizzazione MM3), per assicurare un
campionamento uniforme delle conformazioni a più bassa energia (Figura 3.31).
Figura 3.31: Modello farmacoforico (3D) per il drug desing di nuovi NNRTIs.
60
Struttura del Drug-binding pocket (Nevirapina):
La Nevirapina si lega a livello di una tasca idrofobica vicino all’ansa- situata tra i foglietti
9 e 10 del sottodominio palm di p66 che contiene la sequenza Tyr-Met-Asp-Asp ben conservata
(ref.107; Figura 3.32). Questa tasca non è presente nella subunità p51, e ciò avvalora l’ipotesi che il
target molecolare principale di questa classe di farmaci è la subunità p66 (22).
Figura 3.32: Sito di binding della Nevirapina (in giallo) e sito catalitico (in rosso) sulla subinità p66.
Secondo il modello farmacoforico sopra descritto ci sono alcuni gruppi funzionali (Figura
3.33), degli inibitori, essenziali per l’interazione con la tasca recettoriale: un anello aromatico
(interazioni
-
), gruppi accettori o donatori di legami idrogeno (-NHCS(O)), regioni che
effettuano legami idrofobici (atomi di C e H). Sono quindi state individuate due regioni, del sito di
binding, importanti per l’interazione: ala I, allineata con i residui Y181, Y188 e W229; ala II,che
interagisce con le catene laterali di K101, K103, V106, V179, Y318, H235, P236 .
61
Figura 3.33.
In Figura è evidente come il legame dell’NNRTI a livello del sito idrofobico porti ad una
geometria tipo “butterfly like” dell’inibitore che si poggia sui foglietti 6-9-10 ed è rivolto verso
l’ingresso della tasca recettoriale (Figura 3.34).
Figura 3.34.
62
6. Il primo lead compound della classe dei Derivati 2-Piridonici è L-345.516, sintetizzato
come potenziale agente antiinfiammatorio (analogo dell’indometacina). Su questo sono state
apportate modifiche: sostituzione del gruppo aminico del ponte che univa la struttura piridonica con
la ftalimide onde evitare la degradazione idrolitica, l’allungamento della catena aminoetilica,
l’introduzione di sostituenti nel nucleo piridonico e la sostituzione del gruppo ftalimido con
eterocicli simili (Figura 3.35). In quest’ultimo caso troviamo il composto L-697.661 (benzossazolo
diclorosostituito in 4 e 7) o Piridone, stabile in condizioni fisiologiche. Il piridone blocca la RT
dell’HIV-1.
Figura 3.35: Sintesi dei derivati 2-Piridonici.
Studi SAR sul piridone hanno messo in evidenza che:
-
il nucleo benzossazolico poteva essere sostituito da quello piridinico come nel composto L702.007 ugualmente potente ma con una migliore biodisponibilità;
-
l composto lead è il derivato amminometilftalimmidico ed ha una notevolissima attività, ma
una emivita troppo breve (2 ore);
Per incrementare la stabilità sono stati sintetizzati degli analoghi in cui X può essere-CH2 ed
il sostituente R è costituito da vari eterociclici. Di questi abbiamo il benzofurano e il benzossazolo,
con lo spaziatore amminometilenico, che si sono dimostrati attivi (Figura 3.36).
63
Figura 3.36: Analoghi piridonici.
Un aumento di attività si è avuto sostituendo, nella posizione indicata con X, un -CH2 al
posto di -NH: con lo spaziatore etilenico nei derivati benzofuranico e benzossazolico. In
quest’ultimo si effettuano sostituzioni in posizioni 4’ e 7’: il composto più attivo è il 4’,7’-dicloro
derivato. La modifica
del sistema piridinonico, al contrario, porta a composti meno attivi;
l’allungamento o l’accorciamento dello spaziatore amminometilenico o etilenico annulla l’attività,
così come il tentativo di forzarne la configurazione in cis o in trans inserendo un doppio legame.
7. Il lead compound, U-80493, delle bis(eteroaril) piperazine (BHAP), presenta modesta
attività anti -HIV-1 (Figura 3.37). Sono state apportate modifiche chimiche sul lead compound in
particolare sulle due porzioni legate alla piperazina: sostituzione della porzione benzilica con quella
benzoilica più attiva e la sostituzione dell’arile con gruppi eteroarilici (pirrolo, tiofene, furano,
indolo, chinolina, benzofurano, benzimidazolo).
Figura 3.37: Lead compound delle bis(eteroaril) piperazine (BHAP).
64
La porzione piridinica fu modificata in quella benzenica e vennero proposti vari gruppi
sostituenti in alternativa al gruppo etilaminico. Questo studio portò all’elaborazione dei BHAP di
prima generazione, tra i quali venne selezionata per l’indagine clinica la Atervidina mesilato (U87201) (Figura 3.38). Il BHAP ha una potenza simile all’AZT.
Figura 3.38 : Struttura della Atervidina mesilato (U-87201E).
Un derivato BHAP di seconda generazione è rappresentato da un composto che ha struttura
indolica come la atervidina, che è la Delarvidina mesilato (U-90152S) (Figura 3.39). Questa, che
non ha effetti sull’interazione tra le due subunità delle RT, è stata oggetto di studio comparativo con
l’AZT e la Atervidina.
Figura 3.39: Struttura della Delarvidina mesilato (U-90152S).
8. Il lead compound, alfa-(orto-metossianilino)-2,6-diclorofenilacetamide, ha portato alla
sintesi delle alfa-anilinofenilacetamidi (a-APA), potenti nei confronti della replicazione di vari
ceppi di virus HIV-1. I composti saggiati sono R18893 (a-APA: X=NO2; Y=H) e il composto
R89439 (Loviride) (Figura 3.40). Essi sono inibitori dei ceppi mutanti TIBO-resistenti.
65
Figura 3.40: Struttura del Lead compound e del Loviride (alfa-APA).
9. Gli T-SAO sono derivati spiro delle purine e delle pirimidine e si legano all’RT
destabilizzando le interazioni tra le subunità p66 e p51.
In questo gruppo di composti, i 3’-spiro-xilonucleosidi sono inattivi, così come i 3’ribonucleosidi con un solo gruppo sililico al C2’ o al C5’, o privi di tale gruppo.
La presenza di 2 gruppi sililici in entrambe le posizioni è quindi necessaria e conferisce
selettività e potenza. La base è importante per l’attività: il derivato con la timina è più potente di
quello con l’uracile. L’introduzione di un metile in 3 nella timina produce un analogo con potenza
simile ma tossicità inferiore. Questi analoghi sono i primi derivati aventi l’anello dello zucchero
intatto, che non inibiscono la replicazione dell’HIV-2.
Studi SAR hanno dimostrato che:
-
per l’attività anti-HIV-1 si rende indispensabile la presenza di gruppi sililici in C2’ e C5’;
-
il legame spiro in 3’ deve avere la configurazione ribo.
TSAO-HX (Ipoxantina) presenta una discreta attività anti-HIV-1, ma inferiore di circa tre
volte a quella manifestata dal composto timinico TSAO-T (Figura 3 41).
Figura 3.41: Struttura dei T-SAO.
66
Come sopra accennato, questi composti hanno un meccanismo di inibizione particolare
[102]. Infatti inibiscono l’RT destabilizzando la dimerizzazione delle subunità p66 e p51 attraverso
un legame a livello dei loop b7/b8 di quest’ultima (aa Ile-Pro-Ser-Ile-Asn-Asn-Glu-Thr-Pro-GlyIle) come mostrato in figura 3.42.
Figura 3.42: b7/b8 loop della subunità p51 (Ile-Pro-Ser-Ile-Asn-Asn-Glu-Thr-Pro-Gly-Ile).
10. Infine, tra i composti Diarilsolfonici e Solfonamidi inibitori dell’HIV-1 è stato studiato
il NPPS, ossia il 2-nitrofenil-solfone.
La massima attività è stata osservata:
-
con i due gruppi arilici legati direttamente ai fenili senza altri gruppi interposti (i derivati
solfonamidici risultarono inattivi o poco attivi);
-
dopo l’aggiunta di un gruppo nitro in orto (Figura 3.43).
Figura 3.43: Strutture dei derivati Diarilsolfonici e Solfonamidi.
67
Si è notato che lo stato di ossidazione dello zolfo è determinante ai fini dell’attività,
risultando evidente che la potenza dei composti con gli stessi sostituenti ai gruppi fenilici decresce
nell’ordine SO2> SO >S.
I nuovi solfoni contenenti un gruppo pirrolico al posto del fenile sono stati sintetizzati e
saggiati come agenti anti-HIV-1. In questi composti la presenza del gruppo carbetossilico in 2 al
gruppo pirrolico è cruciale per l’ottenimento di prodotti attivi, la presenza del gruppo -NO2 in orto
è risultata necessaria, ma la maggiore attività è stata notata per un orto-amino derivato.
Fra i derivati contenenti quest’ultimo gruppo va menzionato RS980, che ha un indice di
selettività molto elevato.
Un NNRTI, che fa parte di un’altra classe di farmaci, ma che è degno di nota, è il
thiocarboxanilide UC-781 (Figura 3.44), riconosciuto come agente antiretroverale capace di ridurre
l'infettività [92] di HIV-1 e perciò virucida ideale, sottoforma di gel [93], per
trasmissione sessuale del virus.
Figura 3.44: Struttura di UC-781.
68
prevenire la
Mutazioni:
Sfortunatamente molti dei composti sopra citati hanno causato, negli anni, la selezione di
ceppi virali mutanti in seguito a trattamenti prolungati.
Gli NNRTIs di “Prima-Generazione” (nevirapina, delavirdina, TIBO, loviride) sono noti per
la loro capacità di suscitare resistenza virale, specialmente quando usati singolarmente
(monoterapia). Le mutazioni più comuni avvengono a carico della lisina 103 (K103N) e (Y181C) a
livello del sito di binding dell’inibitore.
Perciò, sono stati fatti alcuni tentativi per sviluppare NNRTIs di “Seconda Generazione”.
Questi tentativi hanno condotto all'identificazione di un certo numero di composti
(efavirenz, talviralina, capravirina) efficaci contro questi ceppi mutanti. La Capravirina (Figura
3.45) in particolare si è distinta per la sua efficacia nei confronti dei ceppi che portano la mutazione
di K103N a livello della loro RT [94].
Figura 3.45: Struttura Capravirina.
DPC 083 (Figura 3.46) , un derivativo di efavirenz, ha mostrato di possedere una marcata
attività contro ceppi di HIV-1 mutanti (L100I, K103N, Y181C Y188L, K103N + L100I, e K103N
+ Y181C) e resistenti ad altri regimi terapeutici [95,96,97,98]. Infine, anche TMC 125 (Etravirine)
(Figura 3.46) è stato studiato come potente NNRTI in grado di inibire la retrotrascrizione di ceppi
virali resistenti alle attuali terapie farmacologiche [99,100].
Figura 3.46: Strutture di DPC083 e TMC 125.
69
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Per il meccanismo d’azione degli Inibitori-RT si può visionare un filmato sul sito:
www.boehringer-ingelheim.com.
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