Piante transgeniche di pomodoro,
tolleranti la salinità del suolo, che
accumulano sale nelle foglie ma non
nei frutti
“Transgenic salt-tolerant tomato plants accumulate salt in foliage
but not in fruit” Hong-Xia Zhang and Eduardo Blumwald
Nature Biotechnology, VOLUME 19 - August 2001
(All images are used with permission-Copyright 2002 Nature Biotechnology)
Secondo i dati del Ministero
dell’Agricoltura USA:
- Ogni anno, 10 milioni di ettari di campi
coltivabili, un’area pari a 1/5 della California,
vanno perduti a livello globale, a causa
dell’eccesso di sali lasciati nel suolo dalle acque di
irrigazione, che durante il loro percorso
raccolgono sali solubili come sodio, magnesio e
potassio e li depositano nel terreno.
•Lo stress ambientale, dovuto alle alte
concentrazioni di sale nei suoli, è ed è stato uno dei
più importanti fattori limitanti la produttività
agricola, visto che le piante sono particolarmente
sensibili alla salinità.
•Attualmente, oltre ¼ delle aree agricole irrigate
del mondo vedono ridurre le loro capacità
produttive a causa della salinità del terreno.
•Molte ricerche sono indirizzate verso il
miglioramento di cultivar che incrementino
l’alotolleranza.
•Gli effetti nocivi del sale sulle piante sono una
conseguenza di :
- effetti tossici dell’eccesso di ioni sodio nei
processi biochimici;
- deficit idrico derivato da stress osmotico.
Per tollerare alti livelli di NaCl, le piante
dovrebbero essere in grado di usare gli ioni per
l’adattamento osmotico e per distribuire
internamente questi ioni in modo da tener lontano
il sodio dal citosol.
•La presenza, nelle cellule delle piante, di larghi vacuoli
internamente acidi e limitati da membrane, permette
un’efficiente compartimentazione del sodio nel vacuolo,
attraverso il funzionamento dell’antiporto vacuolare
Na+/H+.
•Utilizzando la forza proton-motrice, generata dagli enzimi
vacuolari H+-translocanti, l’antiporto Na+/H+ permette il
trasporto, contemporaneo, di Na+ (contro il suo potenziale
elettrochimico) all’interno del vacuolo e di H+
(abbattimento del suo potenziale elettrochimico)
all’esterno del vacuolo, attraverso il tonoplasto.
•Il gradiente salino vacuolare può ,inoltre, “guidare”
l’acqua nelle cellule, rendendo le piante non solo tolleranti
la salinità, ma anche più efficienti nell’utilizzo dell’acqua.
•Recentemente è stato identificato e caratterizzato
il gene AtNHX1, che codifica l’antiporto
vacuolare Na+/H+ in Arabidopsis thaliana.
•Piante di A. thaliana sono state ingegnerizzate in
modo da esprimere maggiori livelli di proteina
AtNHX1 rispetto alle piante del tipo selvatico.
•Il frazionamento della cellula ha mostrato che la
proteina antiporto è espressa principalmente nel
tonoplasto.
•Le piante transgeniche si sono dimostrate
significativamente più alotolleranti grazie alla
sovraespressione di un solo gene.
•La sovraespressione dell’antiporto Na+/H+ di
A. thaliana, permette alle piante transgeniche di
crescere in 200 mM di NaCl, facendo pensare alla
possibilità di ingegnerizzare piante coltivate
tolleranti la salinità del suolo.
•In questo studio si dimostra che piante
transgeniche di pomodoro, che sovraesprimono
l’antiporto vacuolare Na+/H+, sono in grado di
crescere, fiorire e produrre frutti in presenza di
200 mM di NaCl e che si ha alta concentrazione di
sodio nelle foglie ma non nei frutti; ciò mette in
evidenza il potenziale uso di piante transgeniche
per coltivazioni agricole in suoli salini.
•Ipotesi di partenza:
Le piante di pomodoro geneticamente modificate
per avere una maggiore capacità di “sequestrare”
sodio nei vacuoli, potrebbero:
-evitare gli effetti tossici degli ioni Na + nel citosol;
-mantenere l’equilibrio osmotico, usando gli ioni
Na+ per richiamare acqua nelle cellule.
•Un costrutto, contenente il gene AtNHX1 di
A. thaliana, che codifica l’antiporto vacuolare
Na+/H +, è stato introdotto nel genoma di
Lycopersicon esculentum (cv Moneymaker);
•Sono state ottenute 47 piante transgeniche e 6
linee omozigote, 2 delle quali sono state scelte per
gli esperimenti perché crescevano molto
vigorosamente in presenza di alte concentrazioni
di NaCl.
•Piante del tipo selvatico e transgeniche hanno
mostrato una crescita simile in presenza di 5 mM
di NaCl, ciò significa che la sovraespressione
dell’antiporto vacuolare Na+/H+ non ha
influenzato la crescita delle piante geneticamente
modificate:
(A) Piante WT;
(B) Piante TP;
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•Mediante tecnica Western Blots, si è messa in evidenza la
presenza della proteina AtNHX1 solo nelle frazioni del
tonoplasto delle piante transgeniche(TP):
Western Blots : proteine di membrana fogliari testate con anticorpi specifici
per la proteina AtNHX1;
Linee 1,2,3 corrispondono alle membrane delle piante WT;
Linee 4,5,6 corrispondono alle membrane delle piante TP;
Linee 1 – 4 :frazioni di tonoplasto;
Linee 2 – 5 :frazioni del reticolo endoplasmatico e del Golgi;
Linee 3 – 6 :frazioni della membrana plasmatica.
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•Per verificare che un’aumentata espressione
dell’antiporto Na+/H+ corrisponde ad una
maggiore alotolleranza :
•Piante di pomodoro del tipo selvatico (WT) e
transgeniche (TP) sono state fatte crescere in
presenza di 200 mM di NaCl, concentrazione
che inibisce la crescita di quasi tutte le piante
coltivate.
•Lo sviluppo delle
piante WT è fortemente
inibito dalla presenza di
NaCl ad alte
concentrazioni:
•Le piante TP sono
cresciute, fiorite ed
hanno prodotto
frutti:
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•Vescicole di tonoplasto, isolate dalle foglie, sono state
aggiunte ad una soluzione tampone contenente varie sostanze
tra cui acridine-orange
•L’attività di scambio cationi/H+ è stata misurata osservando la
diminuzione della fluorescenza, pH-dipendente, dell’acridineorange
•Attraverso le vescicole del tonoplasto è stato ottenuto un
gradiente di pH, internamente acido, mediante l’attivazione
dell’enzima vacuolare H + -PPiasi ad opera di ioni Mg + +
•Una volta divenuto costante il gradiente di pH, l’attività di
trasporto H+, PPiasi- dipendente, è stata bloccata dall’aggiunta
di AMDP
•Sono stati, quindi, determinati, nelle vescicole isolate dalle
piante WT e dalle piante TP, che sovraesprimono AtNHX1
(X10E), i tassi di scambio cationi/H+
•Il monitoraggio dei movimenti degli ioni Na+, H+dipendenti, nelle vescicole del tonoplasto isolate dalle
foglie, ha confermato che la presenza della proteina
antiporto Na+/H+ è responsabile dell’incremento del
tasso di scambio Na+/H+.
(A) Scambio H+, Na+-dipendente;
(B) Scambio H+, K+-dipendente.
-L’aggiunta di Monensis (mon), un antiporto artificiale Na+/H+, o
Nigericin (nig), un antiporto artificiale K+/H+, ha eliminato il gradiente
di pH e la fluorescenza è stata recuperata( linee verdi);
-Le linee nere indicano i tassi di scambio di cationi/H+ nelle vescicole
delle piante TP, mentre le linee rosse indicano il tasso nelle vescicole
delle piante WT, dopo l’aggiunta di AMDP.
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•Le vescicole del tonoplasto delle piante TP
hanno mostrato tassi di scambio Na+/H+ sette
volte più alti di quelli delle vescicole isolate dalle
piante WT.
•È stato monitorato anche il tasso di scambio
K+/H+ che è risultato significativamente più alto
nelle vescicole del tonoplasto isolato dalle piante
TP.
•Questi risultati indicano che l’antiporto vacuolare
Na+/H+ è in grado di mediare lo scambio K+/H+,
anche se con una specificità più bassa per K+
rispetto a Na+.
•Gli ioni K+ sono coinvolti in molti processi
fisiologici.
•In condizioni di crescita deficienti di K+, la sua
concentrazione nel citoplasma rimane
relativamente costante, mentre decresce solo
quando la concentrazione di K+ nel vacuolo
decresce a valori approssimativamente di 20 mM.
•La diminuzione della concentrazione di K+ nel
citoplasma , con il contemporaneo incremento,
sempre nel citoplasma, del rapporto Na+/H+, è
alla base della tossicità di Na+ nel citoplasma.
•L’evidenza della presenza di un antiporto
vacuolare K+/H+ è stata riscontrata nelle frazioni
del tonoplasto in diverse piante.
•Sebbene il ruolo degli antiporti vacuolari nelle
glicofite è ancora da stabilire, la loro ubiquità
nelle piante e la loro capacità di mediare il
trasporto di K+, suggerisce che l’antiporto
vacuolare Na+/H+ potrebbe giocare un ruolo
nell’ omeostasi cellulare del potassio.
•Analisi chimiche delle foglie e dei frutti:
Sono stati determinati i contenuti di Na+, K+, Cl-,
zuccheri e prolina in piante WT e TP cresciute in
presenza di 5 mM di NaCl e di 2 linee transgeniche
indipendenti cresciute in presenza di 200 mM di
NaCl;
È importante notare che la comparazione con le
piante WT cresciute ad alte concentrazioni di NaCl
non è stata possibile perché tutte le piante WT in
queste condizioni di salinità sono morte.
•Cambiamenti marcati si sono avuti nelle piante transgeniche
cresciute ad alta concentrazione di NaCl:
Il contenuto di ioni Na+, osservato nelle foglie mature e
nelle foglie giovani, è da 28 a 20 volte superiore; un simile
incremento è stato evidenziato anche per il contenuto di
ioni Cl - :
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2002 Nature Biotechnology )
Il contenuto di ioni K+ nelle foglie mature, giovani e
nelle radici delle piante TP cresciute in presenza di
200 mM di NaCl, diminuisce, rispettivamente, 5,2,4 volte
rispetto a quello delle piante WT e TP cresciute in
presenza di 5 mM di NaCl.
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Il contenuto di ioni K+ dei frutti transgenici è più alto di
quello dei frutti delle piante cresciute in presenza di bassa
concentrazione salina.
•Sebbene le foglie delle piante TP hanno
acuumulato ioni Na+ fino a quasi l’ 1% del
loro peso secco, i frutti hanno mostrato solo
un aumento marginale del contenuto di Na+
ed un incremento del 25% del contenuto di
ioni K+.
Sebbene non è stata osservata una significativa
differenza nel contenuto di zuccheri solubili, è stato
evidenziato un aumento del contenuto di prolina nelle
foglie e nei frutti delle piante TP cresciute in presenza di
200 mM di NaCl, rispettivamente di 3 e 5 volte rispetto alle
piante cresciute in presenza di 5 mM di NaCl.
( Used with permission-Copyright 2002 Nature Biotechnology )
L’accumulo di prolina in risposta all’alta salinità è
documentato; molti organismi procarioti ed eucarioti
accumulano prolina durante lo stress osmotico e salino.
•Questi risultati dimostrano:
la capacità delle piante geneticamente modificate di
utilizzare acqua salata per crescere;
nonostante l’alto contenuto di Na+ e Cl- nelle foglie
delle piante TP cresciute in presenza di 200 mM di
NaCl, si è osservato soltanto un marginale incremento
del contenuto di questi ioni nei frutti;
l’aumentato accumulo di ioni sodio, mediato
dall’antiporto vacuolare Na+/H+, permette alle piante TP
di limitare gli effetti tossici del sodio.
WT (5mM NaCl) OEX (5mM
NaCl)
OEX1(200mM
NaCl)
Altezza(cm)
124.0 ± 8.2
128.8 ± 9.5
107.6 ± 5.2
Peso fresco(g)
Senza frutto
1.270 ± 103
1.329 ± 110
1.123 ± 134
17.2 ± 1.3
17.8 ± 0.6
18.4 ± 1.5
119.5 ± 13.4
116.7 ± 9.0
105.7 ± 6.7
Contenuto di
acqua nei frutti
(%)
90.8 ± 3.2
90.2 ± 2.2
90.7 ± 2.3
Contenuto solidi
solubili (°Brix)
4.2 ± 0.6
4.4 ± 0.7
4.2 ± 0.5
Frutti per pianta
Peso frutti(g)
-Le piante sono state raccolte12 settimane dopo la
germinazione.
•Sebbene i frutti delle piante TP cresciute in presenza
di 200 mM di NaCl sono leggermente più piccoli, non
sono state osservate differenze significative nel loro
contenuto di acqua e di sali solubili totali.
•Il numero di frutti per pianta, delle piante WT e
delle piante TP, cresciute in presenza di 5 mM e 200
mM di NaCl, è molto simile.
•È stato dimostrato che durante l’espansione del
frutto di molte piante, incluso il pomodoro, più
del 90% dell’acqua trasportata nel frutto passa
attraverso il floema.
•Si ritiene, quindi, che la capacità di mantenere un
alto rapporto K+/Na+ nel citosol, dovuta al
trasporto dell’acqua attraverso il simplasto, è
probabilmente la maggiore responsabile del basso
contenuto di Na+ nel frutto.
•Queste scoperte suggeriscono la possibilità di
produrre piante transgeniche tolleranti la salinità del
suolo e che producono frutti commestibili.