GenHort: Modulo B10
Metodi di selezione genomica in zucchino
Dott.ssa Formisano Gelsomina
Modulo B.10 GENHORT: Metodi di
selezione genomica in zucchino
Programma
30-4-14 Lo zucchino: origine, gruppi varietali, risorse genetiche,
miglioramento genetico e metodi di selezione
6-5-14 Strumenti di analisi genomica: analisi della diversità
genetica in zucchino usando marcatori molecolari
8;13-5-14 Mappe genetiche e popolazioni di mapping (magic
population)
15-5-14 Sistema CRISPR/CAS in pianta (Dott. Paolo Ioviene) e
lettura paper
19-5-14 Discussione paper e test finale
20-5-14 Visita azienda la Semiorto Sementi srl e campi /serre di
zucchino
Modulo B.10 GENHORT: Metodi
di selezione genomica in zucchino
Strumenti di analisi genomica
Un settore di notevole interesse e grandi potenzialità è quello
dell’analisi del genoma basata sulla rilevazione di marcatori
molecolari.
Si tratta di un settore in rapida evoluzione che si avvantaggia da una
parte dello sviluppo di tecnologie sempre più sensibili ed affidabili e
dall’altro della conoscenza sempre più approfondita della struttura,
organizzazione e funzione degli acidi nucleici.
Un MARCATORE MOLECOLARE può essere definito come quel
locus genomico che, in virtù della sua presenza, contraddistingue in
modo caratteristico ed inequivocabile il tratto cromosomico con il
quale si identifica.
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di selezione genomica in zucchino
Strumenti di analisi genomica
Vantaggi dei Marcatori molecolari:
1. Non subiscono interferenze da parte dell’ambiente
2. Coprono qualsiasi parte del genoma trascritta o non (quindi anche
introni e regioni di regolazione), e consentono pertanto di rilevare
differenze anche tra individui geneticamente molto simili ma
distinguibili fenotipicamente
3. Non presentano effetti epistatici o pleiotropici
4. In molti casi hanno espressione codominante consentendo di
distinguere l’eterozigote dagli omozigoti
Modulo B.10 GENHORT: Metodi
di selezione genomica in zucchino
Strumenti di analisi genomica
Essi si distinguono per il tipo di sequenze analizzate e/o per il tipo di
tecnica impiegata
Schema sinottico delle principali classi di marcatori molecolari utilizzabili per l’analisi del genoma. La
Modulo
B.10 GENHORT:
Metodi
di
classificazione adottata si basa sulla tecnologia utilizzata (SBH-Southern Blot
Hybridization
o PCR,
Polymerase
slezione genomica in zucchino
Chain Reaction) e sul numero di loci saggiati (single-locus o multi-locus).
Strumenti di analisi genomica
L’Uso dei Marcatori molecolari in campo vegetale:
1. Caratterizzazione della variabilità genetica
2. Tipizzazione ed identificazione varietale
3. Costruzione di mappe genetiche
4. Mappaggio genetico
5. Selezione assistita (MAS)
Modulo B.10 GENHORT: Metodi
di selezione genomica in zucchino
Strumenti di analisi genomica
L’Uso dei Marcatori molecolari in campo vegetale:
1. Caratterizzazione della variabilità genetica
2. Tipizzazione ed identificazione varietale
3. Costruzione di mappe genetiche
4. Mappaggio genetico
5. Selezione assistita (MAS)
Modulo B.10 GENHORT: Metodi
di selezione genomica in zucchino
Caratterizzazione della variabilità
genetica
Per iniziare un lavoro di miglioramento genetico dello zucchino è
importante conoscere la natura della diversità genetica all’interno e
tra i diversi gruppi della specie C. pepo.
Tale studio consente:
1. L’analisi della variabilità genetica all’interno e tra diversi gruppi
di cv
2. L’identificazione delle stesse
3. L’introgressione di geni utili dal germoplasma disponibile alle
specie coltivate
4. La ricostruzione della storia evolutiva e del processo di
domesticazione delle specie e la definizione delle distanze genetiche
tra di esse
Modulo B.10 GENHORT: Metodi
di selezione genomica in zucchino
Caratterizzazione della variabilità
genetica
5.  Di individuare popolazioni di origine al fine di generare
appropriate linee e produrre ibridi superiori massimizzando
l’espressione di eterosi. Si assume che la superiorità della
combinazione ibrida è maggiore se i due genitori sono
geneticamente più distanti (Hallauer e Miranda 1988).
Modulo B.10 GENHORT: Metodi
di selezione genomica in zucchino
Caratterizzazione della variabilità
genetica in zucchino
Per lo studio dei polimorfismi sono stati utilizzati diversi marcatori
come RFLP, RAPD, AFLP e SSR.
Modulo B.10 GENHORT: Metodi
di selezione genomica in zucchino
Caratterizzazione della variabilità
genetica in zucchino
Al fine di identificare e caratterizzare una popolazione utile a
generare parentali che potrebbero produrre ibridi superiori
1.  Reperimento di una collezione di germoplasma di zucchino e
sua caratterizzazione morfologica
2.  Analisi molecolare con AFLP, SSR, RAPD
Modulo B.10 GENHORT: Metodi
di selezione genomica in zucchino
Reperimento di germoplasma
Sono state reperite
57 cv. di zucchino
suddivise in:
•  10 varietà (Italia)
•  3 linee (Israele)
•  13 ibridi
commerciali
Gruppo
Accessione
Cocozelle
GS2386 F1
Cocozelle
Ortolana di Faenza
Cocozelle
Lungo Bianco
Cocozelle
San Pasquale
Cocozelle
Alberello Sel. Valery
Cocozelle
Lungo Fiorentino
Cocozelle
Romanesco
Cocozelle
Bianca di Trieste
Cocozelle
Altea F1
Vegetable Marrow
Carisma F1
Vegetable Marrow
Tonya F1
Zucchini
Afrodite F1
Zucchini
Giove F1
Zucchini
Zucchini
Resistenza/
tolleranza
PM, ZYMV
--------PM, ZYMV
ZYMV
CMV, WMV, ZYMV
WMV, ZYMV
Mikonos F1
PM, CMV, WMV, ZYMV
Nano Verde di Milano
--
Ditta sementiera o
referenza
Syngenta
La Semiorto Sementi
La Semiorto Sementi
La Semiorto Sementi
La Semiorto Sementi
La Semiorto Sementi
La Semiorto Sementi
La Semiorto Sementi
Syngenta
Syngenta
Syngenta
Syngenta
Petoseed
Syngenta
La Semiorto Sementi
Zucchini
Zucchini
Quine F1
True French
PM, CMV, WMV, ZYMV
--
Syngenta
Thompson & Morgan
Zucchini
Panter F1
PM, CMV, PRSV, ZYMV
Peotecseed
Zucchini
Zucchini
Zucchini
Zucchini
Zucchini
Zucchini
Pumpkin
Pumpkin
ZU1805 F1
PM, CMV, WMV, ZYMV
Peotecseed
President F1
-La Semiorto Sementi
Diamant F1
-La Semiorto Sementi
Obsidian F1
PM, ZYMV
-381e
ZYMV
Paris and Cohen, 2000
968Rb
PM
Cohen et al., 2003
Tondo di Piacenza
-La Semiorto Sementi
Tondo chiaro di Nizza
-La Semiorto Sementi
Modulo B.10 GENHORT: Metodi
di selezione genomica in zucchino
Reperimento di germoplasma
Ø  Sono state ottenute dal Dott. H.S. Paris del Centro di Ricerca Newe
Ya’ar, Israele i semi:
1.  linea inbred della cv. True French
2.  linea isogenica (BC6F4) della cv.True French resistente all’oidio (Sf)
(968Rb) (Cohen e al. 2003)
3.  linea isogenica (BC6F10) della cv.True French resistente allo ZYMV
(381e) (Paris e Cohen 2000)
Modulo B.10 GENHORT: Metodi di
slezione genomica in zucchino
Reperimento di germoplasma
•  31 varietà
(Spagna)
Gruppo
Cocozelle
Cocozelle
Cocozelle
Cocozelle
Cocozelle
Cocozelle
Cocozelle
Vegetable marrow
Vegetable marrow
A
AN
C
V
V
V
PAS
A
AFR
AN
AN
CL
CL
CM
CM
V
Vegetable marrow
Vegetable marrow
Vegetable marrow
Vegetable marrow
Vegetable marrow
Vegetable marrow
Vegetable marrow
Vegetable marrow
V
Vegetable marrow
AN
Zucchini
A
Zucchini
E
Zucchini
MU
Zucchini
MU
Zucchini
BBC6
Zucchini
E
Zucchini
E
Pumpkin
PJI
Pumpkin
Styrian
Acorn
BGU
Crookneck
NSL
Scallop
V
Codice
CU
CU
CU
CU
CU
CU
CU
CU
CU
CU
CU
CU
CU
CU
CU
CU
CU
CU
CU
CU
CU
CU
CU
2
75
9
74
116
185
15834
12
12
23
113
19
21
32
47
10
949
21
27\1
13
27
16
20
10
227
71628
8238
5227
196
Origine
Sarrión;Teruel
Cabra;Córdoba
Torelló;Barcelona
Valencia
Giraba;Castellón
Cañada;Alicante
viver, castellon
Quicena;Huesca
Khmelat
Ronda dirección Arriate;Málaga
Beires;Almería
Hontalbilla;Segovia
Simancas;Valladolid
Mariana;Cuenca
Almodóvar del Campo;Ciudad Real
Utiel;Valencia
Mondéjar;Guadalajara
/
algeciras direccion el riconcillo cadiz
Quicena;Huesca
Madrigal de la Vera;Cáceres
Ñorica.Totana;Murcia
Altobordo.Lorca;Murcia
/
Garganta; caceres
/
/
/
/
/
/
Caratterizzazione morfologica
6 Caratteri
•  portamento
•  ramificazioni
•  incisioni fogliari
•  chiazze argentee sulle foglie
•  forma frutto
•  colore frutto
Caratterizzazione morfologica
cultivar
Italiane +
Israeliane
Spagnole
Portamento
Ramificazioni
Incisioni
Forma
frutto
Chiazze
Colore
frutto
Semi
eretto strisciante strisciante assenti presenti lievi medie profonde assenti presenti cilindrica clavata tonda verde crema
22
3
1
19
7
2
11
13
10
16
21
3
3
23
3
4
15
7
4
23
7
16
4
8
19
16
8
3
18
6
Modulo B.10 GENHORT: Metodi
di selezione genomica in zucchino
Caratterizzazione della variabilità
genetica in zucchino
Al fine di identificare e caratterizzare una popolazione utile a
generare parentali che potrebbero produrre ibridi superiori
1.  Reperimento di una collezione di germoplasma di zucchino e
sua caratterizzazione morfologica
2.  Analisi molecolare con AFLP, SSR, RAPD
I moderni strumenti della genetica molecolare e della genomica
contribuiscono agli studi della diversità genetica, permettendo di affiancare
ai dati tradizionalmente usati, quali dati morfologici, quelli dei marcatori
molecolari del DNA che sono estremamente informativi.
Modulo B.10 GENHORT: Metodi
di selezione genomica in zucchino
AFLP
Amplified Fragment Length Polymorphism
Vantaggi
• Sono marcatori altamente polimorfici e
potenti per studi intraspecifici
• Sono riproducibili
• E’ una tecnica facile ed i primer sono
standard
Svantaggi
• La procedura è lunga
• Spesso i risultati sono difficili da
analizzare
• E’ una tecnica costosa
Procedura per la rilevazione di marcatori AFLP comprendente la
digestione del DNA con due distinti enzimi di restrizione, la ligazione di
adattatori, la pre-amplificazione e l’amplificazione finale con primer
aventi una o più basi selettive.
Modulo B.10 GENHORT: Metodi
di selezione genomica in zucchino
RAPD
Random Amplified Polymorphic DNA
Una semplice PCR con un solo primer (normalmente di 10 basi) di sequenza
casuale
Vantaggi
•  E’ una metodica facile e veloce
• Alto polimorfismo
• Occorrono solo piccole quantità di DNA
•  Permette di individuare e caratterizzare tramite il sequenziamento
utili marcatori a partire dal prodotto RAPD (bande)
Svantaggi
• Sono marcatori dominanti
•  Problemi di riproducibilità
• Comigrazione di frammenti
Modulo B.10 GENHORT: Metodi di
slezione genomica in zucchino
SSR
Simple Sequence Repeat o Microsatelliti
Polimorfismo determinato dal
diverso numero di basi ripetute
Vantaggi degli SSR
• Altamente polimorfici e particolarmente adatti alla tipizzazione genotipica
e all’identificazione varietale
• Codominanti
•  Alta riproducibilità
Svantaggi degli SSR
• Sono necessarie informazioni sulla sequenza per poter disegnare i primer
nelle zone fiancheggianti ed i procedimenti per ottenerle sono molto
dispendiose e lunghe
• Di solito è necessario testare librerie genomiche per individuare e
caratterizzare i loci microsatellite per quelle specie oggetto di studio
Modulo B.10 GENHORT: Metodi di
slezione genomica in zucchino
Analisi a livello molecolare: AFLP
Sono state analizzate 17 linee tra i diversi ibridi, le varietà standard e le
tre linee isogeniche con 4 combinazioni di primer
Primer
N° totale
di bande
% di bande
polimorfiche
E-AGC M-CAG
E-AGC M-CAC
E-ACT M-CAT
E-ACT M-CAC
Totale
Media
126
217
154
147
644
161
98
100
98
94
-97
N° totale di bande
accessionispecifiche
28
45
15
19
107
27
I diversi profili AFLP sono stati confrontati e i polimorfismi sono stati
designati con 1 (presenza del frammneto) o con 0 (assenza dei frammenti)
Analisi a livello molecolare
•  L’analisi della variabilità genetica prevede la stima di particolari coefficienti
di similarità genetica (SG) o dissimilarità genetica (DG).
• A tal fine, i dati relativi all’insieme dei marcatori molecolari raccolti nel
campione di individui in esame sono utilizzati per costruire le matrici di
similarità o dissimilarità, calcolando i coefficienti relativi in tutte le possibili
combinazioni a coppia tra tutti gli individui di una popolazione
•  I coefficienti di similarità utilizzabili a tale scopo sono molteplici.
•  In tutti i casi, un valore di similarità pari a 1 indica completa identità tra la
coppia di individui considerati mentre un valore uguale a 0 completa diversità.
Modulo B.10 GENHORT: Metodi
di selezione genomica in zucchino
Analisi a livello molecolare: AFLP
La similarità genetica tra le diverse accessioni è stata ottenuta usando il
coefficiente simple matching (SoKal e Michener 1958)
Modulo B.10 GENHORT: Metodi
di selezione genomica in zucchino
Analisi a livello molecolare
• 
Le matrici sono necessarie per condurre le analisi di raggruppamento
attraverso la costruzioni dei dendrogrammi.
•  I metodi di costruzione dei dendrogrammi si possono classificare in due
famiglie: quelli basati su matrici di distanza e quelli basati sulla condivisione
dei caratteri.
•  Nel primo caso si calcola separatamente la distanza fra tutte le possibili
coppie di specie (i metodi di calcolo della distanza sono molteplici): UPGMA e
Neighbor Joining
•  Nel secondo caso i caratteri che sono condivisi da una o più specie vengono
inclusi nell’analisi uno alla volta e danno luogo ad una gerarchia di
ramificazioni senza che si passi attraverso il calcolo di una distanza
Modulo B.10 GENHORT: Metodi
di selezione genomica in zucchino
Analisi a livello molecolare:AFLP
•  Nel nostro caso, è stato costruito un albero filogenetico con neighbourjoining usando il programma PHYLIP 3.62 (Felsenstein 1993).
•  Con l’approccio dell’algoritmo neighbour-joining si inizia con un albero a
stella in cui tutte le branche sono della stessa lunghezza, e le diramazioni
vengono poi risolte una alla volta. Il risultato finale è un dendrogramma in cui
la lunghezza di ciascuna branca è proporzionale alla distanza media di ciascuna
specie da tutte le altre.
•  tale algoritmo è considerato un buon compromesso fra velocità di calcolo e
accuratezza del risultato
Modulo B.10 GENHORT: Metodi
di selezione genomica in zucchino
AFLP
Dendogramma: I codici dei nomi presentano le doppie lettere riferite
al gruppo
di appartenenza
e
Modulo
B.10 GENHORT:
Metodi di
slezione
le triple riferite all’accessione. I numeri ai nodi sono i valori bootstrap
(%).genomica in zucchino
Analisi a livello molecolare: SSR
1.  Sono state analizzate mediante 60 SSR:
•  10 varietà standard di derivazione italiana
•  31 varietà di derivazione spagnola
•  5 ibridi commerciali
2.  Sono stati utilizzati 30 SSR-EST e 30 SSR genomici
Modulo B.10 GENHORT: Metodi
di selezione genomica in zucchino
SSRg
Primer
CMTp193
CMTp98
CMTp131
CMTp187
CMTp63
CMTp88
CMTp235
CMTp256
CMTp224
CMTp248
CMTp142
CMTp257
CMTp58
CMTp145
CMTp66
CMTp260
CMTp245
CMTp36
CMTp69
CMTp176
CMTp33
CMTp86
CMTp169
CMTp231
CMTp208
CMTp209
CMTp183
CMTp188
CMTp132
CMTp47
Totale
Media
Gruppo
di
linkage
1
2
3a
3b
4
5
5
6
6
7
8
9
9
10a
10a
11
11
12
13
14
14
15
15
16
17
17
18
18
19
20
N°
alleli
attesi
5
3
3
3
3
5
6
2
5
4
7
3
2
4
3
4
5
3
3
4
4
3
2
9
2
3
3
2
4
3
N°
alleli
osservati
2
6
3
2
4
3
9
3
3
1
6
5
1
4
4
4
3
4
4
4
3
3
4
-4
3
5
4
5
3
109
3,6
% di
alleli
polimorfici
100
100
100
100
100
100
100
66
100
0
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
66
100
-100
100
100
100
100
66
-90
N° di alleli
acces.
specifici
0
1
0
0
0
0
3
0
0
0
0
1
0
1
2
0
0
1
1
2
0
0
1
-0
0
0
0
1
0
14
0,5
motivo
ga
aag
ccg
cag+caa
ttc
tc
gtt
atc
caa
gga
tc
cgt
ga+t
cat
gaa
cat
gcg
aac
tatt
tc
gaa
cca
gaa
ag
gtt
gtt
cat
cat
gat
ag
N°
ripetiz.
SSR
18
9
7
6+4
10
12
12
5
7
5
12+5
11
6+10
7
9
7
9
5
4
12
3+4
9
11
38
5
6
6
7
12
9
dimensioni
attese (bp)
dimensioni osservate
+ coda (bp)
186
213
117
189
152
167
148
154
151
154
158
138
102
100
128
155
134
151
70
111
171
133
158
170
117
116
196
147
151
154
177-200
224-255
109-135
200-300
145-175
178-197
145-200
175-200
169-175
145-200
145-240
100-200
100
117-128
120-175
140-174
100-200
164-185
77-92
100-145
189-210
151-192
175-200
-- 133-136
100-145
216-303
145-350
145-200
165-173
SSR-EST
Primer
N°
alleli
% di
alleli
polimorfici
N° di alleli
acces.
specifici
motivo
N°
ripetiz.
SSR
dimensioni
(bp)
funzione
genica
CUTC022867
5
1
cag
8
145-175
nascent polypeptide-associated complex (NAC) domain
containing protein
CUTC010796
--
--
--
tct
8
--
eukariotic initiation factor iso4E (cucumis melo)
CUTC008409
CUTC004991
3
4
100
100
0
0
tgc
agc
8
7
120-145
175-200
protein binding
aconitate hydratase, cytoplasmatic, putative
CUTC009607
4
100
0
ctt
11
145-200
Os07g0573400 (oryza sativa)
CUTC004158
2
100
0
gaa
7
200-204
ABC-type Co2+ transport system, permease component
(Zea mays)
CUTC004399
3
100
0
cgt
7
175-200
hypothetical protein (Vitis vinifera)
CUTC004782
CUTC008659
2
1
100
0
0
0
cct
gaa
8
7
175-200
241
Hypothetical protein
NDH-dependent cyclic electron flow 1
CUTC006703
2
100
0
ggt
7
145
UV-B-insensitive 4
CUTC018879
2
100
0
ctt
7
175-200
Hypothetical protein (Vitis vinifera)
CUTC012342
CUTC009316
2
2
100
100
0
0
gaa
cag
7
7
200-204
320
Hypothetical protein
RNA binding
CUTC009760
2
100
0
caa
7
179
EIN3- like protein (Cucumis melo)
CUTC008419
--
--
--
ctt
6
--
zinc finger (C2H2 Type) family protein
CUTC023363
2
50
1
agc
7
264
glycine-rich protein
Totale
Media
84
2,8
100
-83
5
0,2
SSR
Dendrogramma derivato dall’analisi di 48 accessioni di Cucurbita, basata su 193 bande
SSR. I numeri ai nodi sono i valori bootstrap.
Analisi a livello molecolare: RAPD
Sono state analizzate 17 linee tra i diversi ibridi, le varietà
standard e le tre linee isogeniche con 7 primer
Primer
OPAA17
OPG02
OPK15
OPN20
OPV20
OPAJ03
OPM03
Totale
Media
N°
totale
di bande
15
13
17
11
14
15
19
104
14
% di bande
polimorfiche
47
69
70
36
86
100
58
-66
N° di bande
accessioni
specifiche
2
1
0
0
0
0
0
3
0,4
Modulo B.10 GENHORT: Metodi
di selezione genomica in zucchino
Analisi a livello molecolare: RAPD
codici linee
M 1
5
6
7
14 2 3
4
8
codici linee
9 19 20 21 22
M
1kb
M 1 5 6 7 14 2 3 4 8 9 19 24 25 26 20 21 22
M
1Kb
1.2
0.65
OPAA17
OPAJ03
Profilo elettroforetico RAPD
Modulo B.10 GENHORT: Metodi
di selezione genomica in zucchino
Analisi a livello molecolare:
AFLP-SSR-RAPD
Marker
N° totale
di bande
% di bande
polimorfiche
AFLP
SSR
RAPD
161
3,2
14
97
87
66
N° di bande
accessioni
specifiche
27
0,3
0,4
Modulo B.10 GENHORT: Metodi
di selezione genomica in zucchino
Analisi a livello molecolare:
AFLP-SSR-RAPD
•  Il valore informativo di ogni marcatore può essere valutato
basandosi sul suo valore PIC (Polymorphic Information Content).
•  Si basa sul calcolo del numero di alleli (o bande) che un
marcatore ha e la frequenza di ciascuno di questi alleli nel
germoplasma studiato.
• I marcatori con pochi alleli (o bande) hanno meno potere di
distinguere i diversi genotipi che costituiscono il germoplasma
• Sono preferiti i marcatori che posseggono un elevato valore PIC.
Modulo B.10 GENHORT: Metodi
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Analisi a livello molecolare: PIC
•  La formula è :
Modulo B.10 GENHORT: Metodi
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Analisi a livello molecolare:
AFLP-SSR-RAPD
•  L’analisi con i marcatori molecolari ha permesso di valutare la
variabilità genetica e le relazioni genetiche presenti tra le diverse
accessioni ma anche lo stadio di introgressione di caratteri di
interesse e fornire possibili vie per superare le difficoltà di
introgressione
•  Confrontando le potenzialità dei tre metodi molecolari: gli AFLP
e gli SSR sono più efficienti nel rilevare polimorfismi,
nell’automazione del sistema, nell’interpretazione dei dati e nella
loro riproducibilità
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