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- indicano inequivocabilmente la malignità di un tumore
- sono la principale causa di morbilità e mortalità nei pazienti
con tumore maligno
breast cancer deadly metastasis
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Dall’Invasione alla Metastasi: processo multistep
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Schematizzazione del processo metastatico
STEP
EVENTO
1.
Perdita delle adesioni omotipiche tra le cellule del tumore primitivo
2.
Invasione della ECM
3.
Angiogenesi
4.
Intravasazione
5.
Extravasazione
6.
Impianto nella nuova sede
• Inefficienza del processo metastatico: ogni step può essere limitante
• Ogni step può d’altra parte rappresentare un bersaglio terapeutico
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Step 1
Perdita delle adesioni omotipiche tra le cellule del tumore
primitivo
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Molecole di adesione cell.-cell. e cellula-matrice
4 famiglie:
1. Caderine (Ca2+ dip)
2. Integrine (Ca2+ dip)
3. Ig–like (Ca2+ INDIP.)
4. Selectine
Le caderine e le integrine collegano la
superficie cellulare al citoscheletro
(attraverso filamenti intermedi e actina) 
trasmissione della forza meccanica 
attivazione di pathway MAPK, PKC e IP3
Vi è una sovrapposizione funzionale tra
integrine e GF nel ricevere i segnali
ambientali che regolano proliferazione,
apoptosi, motilità e differenziamento
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Caderine
Zonula adherens
Interazioni omotipiche Calcio dipendenti
Glicoproteine transmembrana di tipo monomerico
1- dominio extracellulare:
•sito di legame omotipico
•diversi siti di legame per il Ca2+
2-dominio intracellulare:Lega le catenine
TIPO
TESSUTI
STRUTTURA
INTRAC. BP
FILAMENTI
CITOPLASM
E-caderina
P-caderina
Cellule
epiteliali
Giunzioni
aderenti
Catenine,
Alfa actinina
Actina
Caderina
desmosomiale
Epidermide e
placenta
desmosomi
Desmoplachinepak
oglobina
Keratina;
desmina
N-caderina
Nervo,
muscolo,
lente
Giunzioni
aderenti
Catenine,
alfa actinina,
vinculina
actina
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Desmosoma
L’associazione delle caderine al citoscheletro avviene attraverso le
catenine:
Es:
caderina - - beta catenina - - alfa catenina - - actina
Le associazioni celula-cellula mediate da caderine e catenine sono
fondamentali per:
- regolazione della motilità
- proliferazione
- differenziamento
- inibizione da contatto
Ruolo della beta catenina nel pathway
Wnt
Il 20% dei tumori del colon è dovuto
a mutazioni della beta catenina che
la rendono priva dell’aggancio per il
complesso di distruzione
(dominante)
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Integrine
Cell to Cell AND Cell to Matrix Binding Calcium dependent adhesion molecules
Proteine eterodimeriche di membrana con 2 subunità legate in modo NON covalente
…
• VLA o CD49a-hCD29
Mediano l’attacco ala ECM
(eccezione VLA4, che lega VCAM-1)
• LFA-1 o CD11a-cCD18
Mediano l’adesione dei leucociti
(CR3 e CR4 mediano
l’extravasazione dei leucociti; inoltre
CR3 lega C3b e il fibrinogeno)
• altre sottofamiglie: legano la ECM
e le proteine della coagulazione
Le integrine formano
EMIDESMOSOMI
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alfa-actinina, talina, vinculina
Il nome “integrine” deriva dalla ipotesi che questa
famiglia “integri” i segnali trasmessi dai ligandi
extracellulari con :
-la mobilità citoscheletro-dip.
-cambiamenti di forma
-risposte fagocitarie
…
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appropriate ligands
mechanical
forces are
transmitted from
the ECM via
integrins
Collegamento tra segnali di adesione e espressione genica
Stresses absorbed by the cytoskeleton activate key intracellular signaling molecules
physically residing on cytoskeletal components.
Esempi di alterazioni delle adesioni in cellule di tumore maligno
1. Alterazioni Caderine: c’è una relazione quasi costante tra riduzione
dell’espressione di caderine e malignità cellulare!
• Diminuzione dell’espressione di E-caderina
• Mutazioni della E-caderina (+ raro. Studio su famiglia di Neozelandesi…)
• Catenine non funzionali
2.
Alterazioni integrine
Le cellule tumorali possono anche produrre integrine non fisiologiche
Es: l’integrina β3, a seguito di splicing alternativo, può agire come anti-integrina e facilitare la migrazione
cellulare, e quindi le metastasi
Effetti delle alterazioni: atipie, capacità invasiva e metastatica, segnali
di differenziazione-trasformazione
Distacco della cellula dal tumore primitivo e invasione dei tessuti
circostanti!
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ALTRE MOLECOLE IMPLICATE NEL PROCESSO METASTATICO:
Le chemochine
Le chemochine sono una famiglia di
citochine proinfiammatorie a basso peso
molecolare, che legano G-proteins
coupled receptors con 7 eliche transmembrana.
La loro funzione primaria è la chemoattrazione e
l’attivazione di specifici leucociti in varie risposte
infiammatorie, ma si è scoperto che esse
sono coinvolte in tutte le fasi dello
sviluppo tumorale (incluse invasione,
angiogenesi e extravasazione in siti
specifici)
3Decoy-receptors:
-DARC (lega ERL+ (glutammato-leucina-arg.)
-D6
-CCX-CKR
Ciascun recettore per le chemochine può legarne più di un tipo, ma solo dello stesso
gruppo. Perciò, vi sono 4 classi di recettori (CR, CXCR…)
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Step 2
Invasione della ECM
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BM = membr. basale
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Degradazione enzimatica della ECM
Le cellule tumorali producono esse stesse o inducono i macrofagi infiltranti e i
fibroblasti a produrre proteasi
3 classi di proteasi:
1. Proteasi a Serina: uPA o urochinasi
2. Proteasi a Cisteina
3. Collagenasi: MMPs
La produzione di MMPs e di altre proteasi è guidata anche da
chemochine (es. CXCL8 induce l’espressione del gene per MMP2) 
le chemochine hanno un ruolo anche nella invasione della ECM
Man mano che la ECM viene degradata, essa (formata da collagene, glicoproteine e
proteoglicani) espone domini proteici criptici
e invia segnali di crescita positivi e negativi alle cellule tumorali, che regolano
- angiogenesi (VEGF),
- crescita tumorale (FGF2 e TGFbeta)
- chemotassi.
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FUNZIONI (NUMEROSE) DELLE
MMPs
The matrix metalloproteinases (MMPs) form a family of
multidomain zinc endopeptidases.
MMPs promote tumour progression not only through
ECM degradation, as originally thought, but also
through signalling functions:
MMPs
•counter apoptosis
•orchestrate angiogenesis
•regulate innate immunity
•promote metastasis and tumour growth.
As a result, stromal and immune-defence responses eventually fail,
resulting in immune-cell evasion, phenotypic evolution of metastases,
chemotherapeutic resistance and further tumour dissemination.
TIMPs The main physiological inhibitors of the MMPs are the tissue
inhibitors of metalloproteinases (TIMPs), which form tight 1:1 complexes
with their cognate MMP catalytic domains, but do not considerably
distinguish between the different MMPs,
except for the weak activity of TIMP-1 for the MT-MMPs.
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Through disruption of cell–cell contacts, MMPs also initiate epithelial–mesenchymal
transition and genomic instability!
MMP3 cliva il dominio extracell di E-caderina, promuovendo la EMT!
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Transizione epitelio- mesenchimale = EMT
The E-cadherin cell junctions disintegrate, and the cells change from a
relatively cuboidal shape to a flattened elongate shaped configuration.
Leading edge protrusions adhere to the surrounding ECM and the actin-myosin
cytoskeletal complex contracts to pull the cell ahead.
Le EMT è una fonte di CAFs (fibroblasti tumore-associati)
Motilità della cellula tumorale in vitro
Figure 17: Adhesion dynamics at the rapidly migrating front
of a B16 mouse melanoma cell moving on laminin
Figures 11A-E: Some members of the
tip complex in lamellipodia and filopodia.
Figure 12: Schematic illustration of interactions in the
lamellipodium. Lamellipodia are formed by the generation of an actin
meshwork through the initiation of actin polymerisation by the
addition of actin monomers (red dots) at the cell membrane. Protein
complexes recruited to the membrane control the polymerisation
process in response to signaling stimuli. Other actin-binding proteins
serve to cross-link the actin network. Turnover of the lamellipodium
components occurs through the depolymerisation of most of the actin
filaments towards the base of the lamellipodium by destabilising and
severing factors (scissors).
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La motilità della cellula tumorale in vivo è diversa da quella in vitro!
In vivo le cellule tumorali si muovono ad alte velocità (15micrometri/minuto) e possono
cambiare rapidamente forma e direzione.
Focal adhesions characteristic of cell–matrix interactions are not usually seen in vivo, because they take
many minutes to form
In base ai dati attuali, vi sono tre distinte modalità di migrazione in vivo:
Modalità allungata (tipica dele cellule mesenchimali)
Modalità con lamellipodi (tipica dei leucociti)
Modalità collettiva (usata durante la morfogenesi epiteliale)
Alcune cellule tumorali possono compiere uno switch tra le diverse modalità.
Es: colon carcinoma cells with an elongated mesenchymal phenotype can be converted to
amoeboid motility by knockdown of SMurF1, an e3 ubiquitin ligase that targets rHOA for
degradation.
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Microambiente prometastatico
Non tutte le cellule di un tumore maligno sono
mobili, e le cellule mobili non sono
uniformemente distribuite.
(ETEROGENEITA’ DELLA POPOLAZIONE
TUMORALE)
In modelli animali di metastasi, metodiche di in
vivo imaging hanno mostrato l’associazione
tra la presenza di macrofagi (richiamati da
prodotti delle cellule tumorali) e la presenza di
cellule invasive
I macrofagi possono promuovere il comportamento invasivo
producendo Epidermal GF
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Si è dimostrato che il macchinario di polimerizzazione dell’actina è più attivo nelle cellule
tumorali mobili rispetto a quelle non mobili.
1. Aumentata attività del complesso ArP2/3 (per attivaz. Di EGFR)
2. Aumentata attività della cofilina
Experimental interference with either
ArP2/3 or cofilin function can reduce tumour metastasis
in mouse models of melanoma and breast cancer
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2 meccanismi, provocano iperespressione del suddetto macchinario:
Once actin has polymerized, the phosphorylation of
myosin light chain (MLC) promotes interactions
between myosin and F-actin that generate contractile
force.
Many kinases can phosphorylate MLC; however, in the context of amoeboid cell
motility, regulation by ROCK (Rho-associated coiled coil containing kinase) is
particularly important.
ROCK can either:
• directly phosphorylate MLC or
• phosphorylate and inhibit the phosphatase of MLC (MYPT)
Receptors, such as epidermal
growth factor receptor (EGFR),
capable of sensing chemotactic
gradients, are shown in yellow.
Activation of these receptors can
promote ARP2/3- and cofilindependent actin polymerization,
ROCK-dependent contraction of the cell cortex also enables the cell to squeeze
between collagen fibres and will generate hydrostatic pressure within the cell that
may aid cell protrusion. Cell-matrix adhesion molecules are diffusely localized
around the cell.
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In vivo i complessi actomiosinici sono “corticali”
Contraction of cortical acto–myosin can also generate points of constriction in the cell
body that enable cells to squeeze between and around collagen fibres.
Squeezing between collagen fibres abrogates the requirement to cleave the fibres .
The relationship between matrix proteolysis and cell motility is more complex than was
initially thought!
Questo spiegherebbe perché i farmaci inibitori delle MMPs non hanno un effetto determinante
nel contrastare la metastatizzazione
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Step 3
Angiogenesi
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1.
Angiogenesi
Riparazione delle ferite, ciclo
mestruale
vs
vasculogenesi
Sviluppo embrionale
L’angiogenesi che si verifica nel tumore non è fisiologica
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Nuovo modello di angiogenesi: 2 possibilità
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Molecole coinvolte
nella formazione dei vasi:
-VEGF
-VEGFR-2
-FGF-2 (ruolo ausiliario)
Molecole coinvolte nella
stabilizzazione
-angiopoietine (Ang1 e Ang2)
-PDGF (reclutam. cellule muscolari lisce)
-TGF beta (deposiz. proteine ECM)
Ang1+Tie2 - reclutamento cellule periendoteliali
- maturazione vasi
- quiescenza cellule endoteliali
Ang2+Tie2  sensibilizzazione cellule endoteliali al VEGF
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Figure 1. HIF-1 promotes the survival
of HCs, hematopoietic cells, which
supply VRGF.
HIF-1 (hypoxia inducible factor-1)
is a key transcriptional regulator
for hypoxic regulation of
embryonic vascular development.
HIF-1 is an oxygen-sensitive, dimeric
complex composed of HIF-1 alpha and
HIF-1 beta/ARNT (aryl hydrocarbon
receptor nuclear translocator)
subunits.
• During conditions of normoxia, HIF-1
beta is found in the nucleus, while HIF1 alpha is cytoplasmic and rapidly
degraded by a ubiquitin-proteosome
system.
• In mammalian cells, reduced oxygen
levels permit the accumulation of HIF1 alpha protein in the cytoplasm.
Subsequently, HIF-1 alpha translocates
to the nucleus, engages HIF-1 beta,
and forms the HIF-1 complex that
initiates VEGF transcription and mRNA
stabilization.
Formation of the HIF-1 complex
typically occurs during solid tumor
formation (increased oxygen
demand) and fetal development
(inadequate oxygen deliver)
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Fattori anti - angiogenetici

Angiostatine

Endostatina

Arrestina
Canstatina
Tumastatina
Trombospondina



formate a partire dal plasminogeno da
MMP2, MMP3, MMP7, MMP9 e MMP12
derivata dal collagene XVIII ad opera di
MMP3, MMP9, MMP12, MMP13 and MMP20
derivata dalla proteolisi dell collagene IV.
Endostatin is a broad spectrum angiogenesis inhibitor
and may interfere with the pro-angiogenic action of
growth factors such as bFGF/FGF-2 and VEGF
Ad essere determinante è il BILANCIO tra fattori pro-angiogenetici e fattori
anti - angiogenetici
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Step 4
Intravasazione
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L’intravasazione può essere un processo
attivo o passivo
ATTIVO 
passivo 
I GRADIENTI CHEMOTATTICI PARTECIPANO ALL’INDUZIONE
DELL’INTRAVASAZIONE
Es. I macrofagi tumore-associati spesso si raggruppano
attorno ai vasi e ai margini del tumore e possono stabilire un
gradiente di EGF nell’ambiente che attrae le cellule tumorali
nei vasi e così promuove l’intravasazione
(EGFR è sensibile al gradiente chemotattico)
VEGF-A enhances spontaneous metastasis by inducing
intravasation of heterogeneous tumor cell clusters,
surrounded by vessel wall elements, via an invasion
independent
mechanism. Oncogene (2007)
micronodular structure of the VEGF-A tumor and the
coverage of these nodules by pericytes and endothelial
cells
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In situ imaging has unambiguously
demonstrated that
GFP-labelled tumour cells can form
part of the lumen of blood vessels.
This behaviour is thought to
be associated with the expression
of some genes usually
restricted to endothelial cells by
tumour cells.
In these cases entry into the
bloodstream may simply involve the
detachment of a tumour cell that is
forming part of a vessel wall.
In vitro analysis
has shown that interstitial flow can establish autocrine
gradients that signal through CC chemokine receptor 7
(CCR7) to drive cell movement in the same direction
as the interstitial flow. However, it remains unclear
wheather movement directed towards lymphatic
vessels depends on interstitial pressure in vivo
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3 vie di disseminazione:
1. Linfatica
2. Ematica
3. Attraverso le superfici e le
cavità
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Una volta in circolo, le cellule tumorali formano aggregati per
- Adesione omotipica tra celule tumorali
- Adesione eteropica tra cellule tumorali e piastrine
la formazione di tali aggregati favorisce la sopravvivenza e la
capacità di impianto
Infatti: una volta in circolo, le cellule tumorali si fermano rapidamente
nei capillari
Arrest can be caused by:
- the large physical size of tumour cells
relative to the capillary lumen.
- active adherence to endothelia, even
when not restricted by the diameter of the
vessel.
Both types of arrest can be associated with
and increased by platelet aggregation
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IL TRAFFICKING DELLE CELLULE
CANCEROSE NEI VASI RISENTE
DELL’ESPRESSIONE DI SPECIFICHE
MOLECOLE DI ADESIONE E DI FATTORI
CHEMOTATTICI : pathway di adesione e di
distacco
Extravasazione
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Step 5
Extravasation typically
occurs a few hours after
attachment
to the vessel wall;
cell protrusions and
deformation
of the nucleus has been
observed in mammary
tumour cells crossing an
endothelium, implying that
it is an active process
In some cases metastatic tumour
cells can proliferate within the vessel, and the
increasing mass of cells in the capillary could physically
disrupt the endothelium and allow tumour cells to
enter the surrounding tissue
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EXTRAVASAZIONE IN SITI SPECIFICI:
il problema dell’ “homing”
Quali sono i fenomeni che spiegano la specificità?
1. Le cellule endoteliali di un particolare distretto esprimono sulla superficie delle
molecole di adesione specifiche che vengono riconosciute dalle cellule
metastatizzanti
2. Organi diversi offrono condizioni più o meno favorevoli per la crescita delle
metastasi di un determinato tipo di tumore (Paget’s ‘seed and soil’ hypothesis )
3. Alcuni tessuti esprimono chemochine e altre molecole chemoattrattanti che
“attirano” con un gradiente chemotattico tipi specifici di cellule cancerose
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Bibliografia essenziale
1. Illuminating the metastatic process
Erik Sahai NATURE REVIEWS | CANCER VOLUME 7 | OCTOBER 2007
2. Validating matrix metalloproteinases as drug targets and anti-targets for cancer therapy
Christopher M. Overall and Oded Kleifeld NATURE REVIEWS | CANCER VOLUME 6 | MARCH 2006
3. Small integrin-binding ligand N-linked glycoproteins (SIBLINGs):
multifunctional proteins in cancer Akeila Bellahcène*, Vincent Castronovo*, Kalu U. E. Ogbureke‡, Larry W. Fisher
and Neal S. Fedarko NATURE REVIEWS | CANCER VOLUME 8 | MARCH 2008 |
4. VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche Rosandra N. Kaplan1,2,6 et al. NATURE|VOL
438|8 DECEMBER 2005
5. Genes Associated With Breast Cancer Metastatic to Bone
Marcel Smid, JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY VOLUME 24 NUMBER 15 MAY 20 2006
6. Tumour-mediated upregulation of chemoattractants and recruitment of myeloid cells predetermines
lung metastasis Sachie Hiratsuka1 et al. NATURE CELL BIOLOGY VOLUME 8 | NUMBER 12 | DECEMBER 2006
7. Fibroblasts in cancer Raghu Kalluri*‡ and Michael Zeisberg* NATURE REVIEWS | CANCER VOLUME 6 | MAY 2006
8. Chemochines: key players in cancer; M. Arya et al. CURRENT MEDICAL RESEARCH AND OPINION VOL 19 2003
9. Integrin trafficking and its role in cancer metastasis; Alan G. Ramsay et al. CANCER METASTASIS REVIEW 2007
10. Cellular Mechanobiology and Cancer Metastasis; Milan Makale* BIRTH DEFECTS RESEARCH (2007)
11. TGFb Primes Breast Tumors for Lung Metastasis Seeding through Angiop.-like 4, David Padua,CELL April2008
12. A Naturally Occurring Truncated β3 Integrin in Tumor Cells - Native Anti-Integrin Involved in Tumor Cell Motility ; Rongxian Jin1 CANCER
BIOLOGY & THERAPY 6:10, 1559-1568; OCTOBER 2007]; ©2007
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