Messa in evidenza tramite Real-Time PCR
del gene della tossina
Panton-Valentine leucocidina
in ceppi di
Staphylococcus aureus meticillino resistenti
di acquisizione ospedaliera ed extra ospedaliera
.
Lavoro di Diploma
Ardia Claudia
SSMT
2005/2006
Ricerca eseguita presso:
Istituto Cantonale di Microbiologia
Responsabile:
D.ssa Martinetti Lucchini Gladys
1
RIASSUNTO
ABSTRACT
L’aumento dei ceppi batterici multi-resistenti,
dovuto
all’esposizione
continua
agli
antibiotici per lungo tempo e all’abuso di
quest’ultimi, sta diventando un grosso
problema ospedaliero a livello mondiale.
Fanno parte di queste famiglie multi-resistenti
gli Staphylococcus aureus meticillino
resistenti (MRSA).Oltre agli Staphylococcus
aureus MRSA d’origine nosocomiale, ci sono
anche famiglie di Staphylococcus aureus
MRSA d’origine ambientale, la cui resistenza
alla meticillina è già geneticamente
predisposta dal battere e non acquisita come
succede nei ceppi ospedalieri. Alcuni studi,
non ancora definitivi, stanno mettendo in
evidenza la presenza del gene della tossina
Panton-Valentine leucocidina (PVL) negli
Staphylococcus aureus MRSA di origine
ambientale piuttosto che negli Staphylococcus
aureus MRSA di origine ospedaliera. La
teoria ipotizzata da questi studi è la possibilità
che il gene PVL diventi un marcatore che ci
permetta di differenziare l’origine degli
Staphylococcus aureus MRSA. Qui è nata
l’idea e l’esigenza di questo lavoro di
diploma. L’obiettivo di questo lavoro di
diploma è mettere in evidenza, tra tutti i
campioni presi in considerazione, i ceppi che
possiedono il gene PVL e valutare se i miei
risultati concordano con le nuove teorie.
L’obiettivo di questo lavoro di diploma è stato
quello di assemblare 300 campioni di
Staphylococcus aureus MRSA di origine
nosocomiale
e
100
campioni
di
Staphylococcus aureus MRSA di origine
comunitaria
dalla collezione dell’Istituto
Cantonale di Microbiologia e amplificarli
tramite la tecnica in Real–Time PCR per
mettere in evidenza l’eventuale gene PVL.
Le varie amplificazioni hanno messo in
evidenza il gene PVL nel 11% dei ceppi
MRSA di origine comunitaria rispetto al 1.3%
dei ceppi ospedalieri. La maggior parte dei
ceppi PVL positivi sono stati
isolati
soprattutto da strisci ferita di varia gravità e
sono stati coinvolti maggiormente i bambini e
gli adulti.
In conclusione i risultati ottenuti sono stati
interessanti e concordanti con i nuovi studi
pubblicati
The increase of multiresistant bacterial strains
in the hospital environment in due to the
selection pressare of antibiotic use.
Methicillin-resistant Staphylococcus aureus
(MRSA) is a major cause of hospital-acquired
infection worldwide. Recently, however, there
have been reports indicating an increased
incidence of MRSA infections afflicting
individuals with no apparent risk for hospital
acquisition.
These
community-acquired
MRSA strains possess several features that
distinguish them from nosocomial MRSA.
In particular they carry thes genes for PantonValentine leucocidin (PVL), a bicomponent
cytotoxin virulence factor associated with
skin and soft-tissue infections. The aim of my
diploma work is ha detect PVL gene in
nosocomial and community acquired MRSA
strains. Using Real-Time PCR, a fragment of
the PVL gene is amplified with specific
primers. A melting curve analysis was
performed; this enables an assessment of the
specificity of the amplication reaction.
The Istituto Cantonale di Microbiologia is
collecting MRSA isolates since 1992.
Two different collections were included in
this study. The first collection of 300 strains
was isolated from hospitalized patients from
1997-2006, the second from private patients
from 1997-2006. Those collections were
investigated for the presence of the genes
coding for PVL. Results of the study indicate
a prevalence of PVL positive isolates in the
community-acquired MRSA strains.
The incidence was 11% comparing to 1.3% of
the nosocomial isolates. The majority of
strains were isolated from wound swabs, the
patients were especially in children and young
adults. My results are interesting and in
complete agreement with studies published
recently.
1
INDICE
Pagina
Introduzione …………………………………………………………………… 1-5
Le forme dei batteri ……………………………………………………………… 1
Struttura generale di un battere ………………………………………………….. 2-3
• Parete cellulare ………………………………………………………………… 2
• Membrana citoplasmatica …………………………………………………… 2-3
• Citoplasma ……………………………………………………………………... 3
• Nucleoide/Plasmide ……………………………………………………………. 3
• Ribosomi ……………………………………………………………………….. 3
• Capsula ………………………………………………………………………… 3
• Flagelli …………………………………………………………………………. 3
• Pili …………………………………………….………………........................... 3
• Fimbrie …………………………………………………………………..…....... 3
La colorazione di Gram ……………………………………………………………. 4
Lo Staphylococcus aureus …………………………………………………………. 4
Lo Staphylococcus aureus MRSA e il gene PVL …………………………………. 5
Obiettivi del lavoro ………………………………………………………………. 6
Materiale e metodi …………………………………………………………….. 7-12
Criteri di selezione ………………………………………………………………… 7
Test MRSA-Screen ……………………………………………………………… 8-9
L’estrazione del DNA batterico ……………………………………………………. 9
Real-Time PCR ………………………………………………………………… 9-12
• LightCycler 2.0 …………………………………………………………….. 9-10
• MasterMix ……………………………………………………………………. 10
• Programma Staph. PVL ……………………………………………………. 11-12
• Controllo positivo …………………………………………………………….. 12
Risultati/Discussione …………………………………………………………. 13-14
Conclusione ………………………………………………………………………. 15
Bibliografia ……………………………………………………………..………... 16
Ringraziamenti ………………………………………………………………….. 17
Allegati ……………………………………………………………………..… 18-26
• Metodica MRSA-Screen …………………………………………………. 19-20
• Metodica estrazione DNA …………………………………………………… 21
• Metodica estrazione controllo positivo ……………………………………… 22
• Lotto dei Kit utilizzati ……………………………………………………. 23-26
INTRODUZIONE
LE FORME DEI BATTERI
I batteri sono microrganismi procarioti di piccole dimensioni, che possono variare tra lo 0.3-5 µm, e
di differenti forme.
Le forme principali sono i cocchi, di forma sferica, i bacilli diritti, che hanno una forma a
bastoncello e i bacilli spiraliforme, di forma bastoncellare ma più ricurva.
I cocchi possiamo trovarli disposti in modo singolo, a coppie (diplococchi), raggruppati a forma di
grappolo (stafilococchi) o in fila come una catena (streptococchi), i bacilli diritti, generalmente,
sono disposti singolarmente (piccoli, lunghi, tozzi,..) in modo casuale, a forma di clava
(Corinebatteri) o con le estremità appuntite (Fusobatteri), mentre i bacilli spiraliforme possono
essere incurvati (Vibrioni) o incurvati a spirale (Spirilli, Spirochete) [1,2].
Figura 1 L’immagine mostra la possibile morfologia delle tre
Figura 1:
classi batteriche, i cocchi, i bacilli diritti e i bacilli spiraliforme; la
posizione delle varie spore e dei flagelli [1].
1
STRUTTURA GENERALE DI UN BATTERE
Un battere è formato da una parete cellulare e dalla membrana citoplasmatica, dette strutture
esterne, e da strutture interne quali il citoplasma, il nucleoide ed i ribosomi.
Inoltre alcune specie batteriche possono avere anche delle strutture facoltative come la capsula, i
flagelli, i pili e le fimbrie.
Figura 2 L’immagine rappresenta il modello di un
battere con le strutture interne e facoltative [2].
Parete cellulare:
È composta da sostanze chimiche presenti solo nei batteri come l’acido diamminopimelico, l’acido
muramico, l’acido teicoico, degli amminoacidi, come ad esempio gli amminozuccheri,
dei carboidrati e dei lipidi.
Unendosi tra di loro formano delle sostanze polimeriche, di cui una molto importante: la mureina.
La mureina, o peptoglicano, è indispensabile perché fornisce alla parete cellulare la sua
struttura rigida che conferisce al battere la sua forma.
La parete cellulare dei batteri gram negativi ha una struttura più ricca di amminoacidi e lipidi
rispetto ai batteri gram positivi, che però contengono una maggiore quantità di mureina.
Le funzioni della parete cellulare sono: evitare la lisi osmotica del battere, protezione della cellula
batterica dall’esterno e riconoscimento di batteri o virus nelle vicinanze.
Membrana citoplasmatica:
La membrana citoplasmatica, si trova subito dopo la parete cellulare ed è formata da un doppio
strato di fosfolipidi con intercalate delle proteine.
Soprattutto nei batteri gram positivi, in alcuni punti, la membrana forma dei prolungamenti chiamati
mesosomi (che svolgono funzioni analoghe alla membrana citoplasmatica).
La membrana batterica è molto simile alla membrana cellulare delle cellule eucariote, ma non
contiene colesterolo che, negli eucarioti, funge da protezione per le variazioni osmotiche,
infatti, i batteri hanno la parete cellulare che svolge anche questa funzione di protezione osmotica.
La membrana citoplasmatica ha una funzione: selettiva, grazie alla proteina permeasi che regola
l’entrata delle sostanze nutritive dall’esterno all’interno della cellula; di trasporto (proteine di
2
trasporto) per le sostanze che devono entrare o uscire dalla cellula; secretoria, cioè che secerne
esoenzimi (che servono alla digestione di molecole grandi fuori dalla cellula) ed esotossine.
Inoltre, sulla membrana, troviamo delle proteine che servono: alla regolazione e separazione del
DNA durante la divisione cellulare, da enzimi che prendono parte al processo di produzione di
energia (catena respiratoria), da enzimi necessari alla sintesi della parete cellulare (durante la
divisione cellulare) e presenza di proteine sensoriali, cui scopo è ricevere informazioni dall’esterno.
Citoplasma:
Il citoplasma è il luogo dove avvengono tutte le reazioni chimiche del battere, esso è formato
soprattutto d’acqua, dai ribosomi, enzimi, polisaccaridi come l’amido e il glicogeno, ed altre piccole
molecole organiche.
Nel citoplasma è contenuto anche il nucleoide.
Nucleoide/Plasmide:
Il nucleoide è formato da un lungo filamento di DNA a doppia elica, cioè il cromosoma batterico,
libero nel citoplasma e senza un nucleo attorno.
Il cromosoma batterico contiene tutte le informazioni che servono al battere per riprodursi e vivere.
Il plasmide è una piccola sequenza di DNA di forma circolare, indipendente dal nucleoide, presente
in quasi tutti i batteri, che contiene informazioni supplementari.
Le informazioni più importanti che possono essere trasmesse da battere a battere tramite il plasmide
sono le resistenze agli antibiotici.
Ribosomi:
I ribosomi sono degli organelli situati in gruppo vicino alla membrana cellulare e hanno il compito,
di sintetizzare le proteine partendo dal RNA messaggero.
Capsula:
La capsula è uno strato, più o meno spesso, di polipeptidi che avvolge il battere e che lo rende più
virulento, cioè più resistente agli attacchi del sistema immunitario rendendo più difficile la sua
fagocitosi.
Questi polipeptidi sono del materiale di scarto che il battere produce quando si trova in un ambiente
favorevole.
Flagelli:
I flagelli sono delle appendici composte da una proteina elastica, la flagellina, che ruotando su se
stessi, permettono il movimento attivo del battere.
Sono ancorati alla parete cellulare e possono disporsi in unità singole, monotrichi, diverse unità
disposte in un area precisa, lofotrichi, o sparse su tutta la superficie batterica, peritriche.
I batteri sprovvisti di flagelli, possono spostarsi solo passivamente tramite peristalsi, per inerzia, con
una corrente o tramite l’organismo ospite.
Pili:
I pili sono dei piccoli tubi cavi che partono dalla parete cellulare, e servono allo scambio di
materiale genetico (p. esempio i geni della resistenza ad un antibiotico) tra batteri.
Fimbrie:
Le fimbrie sono dei tubi simili ai pili, ma non sono cavi, e servono al battere per aderire meglio alle
superfici delle cellule, aumentando così la sua patogenicità [1,2].
3
LA COLORAZIONE DI GRAM
La colorazione di Gram fu inventata dal fisico danese Hans Christian Gram [3], ed è una tecnica
semplice, veloce, a basso costo, che permette di dividere i batteri in gram positivi (color viola) e
negativi (color rosa), col vantaggio di poter inoltre distinguere la morfologia di quest’ultimi [4].
Principio della colorazione:
Inizialmente il materiale viene strisciato su un vetrino e poi fissato con metanolo puro, una volta
asciutto si copre il materiale con una soluzione di violetto di genziana (primo colorante), che entra
all’interno della parete cellulare; in seguito il materiale viene ricoperto con un'altra soluzione
chiamata Lugol (mordente), che forma un complesso col violetto di genziana.
Per la fase di decolorazione viene utilizzato l’alcool-acetone, che serve ad asportare fuori dalla
cellula il complesso violetto di genziana-Lugol.
L’asportazione del complesso dipende dalla permeabilità della parete cellulare del battere, quindi
più la parete cellulare è permeabile, più il battere tenderà a decolorarsi eliminando il colore viola
(violetto di genziana); viceversa se la parete cellulare è poco permeabile il battere avrà una
colorazione viola.
Questa fase è abbastanza delicata, perché se decoloriamo troppo rischiamo di togliere a tutti i batteri
la colorazione viola, mentre se decoloriamo troppo poco vedremo solo batteri viola; alterando così
l’interpretazione del preparato.
Comunque l’occhio esperto non si basa solo sulla colorazione, ma anche sulla morfologia, il modo
in cui si dispone il battere e prende in considerazione anche il tipo di materiale che sta guardando.
Dopo la fase di decolorazione, bisogna dare un colore ai batteri decolorati in modo da metterli in
evidenza, e per fare ciò viene usata la fucsina, che dà un colore rosa [5].
LO STAPHYLOCOCCUS AUREUS
Lo Staphylococcus aureus fa parte dei cocchi gram positivi, anaerobio facoltativo ed è visibile nei
preparati con la colorazione di Gram, dove appare in gruppi a forma di grappolo.
Sulle piastre di coltura, a occhio nudo, la sua colonia appare “bombata”, di colore panna-oro e, ma
non di regola, su piastra agar-sangue intorno alla colonia può formarsi un alone di emolisi totale
(β-emolisi).
Tutti gli stafilococchi sono catalasi positivi, mentre solo lo Staphylococcus aureus è anche
coagulasi positivo.
Le principali patologie provocate da enzimi e tossine prodotte dallo Staphylococcus aureus sono:
Affezioni cutanee: foruncoli, ascessi, acne, impetigine, infezioni di ferite.
Tossinfezioni alimentari: gastroenteriti (nausea, vomito, diarrea) senza febbre, dopo 1-10 ore
dall’ingestione di alimenti (carne, creme, latticini, gelati..) contaminati
da enterotossine.
Infezioni respiratorie: sinusiti, broncopolmoniti, pleuriti.
Infezioni ematogene: setticemie, meningiti.
L’habitat principale dello Staph. aureus sono la cute e le mucose, soprattutto le narici del naso.
La trasmissione da un individuo all’altro, avviene soprattutto in maniera diretta tramite le mani o
indirettamente tramite l’aria, ad esempio con uno starnuto [1,2,6].
4
LO STHAPYLOCOCCUS AUREUS MRSA E IL GENE PVL
A livello ospedaliero esistono dei ceppi batterici che, grazie ad una continua esposizione agli stessi
medicamenti, alla loro mutazione e selezione, e ad uno scambio di informazioni genetiche,
sviluppano una resistenza ad uno o più antibiotici.
Questi batteri vengono chiamati multi-resistenti.
Lo Staphylococcus aureus meticillino resistente (MRSA) è un battere che fa parte dei ceppi multiresistenti che a livello ospedaliero sta creando grossi problemi, sia per la sua resistenza alla
meticillina, un antibiotico creato per inibire la crescita dei batteri gram positivi resistenti
all’antibiotico penicillina, per la presenza di penicillinasi, sia per la sua facile diffusione.
Questi ceppi batterici, inoltre, risultano resistenti anche a tutti i β-lattamici e alle cefalosporine.
La presenza di ceppi MRSA in un ospedale è fortemente correlata ad un aumento delle batteriemie
causate da questo microrganismo, questo fenomeno comporta un aumento sia dei costi che della
lunghezza della degenza ospedaliera.
Malgrado lo Staphylococcus aureus MRSA è considerato un battere di origine ospedaliera, ci sono
alcuni ceppi di origine comunitaria.
Questi ceppi comunitari di Staphylococcus aureus MRSA non hanno acquisito la resistenza alla
meticillina tramite una continua selezione degli antibiotici.
Alcuni studi stanno lavorando sugli Staphylococcus aureus MRSA di origine comunitaria e stanno
mettendo in evidenza un gene che la maggior parte di questi ceppi hanno: il gene della tossina
Panton-Valentine leucocidina (PVL).
Questo gene da origine ad una tossina, la tossina Panton-Valentine leucocidina.
Tutti i ceppi di Staphylococus aureus producono più di 30 tipi di prodotti extracellulari.
Quasi tutti i ceppi secernono un gruppo di enzimi e citotossine tra le quali diversi tipi di emolisine,
nucelasi, proteasi, lipasi e collagenasi. PVL e ,γ emolisine sono considerate appartenenti alla stessa
famiglia, infatti agiscono entrambe sulla membrana cellulare per sinergia di due proteine che
formano un poro.
Lo Staphylococcus aureus MRSA con il gene PVL può causare gravi lesioni a dipendenza del luogo
infettato, ma soprattutto lesioni cutanee e complicazioni con possibilità di necrosi del tessuto
polmonare.
Per tutte queste ragioni, in tutto il mondo, sono stati formati dei gruppi di monitoraggio e di studi
per questo battere che sta diventando sempre più di grande importanza clinica
L’obiettivo finale di questo studio è quello di testare la diffusione del gene PVL nella collezione di
ceppi d’origine nosocomiale e comunitaria tra gli anni 1997-2006 dell’Istituto Cantonale di
Microbiologia di Bellinzona [7,8,9].
5
OBIETTIVI DEL LAVORO
•
Testare 400 campioni di Staphylococcus aureus MRSA di origine nosocomiale e
comunitaria con la tecnica in Real-Time PCR, con l’apparecchio LightCycler 2.0 della ditta
Roche, per mettere in evidenza un eventuale presenza del gene della tossina Panton
Valentine leucocidina (PVL).
•
Dopo aver testato i 400 campioni, valutare la percentuale dei ceppi batterici con il gene PVL
positivo, la provenienza del campione e il tipo di materiale da cui è stato preso il ceppo.
OBIETTIVO PERSONALE
•
Approfondire e migliorare, durante la stesura di questo lavoro, le mie conoscenze sulla
tecnica in RT-PCR e sull’apparecchio LightCycler 2.0 della ditta Roche.
6
MATERIALE E METODI
Il mio lavoro di ricerca, è cominciato selezionando 400 campioni di Staphylococcus aureus MRSA
dalle liste tra il 1997-2006 dell’Istituto Cantonale di Microbiologia, dove sono contenute tutte le
informazioni riguardanti il paziente, la provenienza del materiale (ospedaliero, da medico privato o
da cliniche) e che tipo di materiale è stato inviato.
A questo punto è stata fatta una scelta fra i vari campioni e con la mia responsabile, D.ssa Gladys
Martinetti Lucchini, abbiamo deciso i criteri di selezione:
•
•
•
•
•
I campioni devono essere scelti negli anni 1997-2006, e ogni anno deve essere
rappresentato.
Ogni prelievo di materiale deve essere unico, cioè sono stati scartati tutti i materiali che
avevano come provenienza lo stesso paziente.
I 300 campioni di origine ospedaliera devono provenire da reparti di degenza e sono stati
presi in considerazione tre tipi di materiale di partenza, 200 strisci ferita di vario tipo
(superficiali, profondi, strisci ascessi, necrosi, decubiti..), 70 espettorati e 30 uricult.
Per i 100 campioni di origine extra ospedaliera (medici privati), sono stati presi in
considerazione tutti i tipi di materiale d’origine (strisci orecchio, naso, emocolture, strisci
ferita, espettorati..), semplicemente perché altrimenti non era possibile avere un numero
sufficiente di campioni.
Sono stati scartati i campioni inviati da cliniche private perché ci siamo concentrati
strettamente sui materiali inviati dagli ospedali.
La decisione di prendere in considerazione soprattutto gli strisci ferita, gli espettorati e gli uricult è
dovuta al fatto che si è riscontrato un aumento degli Staphylococcus aureus MRSA con il gene PVL
in particolar modo in questi materiali.
Dopo aver creato delle nuove liste di lavoro, ho cercato ogni ceppo di Staphylococcus aureus
MRSA (tramite il loro numero di archiviazione), conservati in appositi terreni per la congelazione
(Skim Milk), nei congelatori a -80°C e, una volta individuati i vari ceppi, inseminarli con la tecnica
dei tre settori su piastre Agar-sangue (terreno di arricchimento, arricchito con sangue di montone,
dove è ben visibile l’emolisi dello Staphylococcus aureus).
La tecnica dei tre settori consiste nello spatolare con l’ansa il materiale da analizzare su una placca
in tre settori ben distinti in modo da diminuire la concentrazione del battere nel materiale, ottenendo
delle colonie ben separate nel terzo settore.
Quest’ultime verranno poi utilizzate per altri test d’identificazione.
Figura 3 In questa figura sono
stati messi in evidenza i tre
settori di una placca.
1) primo settore (troviamo una
patina dove il battere è
fortemente concentrato;
2) secondo settore e 3) terzo
settore (troviamo le colonie
batteriche isolate)[6].
7
In seguito alla messa su placca del battere, viene posizionato sul primo settore un dischetto
dell’antibiotico cefoxitina (dove il battere è più concentrato), in modo che le colonie batteriche che
si svilupperanno in prossimità del dischetto, serviranno per il test MRSA-Screen.
In seguito le piastre sono incubate 24 ore nel termostato a 35°C in CO2 , permettendo una crescita
ottimale del battere.
La cefoxitina è un antibiotico simile e della stessa famiglia dell’antibiotico meticillina, solo che ha
il vantaggio di far esprimere meglio al battere la proteina PBP2’ (Penicillin Binding Protein 2’), che
è responsabile della resistenza da parte del battere alla meticillina.
In seguito la piastra viene tolta dall’incubatore e controllata per verificare che sia pura, quindi viene
eseguito MRSA-Screen.
Figura 4 Questa fotografia rappresenta
la crescita di uno Staph. aureus MRSA su
placca Agar-sangue, con il dischetto di
cefoxitina nel primo settore [14].
TEST MRSA-SCREEN
Il kit MRSA-Screen, della ditta DENKA SEIKEN CO LTD di Tokyo, è un test qualitativo ad
agglutinazione finale per la ricerca del prodotto del gene mecA, la PBP2’ (Penicillin Bilding Protein
2’), che è responsabile della resistenza alla meticillina da parte degli Staphylococcus aureus (Staph.
aureus MRSA).
Il test MRSA-Screen è eseguito per verificare che la proteina PBP2’ non si sia degradata con la
conservazione del ceppo batterico.
Principio del test:
Il test è composto principalmente da due parti, inizialmente il materiale batterico (prelevato con un
ansa di platino dall’alone, massimo di 13 mm, attorno alla cefoxitina) viene incubato a 95°C per 3
min con il primo enzima di estrazione, in seguito viene aggiunto un secondo enzima di estrazione e
il tutto viene poi centrifugato.
Il primo enzima di estrazione, crea un pH alcalino che viene poi neutralizzato dal secondo enzima
di estrazione.
Il cambiamento di pH, permette di staccare la PBP2’ che si trova sulla membrana cellulare del
battere, per poi ritrovarla nel sopranatante.
La positività del test, cioè la presenza della proteina PBP2’, viene messa in evidenza tramite
l’agglutinazione del sopranatante batterico con degli anticorpi monoclonali specifici per la proteina
presa in questione.
8
Solo i ceppi positivi al MRSA-Screen vengono utilizzati per l’estrazione del DNA batterico, nella
quale si usa un protocollo rapido.
L’ESTRAZIONE DEL DNA BATTERICO
L’estrazione viene eseguita sotto cappa per evitare contaminazioni.
Prima di tutto sono risospese 3-5 colonie isolate di materiale batterico in 200 µl di IstaGene™
Matrix (precedentemente aliquotata nelle Eppendorf safe-look) con dei movimenti rotatori dell’ansa
di plastica, poi il tube viene vortexato.
Questo passaggio è molto importante perché nell’Istagene™ Matrix è contenuto un solvente che si
lega gli organelli e alle particelle che vengono rilasciate durante la lisi delle cellule batteriche.
Dopo di ciò, l’Eppendorf è incubata nel termoblocco a 95°C per 10 minuti; per favorire la lisi
batterica.
Le cellule lisate vengono centrifugate per 10 minuti a 10000 rpm per far scendere sul fondo tutte le
particelle pesanti (organelli legati al solvente), così che nel sopranatante rimane solo il DNA
purificato pronto per l’amplificazione.
Il DNA così estratto è conservato a 2-8°C.
Una volta fatto l’MRSA-Screen, confermando la resistenza alla meticillina, ed estratto il DNA da
ogni ceppo di Staphylococcus aureus, bisogna amplificare tramite la Real-Time PCR il DNA del
battere per la ricerca della tossina PVL.
REAL-TIME PCR
La Polymerase Chain Reaction (PCR) è una reazione che permette di amplificare in modo
esponenziale il DNA.
Per il mio lavoro viene utilizzata la Real-Time PCR che, oltre ad amplificare il DNA, permette di
monitorare in tempo reale il prodotto amplificato tramite l’utilizzo della molecola fluorescente
SYBR Green 1.
Questa tecnica in Real-Time PCR è utilizzata sull’apparecchio LightCycler 2.0 della ditta Roche
Diagnostics.
LightCycler 2.0
Il LightCycler 2.0 della ditta Roche Diagnostics è un apparecchio che permette di effettuare la
tecnica in Real-Time PCR in tempi brevi, circa 1 ora, grazie alla sua velocità nello scambio termico
(20°C /secondo).
L’apparecchio è formato essenzialmente da due unità: il sistema thermocycler e un unità ottica di
rilevamento.
Il sistema thermocycler è composto da una camera di riscaldamento, controllata da un sistema di
riscaldamento posto nel coperchio dell’apparecchio, che riscalda o raffredda l’aria prelevata
dall’ambiente esterno in base ai bisogni dalla reazione, mentre l’unità di rilevamento è formata da
un fluorimetro a microvolume che serve a emettere energia ad una particolare lunghezza d’onda che
eccita le molecole fluorescenti (SYBR Green 1) nel campione, e a rilevare la fluorescenza emessa a
sua volta dal campione.
Un'altra parte fondamentale del LightCycler 2.0 sono i capillari in borosilicio.
Il sistema thermocycler e il materiale di costruzione dei capillari permettono uno scambio termico
molto veloce, che consentono di effettuare la Real-Time PCR in tempi brevi.
L’apparecchio può amplificare un massimo di 32 campioni per run [11].
9
Figura 5 LightCycler 2.0 system
della ditta Roche Diagnostics [12].
MasterMix
Per effettuare la reazione in Real-Time PCR il DNA è incorporato in una soluzione di tutti i
componenti necessari per l’amplificazione del campione.
Il MasterMix che utilizzato, è costruito dalle componenti del kit LightCycler® FastStart DNA
Master SYBR Green della ditta Roche Diagnostics, e contiene:
•
•
•
•
La molecola SYBR Green 1 (responsabile della fluorescenza)
Taq DNA polymerase (enzima che permette l’amplificazione)
Reaction buffer (soluzione tampone)
dNTP (nucleotidi: dATP, dGTP, dCTP e dUTP al posto del dTTP)
Al MasterMix della ditta Roche Diagnostics si aggiunto i due primers PV 1 e PV 2 (sintetizzati
dalla ditta Microsynth GmbH di Balgach), l’acqua, il cloruro di magnesio (MgCl2 ) e l’UNG alle
concentrazioni specificate sotto.
I primer sono oligonucleotidi omologhi alle sequenze d’inizio e finali del frammento.
•
•
Primer Staph PV 1 (5’ GTA AAA TGT CTG GAC ATG ATC CA 3’)
Primer Staph PV 2 (5’ CAA S1TG TAT TGG ATA GCA AAA GC 3’)
L’efficienza dell’amplificazione è stata ottimalizzata variando la concentrazione dei primers, del
cloruro di magnesio e della temperatura di ibridazione dei primers.
Il mix finale è così composto [11]:
Componenti :
H2O PCR-grade
Master Mix SYBR Green 1
MgCl2
Primer STAPH PV 1
Primer STAPH PV 2
UNG
Totale
1
Conc. Finale
1x
4 mM
0.7 µM
0.5 µM
0.1 U
1 reazione
8.1 µl
2.0 µl
2.4 µl
1.4 µl
1.0 µl
0.1 µl
15.0 µl
S = C/G
10
Programma Staph. PVL
Lo Staph. PVL è il programma specifico per amplificare il DNA e determinare se il ceppo batterico
preso in questione ha il gene PVL.
Il programma è diviso in 4 parti: UNG, Denaturation, Amplification e la curva di Fusione.
CYCLES
UNG
DENATURATION
AMPLIFICATION
MELTING
COOLING
TARGET
HOLD
RAMP RATE
(°C)
(hh:mm:ss)
(°C)
1
37
00:05:00
1
95
00:10:00
20
95
00:00:10
20
35
52
00:00:05
20
72
00:00:18
20
95
00:00:10
20
1
65
00:00:05
20
95
00:00:00
0.1
Questa parte del programma serve unicamente a raffreddare i
componenti dell’apparecchio in modo da renderli maneggiabili.
Figura 6 Nella tabella è riportato il programma Staph PVL
con i dettegli dei vari step.
Il primo step (10 min a 37°C) serve ad attivare l’UNG (Uracil-DNA N-Glycosilase), l’enzima che
elimina le eventuali contaminazioni da DNA già amplificato, chiamate carry-over.
Durante l’amplificazione, nel mix, si sostituisce il nucleotide dTTP con il nucleotide dUTP, creando
così un DNA “artificiale”.
Nel caso di una contaminazione da DNA già amplificato, l’UNG si lega in modo specifico alla
sequenza in corrispondenza del nucleotide dUTP spezzando la catena nucleotidica.
Nel secondo step c’è la denaturazione totale del DNA, la disattivazione dell’UNG e l’attivazione
della Hot Start DNA Polymerase.
Questo genere di polymerase aumenta la specificità del prodotto, riducendo la formazione di primer
dimers.
Con denaturazione s’intende il cambiamento della conformazione del DNA, cioè la sua struttura a
doppia elica viene aperta e si creano due filamenti ben distinti.
Nel terzo step avviene l’amplificazione del materiale genetico.
Nel protocollo del programma Staph PVL l’amplificazione dura 35 cicli composti ognuno da tre
temperature diverse.
Nella prima parte si denatura il DNA ad una temperatura di 95°C.
Nella seconda parte la temperatura scende a 52°C permettendo l’ibridazione dei primers alle
sequenze omologhe.
Durante la terza parte la temperatura sale a 72°C e la Taq DNA polymerase riconosce i primer e
inizia la sua attività duplicativa utilizzando i nucleotidi dATP (A), dGTP (G), dCTP (C) e dUTP (U)
a sua disposizione appaiandoli in modo complementare, A-U(Adenina-Uracile) e C-G (CitosinaGuanina).
In questo caso al posto della Timina (dTTP) utilizzo l’Uracile (dUTP), che è una molecola simile
alla Timina , per i motivi che riguardano l’UNG.
In questa fase la molecola SYBR Green 1 si intercala tra, e solo, tra le basi del DNA amplificato
emettendo fluorescenza.
11
La fluorescenza emanata dalla SYBR Green 1 è proporzionale al DNA amplificato.
Il quarto step è rappresentato dalla curva di Melting, che è specifica per ogni prodotto amplificato,
in quanto è correlata alla sequenza del frammento.
Durante questa fase, composta da un solo ciclo, la temperatura si eleva da 65°C a 95°C in modo
molto lento, provocando una graduale denaturazione del DNA e una diminuzione costante della
fluorescenza.
Quest’ultima viene misurata in modo continuo, visibile graficamente come una curva discendente.
Il software del computer tramite calcolo informatico riesce a ricostruire un grafico dove viene
messa meglio in evidenza la temperatura di fusione.
Figura 7 Questa figura rappresenta i due grafici che si ottengono come risultato alla fine
di ogni run d’analisi. Il primo grafico in alto mostra al curva di Melting, mentre il grafico
in basso è il risultato del calcolo informatico del software per mettere meglio in evidenza
la temperatura in cui il DNA è completamente denaturato [13].
Controllo positivo
Ogni volta che si amplificano dei campioni si utilizzano un controllo negativo e di un controllo
positivo.
Come controllo negativo utilizzo H2O PCR-grade che serve a vedere come si comporta il grafico di
un campione senza la sequenza bersaglio e per mettere in evidenza eventuali reagenti contaminati.
Il controllo positivo è formato da DNA batterico isolato da un ceppo di Staphylococcus aureus
MRSA contenente il gene PVL, con il QIAamp DNA Mini Kit con la sua metodica per l’estrazione
del DNA, della ditta QIAGEN AG.
Il controllo positivo serve a monitorare l’efficienza dell’amplificazione, cioè in tutte le serie
l’andamento della fluorescenza dovrà essere simile.
Dopo l’estrazione il DNA viene diluito a 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 e poi amplificato.
Verrà scelta la diluizione di DNA che presenta nel grafico una temperatura di fusione idonea, cioè
che si situa tra 79-81°C.
La diluizione idonea verrà aliquotata e conservata a -20°C.
12
RISULTATI / DISCUSSIONE
Osservando la tabella sottostante, che riassume i risultati ottenuti dalle amplificazioni dei 400 ceppi
di Staphylococcus aureus MRSA, possiamo osservare che c’è una positività maggiore al gene
Panton Valentine Leucocidina nei ceppi di origine comunitaria rispetto ai ceppi di origine
nosocomiale.
In particolare possiamo dire che su 300 campioni di Staphylococcus aureus MRSA di origine
nosocomiale solo 4 ceppi sono risultati positivi al gene PVL, cioè l’1.3%; mentre dei 100 ceppi di
Staphylococcus aureus MRSA di origine comunitaria sono risultati positivi al gene PVL 11 ceppi,
ovvero l’11%.
Questi dati dimostrano che non tutti gli Staphylococcus aureus MRSA di origine comunitaria hanno
il gene Panton-Valentine leucocidina, ma una buona parte sì, e questo va a conferma dei risultati dei
nuovi studi sul gene PVL.
Campioni analizzati
N°
Gene PVL Pos
Totale %
Ospedalieri
300
4
1.3
Comunitari
100
11
11
Totale
400
Figura 8 Riassunto dei dati dei ceppi amplificati.
Un altro obiettivo di questo lavoro di diploma è mettere in evidenza il tipo di materiale da cui sono
stati isolati gli Staphylococcus aureus MRSA.
Nei campioni di origine ospedalieri tutti i ceppi positivi al gene PVL sono stati isolati da strisci
ferita, in particolar modo da due strisci ascesso, uno striscio ferita profonda e uno striscio ferita di
cui non è stata specificata la gravità.
Nessun ceppo PVL positivo è stato isolato dai materiali espettorati ed uricult.
Per quanto riguarda i ceppi batterici positivi al gene PVL di origine comunitaria, i materiali
d’origine sono stati più variati, ma la maggior parte rimangono strisci ferita e più dettagliatamente i
materiali sono: uno striscio orecchio, uno striscio naso, tre strisci ferita non specificati, due strisci
ferita superficiali, uno striscio ferita profonda, due strisci coscia e uno striscio pus.
Riassumendo, il materiale più frequente dove sono stati trovati i ceppi di Staphylococcus aureus
MRSA con gene PVL positivo, indipendentemente dall’origine del materiale, sono in generale gli
strisci ferita; interessante è però notare la gravità di alcuni materiali come gli strisci ascesso e pus.
Questa osservazione fa riferimento alla sinergia tra la tossina prodotta dal gene Panton-Valentine
leucocidina e la tossina γ-hemolisina, che rendono l’attacco batterico più aggressivo.
Per esaminare in modo più approfondito i dati di questa ricerca sarebbe stato interessante conoscere
la storia clinica del paziente (come si è procurato la ferita?, da quanto dura l’infezione?, è
peggiorata col tempo?...).
Tipo di materiale
Totale ceppi PVL Pos
Strisci ferita
Strisci ascesso
Striscio pus
Striscio orecchio
Striscio naso
9
2
1
1
1
Figura 9 Riassunto dei materiali con ceppi PVL positivi
13
Un altro aspetto dei dati da evidenziare, è che la fascia d’età dei pazienti a cui sono stati isolati gli
Staphylococcus aureus MRSA con il gene PVL.
È interessante notare come tutte le classi d’età vengano colpite, ma soprattutto i bambini e gli adulti
come descritto da alcuni studi [10].
Classe d'età dove sono stati riscontrati i ceppi
PVL positivi
5
1970
Quantità
4
1960
2000
3
1950
2
1940
1980
1990
1
0
Classe d'età
Figura 10 Rappresentazione grafica della quantità
dei ceppi PVL positivi nelle varie classi d’età.
Purtroppo anche in questo caso sarebbe stato interessante avere più informazioni cliniche del
paziente riguardante il suo stato di salute, questo ci permetterebbe di capire il grado di aggressività
del battere, cioè se il peggioramento dell’infezione si è sviluppato su un individuo sano o gia
indebolito per altri motivi.
Un'altra osservazione è che nella collezione di ceppi analizzati dell’Istituto Cantonale di
Microbiologia non sono stati riscontrati ceppi di Staphylococcus aureus PVL positivi prima del
1999, il che dimostrerebbe la novità del problema.
N° CEPPI
ANALIZZATI
1997
1998
1999
2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
7
16
27
36
50
64
60
68
64
8
Numero di ceppi PVL positivi per ogni anno
8
2005
7
6
Q u an tità
ANNO
5
4
2000
3
2002
2
1
2003 2004
1999
1997 1998
2001
2006
0
Anno
Figura 11 Il grafico sulla sinistra mostra come sono stati divisi per anno i 400
ceppi di Staph. aureus MRSA analizzati. Il grafico a destra rappresenta la quantità
di ceppi con il gene PVL positivi riscontrati per ogni ano.
14
CONCLUSIONI
Riassumendo le conclusioni principali posso dire che il gene Panton-Valentine leucocidina è
riscontrato in modo maggiore nei ceppi di Staphylococcus aureus MRSA di origine comunitaria
(11%), e soprattutto in materiali come strisci ferita di varia gravità, strisci ascesso e pus.
Questi tipi di materiali mettono in evidenza l’aggressività del battere che tende a peggiorare
l’infezione.
Confrontando le date di nascita dei pazienti, risultano interessate tutte le classi d’età, ma in
particolar modo, i bambini e gli adulti.
Inoltre, non sono stati riscontrati ceppi PVL positivi prima del 1999, il che dimostra la novità del
problema.
In conclusione credo di aver raggiunto tutti gli obiettivi iniziali, sia quelli del lavoro che quelli
personali.
Per quel che riguarda una possibile continuità di questo lavoro, credo che sarebbe interessante poter
fare una ricerca del gene PVL su tutta la collezione dell’Istituto e fare la tipizzazione di ogni ceppo
di Staphylococcus aureus MRSA con il gene Panton-Valentine leucocidina positivo, per essere in
grado di determinare se si tratta di un clone oppure se sono ceppi differenti.
Come riportato dalla letteratura anche ceppi di Staphylococcus aureus sensibili alla meticillina
(MSSA) possono produrre la tossina PVL.
I ceppi MSSA provenienti da pazienti con ferite che presentano delle complicazioni dovrebbero
essere testati per la presenza del gene PVL.
Purtroppo l’Istituto di microbiologia conserva i ceppi MSSA solo se provenienti da materiali
considerati sterili e perciò uno studio retrospettivo non è possibile.
In più credo che sarebbe interessante estendere la ricerca del gene Panton-Valentine leucocidina per
ogni ceppo di Staphylococcus aureus MRSA isolato dalla routine per fare un monitoraggio costante,
questo permetterebbe una visione della situazione in Ticino.
15
BIBLIOGRAFIA
1. Fritz H.Kayser – Kurt A.Bienz – Johannes Eckert – Jean Lindenmann,
Handboock di Microbiologia Medica (Immunologia, Batteriologia, Micologia,
Virologia, Parassitologia), Mediserve 1996
2. Microbiologia, Atlanti scientifici Gunti, Giunti 1999
3. D:\LDD SSMT\Publicazioni\Loyola Univ_ Health Univ_ Health Sys- Microbiology
& Immunology GRAM STAIN TECHNIQUE.htm
4. Manuale di Batteriologia clinica. Dalla teoria alla pratica in laboratorio, Rossetti
Roberto, Firenze University Press 2005
5. Dispense varie dell’Istituto Cantonale di Microbiologia, Bellinzona
6. Dispense scolastiche del corso di Batteriologia medica 2003-2004 tenuto da Claudia
Pelli
7. Eurosurveillance, www.eurosurveillance.org/em/v11n01/1101-226.asp, 30.01.2006
8. Henry F. Chambers, Community-Associated MRSA- Resistance and Virulence
Converge, N ENGL J MED 2005; 352: 1485-1487
9. D. Johnsson, P. Mölling, K. Stalin and B. Söderquist, Detection of Panton-Valentine
Leukocidin gene in Staphylococcus aureus by LightCycler PCR: clinical and
epidemiological aspects, European Society of Clinical Microbiology and Infectious
Diseases, 2004
10. Vandenesch F, Naimi T, Enright MC, Lina G, Nimmo G, Hefferman H e al.
Community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus carryng the
Panton-Valentine leukocidin genes: worldwide emergence. Emerg Infect Dis.2003
Aug ; 9(8):978-84
11. Blanca M.Fernandez Rodriguez, LightCycler Roche Diagnostics, ricerca scolastica
di chimica clinica, 2005/2006
12. https://www.roche-applied-science.com/sis/rtpcr/lightcycler/system.jsp
13. Grafici LightCycler 2.0 della ditta Roche Diagnostics
14. Foto scattata da Claudia Ardia
16
RINGRAZIAMENTI
In primo luogo i miei ringraziamenti vanno al Dr. Raffaele Peduzzi, direttore dell’Istituto Cantonale
di Microbiologia, che mi ha permesso di svolgere questo lavoro di diploma presso il suo Istituto e
mi ha concesso il materiale per eseguirlo.
In particolare vorrei ringraziare la mia responsabile D.ssa Gladys Martinetti Lucchini e il team della
batteriologia e della sierologia per la loro grande disponibilità e pazienza.
Vorrei ringraziare anche la D.ssa Valeria Gaia che ha conservato i ceppi più vecchi di
Staphylococcus aureus MRSA, che ho potuto utilizzare per questo lavoro di diploma.
Inoltre ringrazio il mio docente di metodologia, nonché direttore ad interim, Andrea Boffini per i
consigli e il supporto morale di questi anni tre anni ma soprattutto in quest’ultimo.
Infine ringrazio le docenti Daniela Marcacci, Sonia Marci e Susan Gilbert per l’aiuto e
interessamento al mio lavoro.
17
ALLEGATI
18
19
20
21
METODICA: ISOLAZIONE DEL DNA PER IL CONTROLLO POSITIVO
(QIAamp® DNA Mini Kit; Handbook September 2001)
•
Accendere il termoblocco a 56°C
• Protocollo:
1. Preparare un eppendorf con 300-400 µl di H2O PCR Grade
2. Prendere materiale batterico a sufficienza per creare una sospensione abbastanza torbida (ma
non troppo)
3. Pipettare 20 µl di Proteinase K in un vial (eppendorf) da 1.5 ml
4. Aggiungere 200 µl di sospensione batterica
5. Aggiungere 200 µl di AL Buffer
6. Vortexare 15” e centrifugare brevemente (short)
7. Incubare 10’ a 56°C
8. Incubare 10’ a 95°C
9. Centrifugare brevemente
10. Aggiungere 200 µl di etanolo (96-100%)
11. Vortexare 15” e centrifugare brevemente
12. Pipettare tutto in una colonnina Qiagen
13. Centrifugare 1’ a 8’000 rpm
14. Collocare la colonnina in un nuovo tube e pipettare 500 µl AW1
15. Centrifugare 1’ a 8’000 rpm
16. Collocare la colonnina in un nuovo tube e pipettare 500 µl AW2
17. Centrifugare 3’ a 14'000 rpm
18. Collocare la colonnina in un nuovo tube e centrifugare 1’ a 14'000 rpm
19. Collocare la colonnina in un nuovo vial da 1.5 ml e pipettare 80 µl di Buffer AE
20. Incubare 5’ a temperatura ambiente e centrifugare 1’ a 8'000 rpm
22
MATERIALE: MRSA-SCREEN
Kit:
MRSA-Screen
Ditta: DENKA SEIKEN CO., LTD
3-4-2 Nihonbashikayaba-cho,
Chuo-ku, Tokyo, Japan
Ref:
230782
Lotto: 125051
Exp: 05.2006
Lotto: 230782
Exp: 11.2006
Lotto: 335111
Exp: 11.2006
Conservazione del Kit: in frigorifero tra 2-8°C.
MATERIALE: bioDiscs CEFOXITINA
Kit:
Dischetti di Cefoxitina (Fox)
30 µg
Ditta: bioMérieux Suisse s.a
51, avenue Blanc
1211 Genève 2
Ref:
54 152
Lotto: 794891201
Exp: 30.09.2007
Lotto: 79528801
Exp: 30.112007
Lotto: 798381901
Exp: 30.11.2007
Conservazione del Kit: in frigorifero tra 2-8°C.
23
MATERIALE: ESTRAZIONE DNA
Kit:
IstaGene™ Matrix
Ditta: BIO-RAD-Laboratoires AG
Nemzlingerweg 2
4153 Reinach
Ref:
732-6030
Lotto: 310000044
Exp: 21.11.2007
Lotto: 310000264
Exp: 01.03.2008
Conservazione del Kit: in frigorifero tra 2-8°C.
MATERIALE: ENTRAZIONE DEL DNA PER IL CONTROLLO POSITIVO
Kit:
QIAamp® DNA
Mini Kit (250)
Ditta: QIAGEN AG
Auf dem Wolf 39
CH-4052 Basel
Ref:
51306
Lotto: 124102770
Conservazione Kit: 15-25°C
24
MATERIALE: MASTERMIX PER PCR
Kit:
LightCycler® FastStart DNA Master SYBR Green Ι
Ditta: Roche Diagnostics GmbH
Mannheim, Germany
480 reaction
Ref:
12 239 264 001
Lotto: 11969327
Exp: 10.2006
Lotto: 11748430
Exp: 11.2006
Conservazione del Kit integro: in congelatore tra i -15°C e i -25°C
Conservazione dei componenti aperti del Kit:
H2O PCR Grade: in frigorifero tra 2-8°C
MasterMix: in frigorifero tra 2-8°C per un massimo di 2 settimane.
MgCl2: in frigorifero tra 2-8°C
MATERILE: PRIMERS
Ditta:
Microsynth GmbH
9436 Balgach
Ref PV 1: 413735
Ref PV 2: 413736
Stabilità: a -20°C fino a 2 anni.
Concentrazione iniziale dei Primer ST PV1/ ST PV2: 100 uM
Concentrazione d’utilizzo dei Primer ST PV1/ ST PV2: 10 uM
Conservazione Primer ST PV1/ ST PV2:
100 uM: tenere sempre in congelatore tra i -15°C e i -25°C
10 uM: in frigorifero a 4°C
25
MATERIALE: UNG
Ditta: Roche Diagnostics GmbH
Mannheim, Germany
Concentrazione UNG: 1 U/µl
Conservazione UNG: tenere sempre in congelatore tra i -15°C e i -25°C
26