PLATELIA™ ASPERGILLUS EIA
96 TESTS
62796
IL PLATELIA™ ASPERGILLUS EIA È UN TEST IMMUNOENZIMATICO
SU MICROPIASTRA, A SANDWICH, PER IL RILEVAMENTO
DELL’ANTIGENE GALATTOMANNANO DELL’ASPERGILLUS NEL
SIERO.
1- USO PREVISTO
Il Platelia™ Aspergillus EIA è un test immunoenzimatico su micropiastra, a sandwich, per il
rilevamento dell’antigene galattomannano dell’ Aspergillus in campioni di siero.
2- ISTRUZIONI PER L’USO
Il test Platelia™ Aspergillus EIA, utilizzato in combinazione con altre procedure diagnostiche
quali coltura microbiologica, esame istologico di campioni bioptici e prove radiografiche, può
essere utilizzato come ausilio nella diagnosi dell’aspergillosi invasiva.
3- SOMMARIO E SPIEGAZIONE
Le infezioni da Aspergillus si verificano solitamente a seguito dell’inalazione di spore di Aspergillus
presenti nell’ambiente. Le forme invasive, in aumento negli ultimi 10 anni, rappresentano le infezioni
più gravi. Esse si verificano soprattutto in pazienti neutropenici (a seguito di un trattamento
antitumorale) e in pazienti trattati con immunosoppressori (nei trapianti d’organo, in particolare
trapianti di midollo osseo) e corticosteroidi 7.
L’Aspergillus è raramente isolato da colture ematiche. La diagnosi si basa spesso su prove
diagnostiche o radiologiche non specifiche (sintomi clinici, TC, raggi X del torace, ecc.)
Attualmente il test per l’antigene galattomannano solubile nel siero sembra essere un metodo
sierologico in grado di aiutare la diagnosi dell’aspergillosi invasiva 6, 9, 14, 34, 39.
4- PRINCIPIO DEL METODO
27
Il Platelia™ Aspergillus EIA è un test immunoenzimatico su micropiastra, a sandwich, one step, che
rileva il galattomannano nel siero umano. Il test fa uso di anticorpi monoclonali di ratto EBA-2 diretti
contro il galattomannano di Aspergillus e caratterizzati in studi precedenti 16, 28. Gli anticorpi
monoclonali sono utilizzati (1) per rivestire i pozzetti della micropiastra e legare l’antigene e (2) per
rilevare l’antigene legato alla micropiastra sensibilizzata (reagente coniugato: anticorpi monoclonali
legati alla perossidasi). I campioni di siero sono trattati al calore in presenza di EDTA allo scopo di
dissociare il complessi immuni e precipitare le proteine del siero che potrebbero interferire con il
test 15. I campioni di siero trattati e il coniugato sono aggiunti ai pozzetti rivestiti con anticorpi
monoclonali e incubati. In presenza dell’antigene galattomannano si forma un complesso anticorpo
monoclonale – galattomannano – anticorpo monoclonale/perossidasi.
Le strip dei pozzetti vengono lavate per eliminare eventuale materiale non legato. Successivamente,
viene aggiunta la soluzione substrato, che reagisce con i complessi legati al pozzetto per formare
una reazione di colore blu. La reazione enzimatica è arrestata dall’aggiunta di acido, che fa virare il
colore da blu a giallo. L’assorbanza (densità ottica) dei campioni e dei controlli è determinata con
uno spettrofotometro impostato ad una lunghezza d’onda di 450 e 620 mm.
5- REAGENTI
Platelia™ Aspergillus EIA : cat n. 62796 (96 test)
Conservare il kit a 2-8°C. Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente (18-25°) prima dell’uso.
Subito dopo l’uso riportare tutti i reagenti, ad eccezione dei controlli, a 2-8°C. Dopo la
ricostituzione, il controllo negativo, il controllo di cut-off e il controllo positivo inutilizzati devono
essere congelati a –20°C. Riporre le strip/piastre nella busta e richiuderla. Non rimuovere
l’essiccante. Le strip devono essere utilizzate entro 5 settimane dall’apertura e richiusura della
busta. Dopo la diluizione, la soluzione di lavaggio può essere conservata per 14 giorni a 2-8°C.
Tutti gli altri reagenti sono stabili dopo l’apertura fino alla data di scadenza. I reagenti sono
forniti in quantità sufficiente per eseguire 96 test in un massimo di 9 sedute analitiche.
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Componente
Microwell
Strip
Plate
R1
Contenuto
Micropiastra :
- 96 pozzetti (12 strisce di 8 pozzetti ciascuna)
rivestiti con anticorpi monoclonali antigalattomannano
Quantità
1 Piastra /
12 x 8 pozzetti
1 x 100 mL
R2
Concentrated
Washing
Solution
R3
Negative
Control
Serum
Siero di controllo negativo:
- Siero umano liofilizzato negativo al galattomannano
- Negativo agli anticorpi anti-HIV-1, anti-HIV-2 e antiHCV e all’antigene HBs
3 x qb* 1 mL
R4
Cut-off
Control
Serum
Siero di controllo di cut-off:
- Siero umano liofilizzato contenente galattomannano
- Negativo agli anticorpi anti-HIV-1, anti-HIV-2 e antiHCV e all’antigene HBs
3 x qb* 1mL
R5
Positive
Control
Serum
Siero di controllo positivo:
- Siero umano liofilizzato contenente galattomannano
- Negativo agli anticorpi anti-HIV-1, anti-HIV-2 e antiHCV e all’antigene HBs
3 x qb* 1 mL
R6
Conjugate
Coniugato (pronto all’uso):
- Anticorpo monoclonale anti-galattomannano /
marcato con perossidasi
- Conservante: 0,01% thimerosal
R7
Serum
Treatment
Solution
Soluzione di trattamento del siero (pronta all’uso):
- Soluzione acida EDTA
R8
TMB
Substrate
Buffer
Tampone substrato TMB (pronto all’uso):
- Acido citrico e soluzione di acetato di sodio
- Perossido di idrogeno allo 0,009%
- dimetilsulfossido (DMSO) al 4%
R9
Chromogen:
TMB
Solution
R10
Stopping
Solution
Plate sealers
Soluzione di lavaggio concentrata (10X):
- Tampone Tris NaCl
- 1% Tween® 20
- 0,01% thimerosal
1 x 8 mL
1 x 10,5 mL
1 x 60 mL
Soluzione di cromogeno TMB (concentrata):
- Soluzione di dimetilsulfossido (DMSO) al 90%
1 x 1 mL
♦
contenente tetrametilbenzidina (TMB) allo 0,6%
Soluzione bloccante (pronta all’uso):
- Acido solforico (H2SO4) 1,5 N
1 x 12 mL
- Fogli adesivi per micropiastre
1 x 8 fogli
♦
Note: la TMB (tetrametilbenzidina) è un cromogeno non-carcinogenico e non-mutageno per la
perossidasi.
*Note: qb = quanto basta
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6- AVVERTENZE PER GLI UTILIZZATORI
1. Per uso diagnostico in vitro.
2. Solo per uso professionale.
3. Non utilizzare questo kit di analisi con campioni di siero non umano.
4. Il controllo positivo, il controllo del valore soglia (cut-off) e il controllo negativo sono prodotti da
siero umano analizzato e risultato non reattivo per HBsAg e anticorpi anti-HIV-1, HIV-2 e HCV con
test con marchio CE. Tuttavia, tutti i reagenti devono essere trattati come potenzialmente infetti.
Tutti i test devono essere condotti conformemente allo standard OSHA sui patogeni portati dal
sangue, livello di biosicurezza 2 o altre pratiche di biosicurezza appropriate.
5. Indossare indumenti protettivi, compreso il camice da laboratorio, protezioni per gli occhi/il viso e
guanti monouso (si raccomandano guanti sintetici privi di lattice) e manipolare i reagenti dei kit e i
campioni dei pazienti secondo le buone prassi di laboratorio richieste. Al termine del test, lavarsi
accuratamente le mani.
6. Non pipettare con la bocca.
7. Non fumare, bere né mangiare nei locali in cui sono stati utilizzati i campioni o i reagenti dei kit.
8. Evitare di schizzare campioni o soluzioni.
9. Asciugare accuratamente eventuali fuoriuscite di materiale biologico non contenente acido con un
disinfettante efficace. I disinfettanti che possono essere utilizzati comprendono (in via non
limitativa) una soluzione di candeggina al 10% (soluzione di ipoclorito di sodio allo 0,5%), etanolo
al 70% o Wescodyne Plus™ allo 0,5%. Tutti i materiali utilizzati per asciugare eventuali fuoriuscite
sono considerati rifiuti a rischio biologico, soggetti alle relative procedure di smaltimento.
ATTENZIONE: non introdurre soluzioni contenenti candeggina nell'autoclave.
10. Assorbire (asciugare) o neutralizzare opportunamente eventuali fuoriuscite di materiale contenente
acido con bicarbonato di sodio, quindi risciacquare e asciugare l'area contaminata; in presenza di
materiale a rischio biologico, pulire l'area con un disinfettante chimico.
11. Smaltire tutti i campioni e i materiali utilizzati per eseguire il test come potenzialmente infettivi.
I rifiuti chimici di laboratorio e a rischio biologico devono essere manipolati e smaltiti
conformemente a tutte le normative locali, regionali e nazionali.
12. ATTENZIONE: di seguito viene fornito un elenco di potenziali rischi chimici contenuti in alcuni
componenti del kit (consultare la sezione 5- REAGENTI):
Poiché la soluzione bloccante di acido solforico 1,5 N (7.2% H2SO4) è corrosiva, può
causare ustioni agli occhi e alla cute; può essere nociva se ingerita o se entra in
contatto con la cute; può causare gravi danni agli occhi, compreso l'indebolimento
permanente della vista o cecità.
C-Corrosivo
Materiali da evitare: basi forti e agenti riducenti.
R34-41 Provoca ustioni. Rischio di gravi danni agli occhi.
S24/25-26-30-36/37/39-60. Evitare il contatto con gli occhi e con la pelle. In caso di contatto con
gli occhi, lavare immediatamente e abbondantemente con acqua e consultare un medico. Non
versare acqua sul prodotto. Indossare indumenti protettivi idonei, guanti e protezioni per gli occhi/il
viso. Questo materiale e la relativa confezione devono essere smaltiti conformemente alle
normative vigenti in materia di rifiuti pericolosi.
I rifiuti di questo materiale sono considerati rifiuti acidi pericolosi, tuttavia se consentito dalle
normative locali, regionali e nazionali, potrebbero essere neutralizzati a pH 6-9 per lo smaltimento
come rifiuti non pericolosi, purché si sia addestrati e attrezzati a tale fine.
Il Thimerosal allo 0,01% (sodio mertiolato), un conservante biocida organo-mercurio che colpisce il
sistema nervoso centrale (SNC), è tossico per la riproduzione e notevolmente sensibilizzante;
l'esposizione prolungata o ripetuta può causare reazione allergica nei soggetti sensibili; esistono
diversi casi di sensibilizzazione dovuta all'esposizione a soluzioni di Thimerosal diluite. Non
disperdere nell'ambiente, pericolo di effetti cumulativi. Le soluzioni contenenti mercurio con una
concentrazione superiore a 0,2 ppm devono essere smaltite conformemente alla normativa USA
per i rifiuti pericolosi (RCRA) (D009); smaltire tutti i rifiuti conformemente alle normative vigenti.
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(Nota: il mercurio (Hg) rappresenta fino al 49,55% delle molecole Thimerosal, di conseguenza un
componente con lo 0,01% di Thimerosal contiene ~0,005% (~50 ppm) di mercurio peso/volume).
In caso di contatto con la pelle, lavarsi immediatamente e abbondantemente con acqua.
Avvertenza: il Thimerosal è noto allo Stato della California per essere tossico per la riproduzione.
13. La scheda dei dati di sicurezza (MSDS) è disponibile su richiesta.
7- PRECAUZIONI PER GLI UTILIZZATORI
1. I CAMPIONI DI SIERO CONGELATI, CONSERVATI IN CONDIZIONI NON NOTE, POSSONO
GENERARE RISULTATI FALSI POSITIVI A CAUSA DI CONTAMINAZIONE CON FUNGHI E/O
BATTERI.
2. Non utilizzare il kit o i reagenti del kit dopo la data di scadenza indicata.
3. Ad eccezione della soluzione di lavaggio concentrata (R2) e della soluzione bloccante (R10),
non miscelare reagenti provenenti da altri kit con numeri di lotto diversi.
4. Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente per almeno 15 minuti prima dell’uso.
5. Durante la ricostituzione dei reagenti, miscelare accuratamente facendo attenzione ad evitare
contaminazione microbica.
6. Non eseguire il test in presenza di vapori reattivi (acidi, alcali, aldeidi) o polvere che
potrebbero influire sull’attività enzimatica del coniugato.
7. Per preparare la soluzione di reazione substrato-cromogeno utilizzare contenitori puliti
monouso in polipropilene. Se è necessario utilizzare contenitori in vetro, lavarli prima in acido
cloridrico 1N, risciacquarli con acqua distillata e asciugarli.
8. Per pipettare i controlli e i campioni utilizzare puntali da pipetta monouso per evitare la
contaminazione dei campioni.
9. Per garantire che i pozzetti siano adeguatamente lavati, rispettare il numero consigliato di
cicli di lavaggio e assicurarsi che tutti i pozzetti siano completamente riempiti e quindi
completamente svuotati. Il lavaggio non va effettuato manualmente.
10. Non lasciare che la micropiastra si asciughi tra la fine del ciclo di lavaggio e l’aggiunta di reagenti.
11. Non utilizzare lo stesso recipiente per il coniugato e le soluzioni di substrato.
12. Evitare che il coniugato o le soluzioni per la reazione substrato-cromogeno vengano a contatto
con metallo o ioni metallici.
13. Evitare di esporre il cromogeno o la soluzione per la reazione substrato-cromogeno a luce intensa
durante la conservazione o l’incubazione. Evitare che le soluzioni di cromogeno vengano a
contatto con agenti ossidanti.
14. Evitare il contatto tra la soluzione bloccante ed agenti ossidanti. Evitare che la soluzione bloccante
venga a contatto con metallo o ioni metallici.
15. Utilizzare materiali puliti e privi di polvere (provette, puntali, recipienti, ecc.) per ridurre al minimo le
possibilità di contaminazione con spore di Aspergillus presenti nell’ambiente. Poiché il
galattomannano è stabile al calore, la sterilizzazione del materiale utilizzato non garantisce
l’assenza di antigeni contaminanti. I materiali apirogeni sono ottimali ma, con le dovute
precauzioni, è possibile anche utilizzare materiali standard.
16. Limitare l’esposizione all’aria delle soluzioni (sieri, soluzioni di trattamento, coniugato) o di
recipienti aperti (piastre, provette, pipette).
17. Non rimettere il coniugato inutilizzato nel recipiente originale.
18. La soluzione per la reazione substrato-cromogeno deve essere incolore. La comparsa di colore blu
dopo la diluizione indica che il reagente è contaminato e non deve essere utilizzato. Eliminarlo e
preparare nuovo reagente.
8- PREPARAZIONE E CONSERVAZIONE DEL REAGENTE
Piastra con strisce di micropozzetti (R1)
Dopo l’apertura della busta contenente la piastra, le strisce di micropozzetti sono stabili per
5 settimane se conservate a +2-8°C nel sacchetto originale accuratamente chiuso e in presenza
dell’essiccante fornito.
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Soluzione di lavaggio di lavoro (R2)
Preparare la soluzione di lavaggio di lavoro secondo necessità aggiungendo una parte di soluzione di
lavaggio concentrata a 9 parti di acqua deionizzata o distillata sterile. La soluzione di lavaggio di
lavoro può essere conservata per 14 giorni a 2-8°C. Prepararne una quantità sufficiente per
completare il ciclo (80 mL per una striscia: 8 mL R2 + 72 mL di acqua distillata).
Dopo l’apertura, la soluzione di lavaggio concentrata conservata a +2-25°C, in assenza di
contaminazione, è stabile fino alla data di scadenza indicata sull’etichetta.
Siero di controllo negativo (R3)
Ricostituire il contenuto di una provettina di controllo con 1000 µL (1 mL) di acqua distillata sterile
(preferibilmente acqua apirogena). I sieri devono essere reidratati immediatamente prima
dell’esecuzione del test. Miscelare accuratamente dopo avere atteso 2-3 minuti per la reidratazione
del siero. Suddividere in aliquote da 300 µL in 3 provette in polipropilene da microcentrifuga.
Congelare immediatamente a –20°C le provette che non verranno utilizzate dopo la reidratazione.
Nota: i sieri di controllo precedentemente reidratati e congelati immediatamente a –20°C possono
essere scongelati ed utilizzati senza ulteriore reidratazione. I controlli reidratati congelati possono
essere conservati a –20°C per un massimo di cinque settimane. Trattare i sieri di controllo allo stesso
modo dei campioni paziente (300 µL di siero + 100 µL di soluzione di trattamento, ecc.)
Siero di controllo di cut-off (R4) e siero di controllo positivo (R5)
Prepararli come descritto per il siero di controllo negativo.
Soluzione per la reazione substrato-cromogeno (R8 + R9)
Preparare la soluzione per la reazione substrato-cromogeno aggiungendo una parte di
soluzione TMB di cromogeno concentrato, R9, a 50 parti di tampone di substrato TMB, R8.
Preparare 2 mL di soluzione per la reazione substrato-cromogeno per strip: 40 µL di R9 + 2 mL
di R8. La soluzione è stabile per 6 ore se conservata al buio a temperatura ambiente
(+18-25°C).
Dopo l’apertura, i reagenti R8 ed R9 conservati a +2-8°C, in assenza di contaminazione, sono
stabili fino alla data di scadenza indicata sull’etichetta.
Coniugato (R6), soluzione di trattamento del siero (R7) e soluzione bloccante (R10)
Dopo l’apertura, i reagenti R6, R7 ed R10 conservati a +2-8°C, in assenza di contaminazione,
sono stabili fino alla data di scadenza indicata sull’etichetta.
9- RACCOLTA DEI CAMPIONI
Raccogliere i campioni ematici secondo le procedure standard di laboratorio. Il test viene eseguito su
siero. I campioni di siero non devono essere contaminati da spore fungine e/o batteri. Trasportare e
conservare i campioni in provette sigillate non esposte all’aria. I campioni non aperti possono essere
conservati a 2-8°C per un massimo di 5 giorni prima del test. Dopo la prima apertura, i campioni
possono essere conservati a 2-8°C per un massimo di 48 ore prima del test. Tale durata può essere
prolungata conservando il siero a –70°C.
I campioni di siero possono essere sottoposti a un massimo di 4 cicli di congelamento/
scongelamento. I campioni precedentemente congelati devono essere miscelati accuratamente dopo
lo scongelamento prima di eseguire il test.
I risultati non sono influenzati da campioni contenenti 20 mg/L di bilirubina, campioni lipemici
contenenti l’equivalente di 2 g/L di trioleina (trigliceride) o campioni emolizzati contenenti 165 mg/L di
emoglobina. Non sono state testate interferenze legate ad albumina in eccesso.
Non eliminare il complemento dai sieri.
10- PROCEDURA
Materiali forniti
Vedere la sezione REAGENTI.
80
Materiali richiesti ma non forniti
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
Acqua distillata o deionizzata sterile per la diluizione della soluzione di lavaggio.
Acqua distillata apirogena sterile per la ricostituzione dei sieri di controllo.
Carta assorbente.
Guanti monouso.
Occhiali protettivi.
Ipoclorito di sodio (candeggina) e bicarbonato di sodio.
Pipette o pipette multiple, regolabili o fisse, per misurare ed erogare 50 µL, 100 µL, 300 µL e
1000 µL.
Provette in polipropilene da microcentrifuga da 1,5 mL con tappi ermetici, in grado di
sostenere un riscaldamento fino a 120°C (blocco termico) o 100°C (bagnomaria bollente).
a. Provette con tappo a vite: provette coniche da 1,5 mL, Bio-Rad cat. n.224-0100 o
equivalenti.
b. Provette con tappo a pressione: provette EZ Micro Test da 1,5 mL, Bio-Rad cat. n. 2239480 o equivalenti.
Chiusure per tappi per microprovette (VWR cat. n. 6054001 o equivalenti). Queste chiusure
consentono di sigillare in modo sicuro i tappi delle provette evitando che si aprano durante i
cambiamenti di temperatura e pressione e consentono inoltre di estrarre con facilità le
provette dal blocco termico o dal bagnomaria bollente.
Centrifuga da banco per provette 1,5 mL in polipropilene in grado di ottenere 10.000 g.
Rack per micro-centrifuga
Agitatore Vortex.
Thermoblock : Si consigliano riscaldatori dei seguenti modelli:
a. modello a 1 blocco (1x24): Grant cat. n. QBD1 (VWR cat. n. 460-0074)
b. modello a 2 blocchi (2x24): Grant cat. n. QBD2 (VWR cat. n. 460-0076)
Blocco intercambiabile: entrambi i thermoblocks devono essere usati con il blocco Grant cat.
n. QB-E1 (1x24) (VWR cat. n. 460-8517)
Bagnomaria bollente a 100°C
Incubatore per micropiastra a 37 ± 1°C.
Lavatore automatico o semiautomatico per micropiastra .
Lettore per micropiastra dotato di filtri a 450 nm e 620 nm.
Commenti procedurali
I controlli negativo, positivo e cut-off devono essere testati in ogni seduta per convalidarne i
risultati.
Trattamento dei sieri
Tutti i sieri di controllo, negativo (R3), cut-off (R4) e positivo (R5), devono essere trattati allo stesso
tempo dei campioni del test :
1. Pipettare 300 µL di ciascun siero e controllo del test nelle provette singole in polipropilene da
1,5 mL.
2. Aggiungere 100 µL di soluzione di trattamento del siero (R7) ad ogni provetta.
3. Miscelare le provette accuratamente agitandole vigorosamente o al vortex. Chiudere
saldamente la provetta per evitarne l’apertura durante il riscaldamento. Per le provette con
tappo a pressione: utilizzare una chiusura per tappo. Non perforare il tappo.
4. Opzione blocco termico:
Scaldare le provette per 6 minuti in un blocco termico a 120°C. Le provette devono essere
inserite nel blocco solo quando viene raggiunta la temperatura consigliata.(*)
OPPURE
Opzione bagnomaria:
Se si utilizza un bagnomaria bollente: riscaldare le provette per 3 minuti a 100°C. (*)
5. Rimuovere con cautela le provette dal blocco termico o dal bagnomaria bollente e collocarle
nella centrifuga. Centrifugare le provette a 10.000 x g per 10 minuti.
81
6. Per il rilevamento dell’antigene galattomannano è utilizzato il supernatante.
7. Testare i supernatanti con la procedura seguente. Dopo la preparazione il supernatante può
essere rimosso e conservato a 2-8°C per un massimo di 48 ore prima del test. Se l’analisi dei
risultati indica la necessità di ripetere il test, occorre trattare un’altra aliquota di siero.
(*) Affinché il test vada a buon fine è necessario rispettare rigorosamente la temperatura e il
tempo di esecuzione indicati ed utilizzare i materiali consigliati. Non fare affidamento alla
temperatura indicata sul dispositivo. Controllare che la temperatura corrisponda alle specifiche
utilizzando un termometro calibrato che verrà inserito in una provetta contenente olio minerale:
all’interno della provetta si dovranno raggiungere 120°C se posta in un bocco termico e 100°C
in bagnomaria bollente.
Metodo EIA
Attenersi rigorosamente al protocollo proposto.
Rispettare la buona pratica di laboratorio.
1. Portare i reagenti a temperatura ambiente (18-25°C) per almeno 15 minuti prima dell’uso.
2. Preparare la soluzione di lavaggio, la soluzione per la reazione substrato-cromogeno e controlli
negativo, positivo e cut-off.
3. Preparare una tabella per l’identificazione dei sieri e dei controlli del test nella micropiastra.
Utilizzare un pozzetto per il siero di controllo negativo (R3), due pozzetti per il siero di controllo cutoff (R4) ed un pozzetto per il siero di controllo positivo (R5).
4. Rimuovere dal contenitore il supporto della piastra e le strisce dei pozzetti (R1) . Rimettere nella
busta le strisce non utilizzate, unitamente all’essiccante e richiudere la busta.
5. Miscelare il contenuto del flacone di coniugato (R6) capovolgendolo prima dell’uso. Aggiungere
50 µL di coniugato (R6) ad ogni pozzetto. Successivamente, aggiungere ad ogni pozzetto 50 µL di
supernatante di siero trattato, come specificato sopra. Non aggiungere i campioni di siero ai
pozzetti prima del coniugato.
6. Coprire la piastra con l’apposita pellicola o in altro modo per evitare l’evaporazione, assicurandosi
che tutta la superficie sia coperta e a tenuta d’acqua.
7. Incubare la micropiastra in un incubatore a secco per micropiastre per 90 ± 5 minuti a 37°C
(± 1°C).
8. Rimuovere la pellicola dalla piastra. Aspirare il contenuto di tutti i pozzetti e versarlo in un
recipiente per rifiuti (contenente ipoclorito di sodio). Lavare la piastra 5 volte, utilizzando un minimo
di 370 µL di soluzione di lavaggio di lavoro. Dopo l’ultimo lavaggio, invertire la micropiastra e
picchiettarla gentilmente su carta assorbente per eliminare il liquido rimanente.
9. Aggiungere rapidamente 200 µL di soluzione per la reazione substrato-cromogeno (R8+R9) ad
ogni pozzetto, evitando l’esposizione alla luce intensa.
10. Incubare la micropiastra al buio a temperatura ambiente (18-25°C) per 30 ± 5 minuti.
Non utilizzare pellicola adesiva in questa fase dell’incubazione.
11. Aggiungere 100 µL di soluzione bloccante (R10) ad ogni pozzetto, utilizzando lo stesso ordine di
aggiunta della soluzione di substrato. Miscelare bene.
12. Pulire accuratamente il fondo di ogni piastra.
13. Leggere la densità ottica di ogni pozzetto a 450 nm (filtro di riferimento di 620 nm). Le micropiastre
devono essere lette entro 30 minuti dall’aggiunta della soluzione bloccante.
11- CONTROLLO DI QUALITÀ (CRITERI DI VALIDITÀ)
Controllo di cut-off : la densità ottica (O.D.) di ogni siero di controllo di cut-off deve essere
≥ 0,300 e ≤ 0,800.
Controllo positivo : l’indice del siero di controllo positivo deve essere superiore a 2,00.
O.D. controllo positivo (R5)
I=
> 2,00
O.D. media del controllo cut-off
82
Controllo negativo : l’indice del siero di controllo negativo deve essere inferiore a 0,40.
I=
O.D. controllo negativo (R3)
O.D. media controllo cut-off
< 0,40
Se uno qualsiasi dei controlli non risponde ai criteri di validità descritti sopra, il test non è valido
e i risultati del campione paziente non vanno riportati. L’operatore può decidere di ripetere il
test, dopo aver riesaminato la procedura, oppure contattare il produttore per chiedere
assistenza. Se il test viene ripetuto, occorre utilizzare una nuova aliquota dello stesso
campione.
Esempio di calcolo:
Campione
O.D. Controllo negativo (R3)
Assorbanza (O.D.)
0,117
O.D. Controllo cut-off (R4)
0,596
0,576
O.D. Controllo positivo (R5)
2,602
Calcoli
Valore di controllo cut-off medio
Per calcolare l’O.D. media del controllo cut-off (R4), sommare i valori di O.D. per ogni duplicato
del controllo cut-off e dividere il risultato per 2:
(0,596 + 0,576) ÷ 2 = 0,586
Indice di controllo negativo
Per calcolare l’indice del controllo negativo, dividere l’O.D. del controllo negativo per l’O.D.
media del controllo cut-off:
I=
0,117
= 0,20
0,586
Indice di controllo positivo
Per calcolare l’indice del controllo positivo, dividere l’O.D. del controllo positivo per l’O.D.
media del controllo cut-off:
I=
2,602
= 4,44
0,586
Validità
Nell’esempio precedente:
• L’O.D. di ogni controllo cut-off è ≥ 0,300 e ≤ 0,800, pertanto il controllo di cut-off è valido.
• L’indice del controllo negativo è < 0,40, pertanto il controllo negativo è valido.
• L’indice del controllo positivo è > 2,00, pertanto il controllo positivo è valido.
Il test eseguito in questo esempio è considerato valido, poiché i risultati rispettano i criteri di
validità per ogni controllo.
12- INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
La presenza o assenza dell’antigene galattomannano nel campione del test viene determinata
calcolando un indice per ogni campione paziente. L’indice (I) è il valore O.D. del campione
diviso per la densità ottica media dei pozzetti contenenti il siero di controllo cut-off.
Calcolo della densità ottica media del siero di controllo cut-off
Sommare le densità ottiche dei due pozzetti contenenti siero di controllo cut-off (R4) e dividere
il risultato per 2.
83
Calcolo di un indice (I) per ogni siero del test
Calcolare il rapporto seguente per ogni siero del test:
O.D. campione
O.D. media del controllo cut-off
I=
I sieri con indice < 0,50 sono considerati negativi all’antigene galattomannano.
Nota: un risultato negativo può indicare che il risultato del paziente è inferiore al livello rilevabile
dal test.
Nota: i risultati negativi non escludono la diagnosi di aspergillosi invasiva. Se il risultato è
negativo ma si sospetta la presenza della malattia, è consigliabile ripetere il test.
I sieri con indice ≥ 0,50 sono considerati positivi all’antigene galattomannano.
Per tutti i pazienti positivi, si raccomanda di ripetere una nuova aliquota dello stesso campione e di
prelevare un nuovo campione del paziente per un test di follow-up.
Nota: un valore di assorbanza inferiore a 0,000 può indicare un errore procedurale o dello strumento
che deve essere valutato. Il risultato non sarà valido e il campione dovrà essere rianalizzato.
Si raccomanda lo screening regolare (due volte alla settimana) dei pazienti ad alto rischio per
aumentare la sensibilità e la positività precoce del test.
Nota: il test Platelia™ Aspergillus EIA è concepito per essere utilizzato quale supporto nella diagnosi
dell'aspergillosi invasiva. I risultati positivi ottenuti con il test Platelia™ Aspergillus EIA devono essere
valutati congiuntamente ad altre procedure diagnostiche quali colture microbiologiche, esami
istologici di campioni di biopsia e prove radiografiche.
Esempio di calcolo:
Campione
O.D. Controllo negativo (R3)
O.D. Controllo cut-off (R4)
Assorbanza (O.D.)
0,117
O.D. Controllo positivo (R5)
0,596
0,576
2,602
Campione paziente n.1
0,134
Campione paziente n. 2
0,436
Campione paziente n. 3
1,196
Calcoli
Consultare la sezione Controllo di qualità (criteri di validità) per avere un esempio dei calcoli per
determinare la validità dei controlli del test.
Valore medio del controllo di cut-off
Per calcolare l’O.D. media del controllo cut-off (R4), sommare i valori di O.D. per ogni replicato
del controllo di cut-off e dividere il risultato per 2:
(0,596 + 0,576) ÷ 2 = 0,586
Campione paziente n. 1
Per calcolare l’indice del campione paziente n. 1, dividere l’O.D. del campione paziente per
l’O.D. media del controllo cut-off:
0,134
= 0,23
0,586
In questo esempio, il campione paziente n. 1 è negativo poiché l’indice di 0,23 è < 0,50.
I=
Campione paziente n. 2
Per calcolare l’indice del campione paziente n. 2, dividere l’O.D. del campione paziente n. 2 per
l’O.D. media del controllo di cut-off:
I=
84
0,436
= 0,74
0,586
In questo esempio, il campione paziente n. 2 è positivo poiché l’indice di 0,74 è ≥ 0,50.
Campione paziente n. 3
Per calcolare l’indice del campione paziente n. 3, dividere l’O.D. del campione paziente n. 3 per
l’O.D. media del controllo di cut-off:
1,196
= 2,04
0,586
In questo esempio, il campione paziente n. 3 è positivo poiché l’indice di 2,04 è ≥ 0,50.
I=
13- LIMITI DEL METODO
1. Un test negativo non esclude la diagnosi di aspergillosi invasiva. I pazienti a rischio di
aspergillosi invasiva dovrebbero essere sottoposti a test due volte per settimana.
2. Quando si analizzano campioni per rilevare la presenza di antigene galattomannano è
necessario attenersi al metodo e all’interpretazione dei risultati Platelia™ Aspergillus EIA. Si
consiglia all’utilizzatore del kit di leggere attentamente il foglietto illustrativo della confezione
prima di eseguire il test. In particolare, è necessario attenersi scrupolosamente al metodo
durante le fasi di pipettatura del campione e reagente, lavaggio della piastra e tempi di
incubazione.
3. Se il campione o il reagente non vengono aggiunti come descritto nel metodo, il test
potrebbe dare un risultato falso negativo. Nel caso di sospetto clinico di aspergillosi
invasiva o se si commette un errore di metodo, valutare l’opportunità di ripetere il test
su ulteriori campioni.
4. Se il contenuto di un pozzetto passa da un pozzetto all’altro in seguito a errata
manipolazione della micropiastra o se si utilizza una tecnica non idonea quando si pipettano i
reagenti è possibile che i pozzetti con campione paziente negativo siano contaminati dai
pozzetti con campione paziente positivo/di controllo.
5. Il rendimento del Platelia™ Aspergillus EIA non è stato valutato con campioni di siero
pediatrico o neonatale.
6. Platelia™ Aspergillus EIA potrebbe rilevare il galattomannano in modo meno efficace in
pazienti affetti da malattia granulomatosa cronica (CGD) e sindrome di Job 36, 37.
7. L’uso concomitante di terapia antifungina attiva contro le muffe in alcuni pazienti con
aspergillosi invasiva potrebbe ridurre la sensibilità del Platelia™ Aspergillus EIA 20.
8. Platelia™ Aspergillus EIA non è stato valutato per l’uso con plasma o altri tipi di campioni quali
urine, BAL o CSF.
9. Non è stato determinato il rendimento del Platelia™ Aspergillus EIA in caso di determinazione
visiva del risultato.
10. Altre specie di funghi quali Penicillium, Alternaria, Paecilomyces, Geotrichum e Histoplasma
hanno mostrato reattività con gli anticorpi monoclonali di ratto EBA-2 utilizzati nel test per
l'individuazione dell'Aspergillus galattomannano. L'istoplasmosi deve essere tenuta in debita
considerazione nelle aree endemiche comprese parti degli Stati Uniti 23, 32, 38.
11. Reazioni positive senza segni clinici:
considerando il rilevamento precoce dell’antigene galattomannano nel siero anche prima
della comparsa di caratteristiche cliniche e/o radiologiche, si osservano generalmente
reazioni positive senza segni clinici; esse corrispondono a test “falso positivi” in pazienti per i
quali viene successivamente stabilita aspergillosi invasiva accertata o probabile.
Tuttavia, in alcuni casi particolari, durante l’interpretazione del test occorre tenere in
considerazione alcuni fattori:
a. Sono state riportate reazioni positive senza segni clinici, soprattutto in bambini piccoli 26.
Sebbene alcuni di questi casi possano essere collegati alla reale circolazione di antigeni
di Aspergillus, possono essere considerati per la maggior parte dei falso positivi.
b. È stata dimostrata la presenza di galattofuranosi in vari cibi, soprattutto cereali, prodotti a
base di cereali e dolci cremosi 1,17. A differenza del latte umano, i latti umanizzati
contengono spesso elevate concentrazioni di galattomannano 10. Occorre perciò tenere
conto del fattore alimentare nell’interpretazione del corso dell’antigenemia nei bambini
85
piccoli e, più in generale, in tutti i pazienti con barriera intestinale alterata 4, 10. In tale
popolazione di pazienti i casi di antigenemia non accompagnata da segni clinici
dovrebbero essere interpretati con cautela ancora maggiore 17.
c. Sono stati riportati risultati positivi al test del galattomannano in pazienti che assumevano
piperacillina/tazobactam. Sono stati inoltre riportati alcuni lotti o partite di
piperacillina/tazobactam rivelatisi positivi all’antigene galattomannano. Pertanto, risultati
positivi del test in pazienti che assumono piperacillina/tazobactam devono essere
interpretati con cautela e confermati tramite altri metodi diagnostici. Il rilevamento del
galattomannano è stato inoltre riportato in alcune partite di amoxicillina associata a
preparazioni parenterali di acido clavulanico. Pertanto, quando si interpreta il test occorre
prendere in considerazione i trattamenti con b-lattame semi-sintetico 1, 21. Tuttavia, poiché
Platelia™ Aspergillus EIA può rilevare l’antigene galattomannano molto prima della
comparsa di segni clinici o radiologici, l’insorgenza di aspergillosi invasiva non può essere
esclusa. Per questo motivo i pazienti trattati con piperacillina/tazobactam con risultati del
test positivi, devono essere seguiti attentamente.
d. Nei pazienti che assumono per via parenterale o per via orale (in presenza di
un'alterazione della barriera intestinale) prodotti contenenti galattomannano si potrebbero
osservare reazioni positive in assenza di segni clinici.
Spesso, la presenza di galattomannano in questi prodotti è riconducibile all'utilizzo di un
procedimento di fermentazione a partire da microrganismi fungini.
Tuttavia, un risultato positivo sarà osservato nel paziente solo se la concentrazione serica
del galattomannano esogeno raggiunge o supera la soglia di individuazione del test.
In presenza di un risultato positivo sospetto in assenza di altri segni evocatori,
raccomandiamo di prendere in esame i prodotti assunti dai pazienti e in particolare il
procedimento di fabbricazione e l'origine delle materie prime utilizzate 11, 24, 31.
14- VALORI PREVISTI
La prevalenza attesa di aspergillosi invasiva varia in base alla popolazione di pazienti; sono stati
riportati tassi del 5-20% 7, 13.
Per determinare le caratteristiche di rendimento del Platelia™ Aspergillus EIA è stato condotto uno
studio clinico presso due centri europei su un totale di 4873 campioni di siero provenienti da
239 episodi (203 pazienti) con tumori maligni ematologici o trapianto ematopoietico di cellule
staminali diagnosticati con e senza aspergillosi invasiva.
Poiché un paziente poteva essere incluso nello studio in più di un’occasione, l’analisi è stata eseguita
in base a episodi per trattamento.
Per episodio si intende il periodo di tempo prima e dopo un evento clinico (ad es. trapianto, GVHD,
ecc.). Ne consegue che per uno stesso paziente può essere stato osservato più di un episodio.
Il tasso medio di prevalenza per questo studio era del 16% (38/239). La distribuzione di valori indice
per tali popolazioni è rappresentata nei grafici che seguono.
Pazienti diagnosticati senza aspergillosi invasiva (popolazione di controllo)
Distribuzione del valore di indice sierico
dalla popolazione di pazienti controllo N= 3691
3500
Numero di sieri
In due centri europei, sono stati
testati con il test Platelia™
Aspergillus EIA 3691 campioni di
siero ottenuti da 201 episodi
(168 pazienti). La distribuzione
dei valori indice è rappresentata
nel grafico che segue.
3240
3000
2500
2000
1500
1000
500
330
54
32
13
4
4
3
0
Indice
86
0
1
0
0
3
1
0
6
Questo grafico a dispersione
riporta i risultati del test per il
galattomannano su 3691
campioni di siero provenienti da
201 episodi (168 pazienti di
controllo) (pazienti sottoposti a
terapia immunosoppressiva per
HSCT o per curare un tumore
maligno ematologico).
POPOLAZIONE DI CONTROLLO:
DISTRIBUZIONE DELL'INDICE / EPISODIO
(N= 201 episodi da 168 pazienti)
2
Índice
1,5
1
0,5
0
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
Numero episodi
Pazienti diagnosticati con aspergillosi invasiva
Índice
Questo grafico a dispersione riporta i risultati del test per il galattomannano su 1182 campioni
di siero provenienti da 38 episodi (35 pazienti di controllo), diagnosticati con aspergillosi
invasiva accertata o probabile in base alle definizioni EORTC/NIAID.
ASPERGILLOSI INVASIVA PROBABILE/ACCERTATA:
DISTRIBUZIONE DELL'INDICE / EPISODIO
(N=38 episodi da 35 pazienti)
10,0
9,0
8,0
7,0
6,0
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
0,0
Cut-off
0,5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Numero episodi
Non si prevede che tutti i campioni di siero di ogni paziente siano positivi. La prevalenza attesa di
aspergillosi invasiva varia in base alla popolazione di pazienti; sono stati riportati tassi del
5-20% 7, 13. Il grado di prevalenza per questo studio era del 16%.
I grafici seguenti rappresentano rispettivamente esempi di un paziente senza segni clinici o
sintomi di aspergillosi invasiva (negativo per Aspergillus) e di un paziente con aspergillosi
invasiva accertata (positivo per Aspergillus).
Paziente negativo:
PAZIENTE DI CONTROLLO
1,6
1,4
1,2
Índice
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
10
20
30
40
50
60
Giorni
87
Paziente positivo:
ASPERGILLOSI INVASIVA ACCERTATA
Índice
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
10
20
30
40
50
60
Giorni
15. CARATTERISTICHE SPECIFICHE DI RENDIMENTO
A. Studi di riproducibilità
La variabilità nel test e fra i test di Platelia™ Aspergillus EIA è stata determinata in uno studio
utilizzando un pannello di 6 campioni di siero (uno negativo, uno debolmente positivo, due positivi e
due fortemente positivi) provenienti da tre siti in Nord America. Ognuno dei 6 campioni del pannello è
stato testato in triplicato (x3) in 3 giorni diversi, su un lotto, presso due centri (numero totale di
replicati in ogni centro = 9). Ognuno dei 6 campioni del pannello è stato testato in duplicato (x2) in
3 giorni diversi, su un lotto, presso un terzo centro (numero totale di replicati in ogni centro = 6).
Un solo (1) operatore ha eseguito tutte le analisi di precisione presso ogni centro. I dati sono stati
analizzati in conformità con il National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Le
seguenti tabelle presentano i valori per densità ottica media (O.D), valore di indice medio, deviazione
standard (SD), coefficiente di variazione percentuale (CV%), precisione nella serie (nel test) e
precisione nel centro (fra i test) per tutti i campioni del pannello presso ogni centro.
88
89
0,00
N/A
0,04
N/A
0,002
N/A
0,036
N/A
0,01
N/A
0,03
N/A
0,006
N/A
0,006
N/A
Indice
6
0,10
0,01
N/A
0,03
N/A
DO
6
0,049
0,003
N/A
0,012
N/A
Neg.
Indice
9
0,10
DO
9
0,040
Neg.
Indice
9
0,09
Neg.
DO
9
0,052
0,03
10,4%
0,08
4,4%
27,0%
0,19
13,0%
0,09
Indice
9
0,70
11,6%
0,14
19,8%
0,18
7,6%
0,07
Indice
9
0,89
11,1%
0,15
12,2%
0,17
Indice
6
1,36
0,08
18,7%
0,28
7,1%
0,11
Indice
9
1,49
12,5%
0,104
8,2%
0,068
DO
6
0,830
14,3%
0,25
8,2%
0,14
Indice
6
1,73
Pos. #2
9,5%
0,057
7,5%
0,045
DO
9
0,602
Pos. #2
15,7%
0,25
5,1%
0,09
14,3%
0,29
4,4%
26,5%
0,53
4,8%
0,10
DO
9
2,01
7,1%
0,082
8,1%
0,094
DO
6
1,158
6,2%
0,15
8,2%
0,20
DO
6
2,41
Pos. alto #1
5,3%
0,042
5,7%
0,046
DO
9
0,801
Pos. alto #1
4,7%
0,058
4,2%
0,051
Indice
9
2,06
Pos. alto #1
DO
9
1,227
NCCLS EP5-A, Vol. 19, No 2, Pagina 25, Equazione (C3) e Equazione (C4)
10,5%
0,068
12,5%
0,082
DO
6
0,652
Pos. #1
22,7%
0,083
6,4%
0,023
DO
9
0,364
4,7%
0,044
4,7%
0,044
Indice
9
1,563
Pos. #2
DO
9
0,931
NCCLS EP5-A, Vol. 19, No 2, Pagina 24, Equazione (C2)
15,8%
0,13
2,4%
0,02
Indice
6
0,81
0,09
7,6%
Pos. #1
10,0%
0,07
8,4%
0,059
Indice
9
1,17
Pos. #1
DO
9
0,702
2
20,0%
0,078
2,4%
0,009
DO
6
0,388
Pos. basso
20,8%
0,058
14,5%
0,041
DO
9
0,280
Pos. basso
11,5%
0,051
4,8%
0,022
Indice
9
0,74
Pos. basso
DO
9
0,445
1
N/A = non applicabile
N
Media
DS nella
seduta
1
(nell’analisi)
%CV
SD totale (fra
le analisi2
%CV
Sito 3
Campione del
pannello
N
Media
DS nella
seduta
(nell’analisi)1
%CV
SD totale (fra
le analisi2
%CV
Sito 2
Campione del
pannello
N
Media
DS nella
seduta
(nell’analisi)1
%CV
SD totale (fra
2
le analisi
%CV
Sito 1
Campione del
pannello
0,17
11,9%
0,58
3,6%
29,2%
1,00
3,2%
0,11
DO
9
3,43
4,7%
0,111
5,3%
0,126
Indice
6
2,378
6,8%
0,34
5,1%
0,25
DO
6
4,96
Pos. alto #2
5,8%
0,079
3,5%
0,047
Indice
9
1,361
Pos. alto #2
5,9%
0,169
3,1%
0,089
Indice
9
4,83
Pos. alto #2
DO
9
2,887
N/A
N/A
N/A
N/A
Indice
3
0,08
N/A
N/A
N/A
N/A
DO
3
0,18
N/A
N/A
N/A
N/A
Indice
3
0,059
N/A
N/A
N/A
N/A
DO
3
0,12
Controllo neg.
N/A
N/A
N/A
N/A
Indice
3
0,074
Controllo neg.
N/A
N/A
N/A
N/A
DO
3
0,046
Controllo neg.
2,8%
0,03
3,4%
0,03
Indice
6
1,00
0,9%
0,01
1,1%
0,01
DO
6
1,00
5,8%
0,028
5,8%
0,028
Indice
6
0,480
4,1%
0,04
5,8%
0,06
DO
6
1,00
CO controllo
22,7%
0,094
1,1%
0,00
Indice
6
0,415
CO controllo
16,9%
0,102
3,7%
0,02
DO
6
0,606
CO controllo
3,3%
0,12
N/A
N/A
Indice
3
3,67
18,2%
0,54
N/A
N/A
DO
3
2,97
3,4%
0,056
N/A
N/A
Indice
3
1,652
6,6%
0,23
N/A
N/A
DO
3
3,45
Controllo pos.
5,7%
0,068
N/A
N/A
Indice
3
1,197
Controllo pos.
14,3%
0,317
N/A
N/A
DO
3
2,216
Controllo pos.
B. Reattività crociata
È stato eseguito uno studio su un lotto del kit Platelia™ Aspergillus EIA al fine di valutare l’effetto di
condizioni mediche non legate all’aspergillosi invasiva che potrebbero interferire con il test. I seguenti
campioni di siero sono stati analizzati per reattività crociata con Platelia™ Aspergillus EIA. Sono stati
testati complessivamente 151 sieri.
N. di campioni
testati
N. di positivi
Fattore reumatoide
10
0
Positivo ANA
10
0
Ipergammaglobulinemia lgG
10
0
Ipergammaglobulinemia lgM
10
0
Tumore *
11
0
Cirrosi non virale (biliare primaria;
Indotta da alcool; indotta da droghe)
10
0
Trasfusioni multiple
10
0
Donne multipare
10
0
HAV
10
0
HCV
10
0
Rosolia
10
0
CMV
10
0
Sifilide (RPR+)
10
0
Toxoplasmosi
10
0
Micoplasma
10
0
Patologia
* Uno per ognuno dei seguenti tipi: vescica, seno (2), colon, endometrio, polmone, prostata, reni e
cancro squamoso (3).
C. Test clinici
I test clinici per la valutazione di sensibilità, specificità e valore predittivo del Platelia™ Aspergillus EIA
sono stati condotti presso due centri in Belgio e nei Paesi Bassi. Lo studio è stato condotto
retrospettivamente utilizzando complessivamente 4873 campioni di siero prelevati da 203 pazienti
dalle seguenti popolazioni*:
• pazienti senza segni di aspergillosi invasiva (pazienti di controllo)
• pazienti con aspergillosi invasiva probabile
• pazienti con aspergillosi invasiva accertata
* L’Invasive Fungal Infection Cooperative Group (IFICG) della European Organization for Research
and Treatment of Cancer (EORTC) ed il Mycosis Study Group (MSG) del National Institute of Allergy
and Infectious Diseases (NIAID) hanno definito i criteri per la diagnosi dell’aspergillosi invasiva (IA) in
pazienti con tumori maligni ematologici o trapianto ematopoietico di cellule staminali 2.
L’aspergillosi invasiva accertata è definita mediante coltura microbiologica positiva ottenuta con
procedura sterile dal sito colpito e dalla dimostrazione istopatologica delle morfologie appropriate in
un ospite con sintomi attribuiti all’infezione fungina.
L’aspergillosi invasiva probabile è definita da almeno un criterio microbiologico e un criterio clinico
maggiore o da due criteri clinici minori relativi ad un sito le cui caratteristiche sono compatibili con
l’infezione, in un ospite che presenta sintomi attribuiti all’infezione fungina.
L’aspergillosi invasiva possibile è definita da almeno un criterio microbiologico o un criterio clinico
maggiore o due criteri clinici minori relativi ad un sito con caratteristiche compatibili con l’infezione, in
un ospite che presenta sintomi attribuiti all’infezione fungina.
90
Data la relativa rarità dell’aspergillosi invasiva probabile e accertata, viene fornita di seguito la
definizione di sensibilità e specificità clinica per gli scopi del presente studio.
SENSIBILITÀ
I risultati di questo studio sono stati analizzati in termini di sensibilità del paziente. I test di sensibilità
sono stati eseguiti utilizzando Platelia™ Aspergillus EIA in due centri su un totale combinato di
38 episodi da 35 pazienti sottoposti a trapianto di midollo osseo (BMT) e affetti da leucemia ai quali
era stata diagnosticata aspergillosi invasiva accertata o probabile.
1. Aspergillosi accertata (come definita da IFICG/EORTC; vedere quanto riportato
sopra)
Siti combinati
N = 19 episodi da 16 pazienti
Sensibilità: 100% (19/19).
Nota: non è stato possibile calcolare l’intervallo di confidenza del 95% a causa delle dimensioni
insufficienti del campione.
2. Aspergillosi probabile (come definita da IFICG/EORTC; vedere quanto riportato
sopra)
Siti combinati
N = 19 episodi da 19 pazienti
Sensibilità: 94,7% (18/19).
Nota: non è stato possibile calcolare l’intervallo di confidenza del 95% a causa delle dimensioni
insufficienti del campione.
3. Aspergillosi accertata e aspergillosi probabile combinate (come definita da
IFICG/EORTC; vedere quanto riportato sopra)
Siti combinati
N = 38 episodi da 35 pazienti
Sensibilità: 97,4% (37/38). L’intervallo di confidenza del 95% è 86,2 – 99,9%.
SPECIFICITÀ
I test di specificità sono stati eseguiti utilizzando Platelia™ Aspergillus EIA in due centri su un totale
combinato di 3691 campioni da 201 episodi (168 pazienti) senza segni di aspergillosi invasiva
(pazienti di controllo).
Centro 1:
N = 3060 campioni da 103 episodi (70 pazienti)
Specificità: 92,2% (95/103) L’intervallo di confidenza del 95% è 85,3 – 96,6%.
Centro 2:
N = 631 campioni da 98 episodi (98 pazienti)
Specificità: 88,8% (87/98) L’intervallo di confidenza del 95% è 80,8 -94,3%.
Siti combinati
N = 3691 campioni da 201 episodi (168 pazienti)
Specificità: 90,5% (182/201) L’intervallo di confidenza del 95% è 85,6 – 94,2%.
VALORE PREDITTIVO
I valori predittivi positivo e negativo (PPV, NPV) sono stati analizzati per la popolazione di pazienti
dello studio, sulla base del tasso di prevalenza effettivo medio del 16% osservato nello studio.
PPV: 66,1% (37/56)
NPV: 99,4% (182/183)
E’ stata inoltre effettuata una analisi considerando i risultati positivi quando 2 campioni
consecutivi avevano un indice pari o superiore a 0,5.
91
Il rendimento è riassunto nella tabella che segue:
Sensibilità*
Specificità
PPV
NPV
Siti combinati considerando
1 campione ≥ 0,5
97,4%
(37/38)
90,5%
(182/201)
66,1%
(37/56)
99,4%
(182/183)
Siti combinati considerando
2 campioni consecutivi ≥ 0,5
92,1%
(35/38)
97,5%
(196/201)
87,5%
(35/40)
98,5%
(196/199)
*: la sensibilità è stata calcolata su aspergillosi invasiva accertata e probabile.
16- CONTROLLO DI QUALITÀ DEL PRODUTTORE
Tutti i reagenti prodotti sono preparati in base al nostro Sistema di Qualità, dal ricevimento delle
materie prime fino alla commercializzazione del prodotto.
Ogni lotto è sottoposto a valutazioni di controllo qualità e viene immesso sul mercato solo dopo la
conferma di criteri di accettazione predefiniti.
I dati relativi alla produzione e al controllo di ogni singolo lotto sono conservati da Bio-Rad.
17- BIBLIOGRAFIA
Vedere la versione Inglese.
92
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3, boulevard Raymond Poincaré
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