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REPERTORIO N°
CONVENZIONE
l'UNIVERSITA'
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SCIENZE
FRA
AZIENDA
Do 8 di AREZZO
DEGLI STUDI DI SIENA, DIPARTIMENTO
AMBIENTALI
RICERCA
USL
NEL
"Go SARFATTI"
SETTORE
DEL
PER ATTIVITA'
BIOMONITORAGGI
AMBIENTALE MEDIANTE ORGANISMI ANIMALI E VEGETAL o
UN'bI@.'
D 2 M.4R. 2011
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L'anno Duemilaftieei (20 1~) e questo giorno .2.L
del mese di
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, con la presente
Ufficio
Territoriale
scrittura privata da valere
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tenere nei modi migliori di legge
TRA
L'UNIVERSITA'
DEGLI STUDI DI SIENA, Dipartimento di Scienze
Ambientali "G. Sarfatti", con sede in Siena, Via Mattioli 4, Codice Fiscale
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80002070524
Partita IVA 00273530527,
rappresentato per la firma del
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presente atto dal Rettore Prof. Angelo Riccaboni, nato a La Spezia il;;:
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debitamente autorizzato alla stipula del presente atto d Il t:; r~ i c'~'
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delibera del Consiglio di Amministrazione del
da una parte;
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24.07.1959,
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L'AZIENDA USL 8 AREZZO, Codice Fiscale e Partita IVA 01458450515~;'
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di seguito denominataUSLS,rappresentatadal Dott. Enrico Desiderinato a~
Bologna 17.02.1951
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e residente per la carica presso la sede legale
dell' Azienda USL 8 di Arezzo, via Curtatone 54, il quale interviene, stipula
ed agisce non in proprio, ma quale Direttore Generale protempore
dell' Azienda USL 8 di Arezzo, ai sensi del Decreto del Presidente della
Giunta R.T. n. 121 del 19.06.2009, recepito con Deliberazione n.237 del
02.07.2009,
esecutiva, dall'altra parte;
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entrambe congiuntamente definite per brevità "parti"
PREMESSO CHE
- La Regione Toscana, con deliberazione n. 154 del 15.02.2010, ha finanziato
il "Piano Mirato riguardante lo studio di popolazione nei Comuni di
Civitella della Chiana ed Arezzo in relazione all'esposizione a fattori di
inquinamento ambientale", presentato dall'Azienda USL 8 di Arezzo in
qualità di Ente Capofila di un gruppo tecnico costituito da referenti
scientifici dei seguenti soggetti pubblici: ASL 8 Arezzo, ASL 7 Siena,
Agenzia Regionale di Sanità Toscana (A.R.S.), Istituto Toscano Tumori
(I.T.T.), Istituto per lo Studio e la Prevenzione Oncologica (ISPO);
- Il Piano Mirato sopra richiamato si sostanzia in un progetto complessivo
che si sviluppa in varie fasi e differenti livelli di analisi, ivi compresa la
possibilità di realizzare un biomonitoraggio ambientale attraverso lo studio
di organismi animali e vegetali;
- Tutte le varie fasi di studio verranno realizzate direttamente dai partner
scientifici sopra richiamati, i quali
hanno formalizzato tale impegno
sottoscrivendo un Protocollo d'Intesa a tal uopo definito, fatta eccezione per
la parte di studio relativa al biomonitoraggio ambientale per la
realizzazione non sussistono, all'interno
CUI
dei soggetti firmatari del
Protocollo, le necessarie competenze tecniche;
- Nell'ambito dell'incontro tenutosi in data 26 luglio 2010 fra i referenti
scientifici del Progetto e gli Enti Territoriali interessati alla realizzazione
dello stesso, è stata illustrata analoga ricerca, corrispondente alle finalità
del biomonitoraggio ambientale, da parte del Dipartimento di Scienze
~_~ __~__A_m_bientali
"G. Sarfatti" dell'lJ~i_",ersità~e~!iStudi di Sien~E!esso il quale
esistono le competenze e le strutture necessarie allo svolgimento di indagini
nel settore suddetto;
- Risulta,
pertanto,
Ambientali
di tutta
"G. Sarfatti",
l'A.R..S.,
l'I.T.T.
congiuntamente
evidenza
che il Dipartimento
di Scienze
la A.S.L.8 di Arezzo, la A.S.L. 7 di Siena,
e l'I.S.P.O.
hanno
questa parte di ricerca
interesse
comune
essendo
a realizzare
ciò riconducibile
alle
specifiche funzioni istituzionali.
- A tal uopo la Azienda USL n. 8 di Arezzo, in qualità di Ente capofila del
Progetto, il Comune di Arezzo, il Comune di Civitella Val di Chiana e la
Provincia
di
dell'Università
Arezzo,
intendono
contribuire
all'attività
di
ricerca
degli Studi di Siena, Dipartimento di Scienze Ambientali, in
quanto corrispondenti agli obiettivi attesi del Piano Mirato finanziato dalla
Regione Toscana;
SI CONVIENE
E SI STIPULA QUANTO SEGUE
ART. 1 - OGGETTO DELLA CONVENZIONE
L'Azienda
USL 8 di Arezzo (di seguito denominata Azienda), in qualità di
Ente Capofila del gruppo di Studio richiamato in premessa,
e l'Università
degli Studi di Siena, Dipartimento di Scienze Ambientali "G. Sarfatti" (di
seguito
denominato
programma
di
microinquinanti
basata
Università),
ricerca
concorrono
relativo
alla
nell' area circostante
sull' utilizzo
di bioindicatori",
alla
"Distribuzione
il complesso
descritto
realizzazione
ed
effetti
del
di
industriale
CHIMET
nelI' allegato
A) parte
integrante e sostanziale del presente atto.
ART. 2 - DURATA
3
--<:-------
-----=~
mesi a decorrere dalla data di sottoscrizione del convenzione stesso.
ART. 3 - LUOGO DI ESECUZIONE
Le attività oggetto della presente convenzione si svolgeranno presso i locali
dell'Università e con sopraluoghi e campionamenti nell'area di studio,
rappresentata dall'area
circostante il complesso industriale CHIMET
(Arezzo).
ART. 4-PROGRAMMA DELLEATTIVITÀ
II programma della ricerca, concordato tra le parti contraenti, è articolato in
una serie di attività descritte nell'allegato tecnico, cui si rimanda
integralmente nel quale, fra l'altro vengono riportati gli obiettivi che si
intendono congiuntamente perseguire.
ART. 5 - RESPONSABILI SCIENTIFICI E TECNICI
Le parti indicano, quali responsabili ai fini della corretta esecuzione della
gestione del presente convenzione, i seguenti responsabili scientifici/ tecnici:
~ Per l'università: Prof. Claudio Leonzio
~ Per l'Azienda: Dott. Domenico Sallese
ART. 6 - MODALITA' DELLA RICERCA
L'Università dà atto che effettuerà le attività di cui alla presente Convenzione
non solo in proprio ma anche avvalendosi, nei casi in cui si renda necessario
per esigenze specifiche, di altri Istituti, Centri di Ricerca o Laboratori
sperimentali, oltre che con la collaborazione dell'Azienda.
ART. l-RELAZIONI
SULL'ATTIVITA'
L'Università, a cura del proprio Responsabile scientifico/tecnico, invierà al
Responsabile scientifico dell'Azienda, nelle modalità concordate una
relazione ~~~~~_entro 30 giorni dalla sca~e!!Z~<:ieltermine di cuLaleart. 2,
~. IIllì"flill~~~ìlìilllllilillìlll
sugli studi e lavori effettuati, con indicazione dei risultati ottenuti.
ART. 8 - RISERVATEZZA
E SEGRETO
Salvo espressa deroga scritta della controparte, le Parti si impegnano a
mantenere e a far mantenere al proprio personale dipendente nonché agli
eventuali collaboratori interni o esterni il più scrupoloso segreto sui risultati
della ricerca, sulle metodologie utilizzate nonché su eventuali dati trasmessi
alla controparte, anche autonomamente rilevati ed elaborati nell' ambito della
presente convenzione.
Gli obblighi di cui sopra sopravvivranno al completamento del programma di
ricerca ed alla conseguente estinzione della presente convenzione. Essi
cesseranno di essere efficaci quando le informazioni diventeranno di pubblico
dominio per fatti non imputabili alle parti e/o alle persone da esse impiegate
nell' esecuzione della presente convenzione e comunque decorsi 5 anni dalla
cessazione di detta convenzione.
ART. 9 - PROPRIETA' DEI RISULTATI
Fermi restando i diritti dell'inventore ai sensi del vigente Codice di Proprietà
Industriale, le parti convengono sin d'ora ed accettano che le quote di
proprietà sui risultati della ricerca, sui relativi diritti di proprietà intellettuale
o sulle sue utilizzazioni industriali competono, in misura corrispondente
all'impegno congiuntamente profuso e sulla base degli apporti di risorse,
nella seguente misura:
Università: 50%
Azienda: 50%
ART. IO-DIVULGAZIONE
DEI RISULTATI
5
..
.,
...
~
_.---
_.
-,
..•., .....
oggetto di pubblicazione,
l'Università
potrà utilizzarli
congiuntamente
o
disgiuntamente dall'Azienda e viceversa ciò competerà anche all'Azienda.
II testo della memoria
scientifica
dovrà essere approvato
dai rispettivi
responsabili scientifici/tecnici delle parti i quali dovranno, entro _60_ giorni,
esprimere un parere sulla riservatezza dei risultati. Trascorso tale termine
senza che siano pervenute osservazioni al riguardo, ciascuna parte si riterrà
libera di procedere alla pubblicazione disgiunta dall'altra parte.
In ogni caso l'altra parte dovrà essere sempre menzionata come promotore o
compartecipante dell'iniziativa.
ART. ll-RESPONSABILITA'
E SICUREZZA
Fermi i disposti inderogabili di legge e salvi i casi di dolo o colpa grave,
ciascuna delle Parti solleva l'altra da responsabilità per qual sivoglia evento
dannoso che possa derivare al proprio personale o ai beni, propri o del
personale
medesimo,
durante
la permanenza
di quest'ultimo
presso
i
locali/laboratori della controparte.
ART. 12 - ONERI A CARICO DELL 'AZIENDA IN QUALITA' DI ENTE
CAPOFILA
Per la partecipazione alla ricerca in oggetto, l'Azienda verserà all'Università
l'importo
di €. 30.000,00 (trentamila/OO) a copertura degli oneri derivanti
dallo svolgimento della stessa per la parte corrispondente al minor apporto
dell' Azienda; tale somma sarà corrisposta mediante versamento sul conto
acceso presso la Banca Monte dei Paschi di Siena, Agenzia 7, c/c 50400,
Università degli studi di Siena - Dipartimento di Scienze Ambientali., ABI
1030.6
-CAB
14209 (IBAN:
IT22P0103014209000005040093)
con le
~ il 40 % dell'ammontare totale al momento della stipula;
~ il saldo alla consegna
della relazione
finale e della rendicontazione
dell'impiego delle risorse;
I versamenti di cui sopra saranno effettuati dietro presentazione di richiesta
di versamento da parte dell 'Università, nonché della documentazione per la
rendicontazione in occasione del versamento del saldo.
Le parti si danno reciprocamente atto che le somme versate dall' Azienda non
hanno carattere corrispettivo, ma costituiscono unicamente contributo per lo
svolgimento di attività di ricerca d'interesse congiunto e non rilevano agli
effetti IVA.
ART. 13- RINVIO, DISCIPLINA APPLICABILE E RISOLUZIONE
Per tutto ciò non previsto e pattuito con la presente Convenzione, le Parti
rinviano e si richiamano alle disposizioni del Codice Civile in materia di
obbligazioni e contratti in quanto compatibili, tenuto conto dell'art. 15 della
Legge 241/1990.
ART.14-FOROCOMPETENTE
Qualsiasi controversia comunque relativa all'interpretazione
e/o esecuzione
e/o risoluzione della presente Convenzione sarà di competenza esclusiva del
Foro di Siena.
ART. 15 - MODIFICHE
Qualsiasi modifica alla presente convenzione, lvi compreso ogni eventuale
aggiornamento
alla pianificazione
delle attività di ricerca, dovrà essere
concordata per iscritto tra le Parti ed entrerà in vigore tra le medesime, solo
dopo la relativa sottoscrizione di entrambe
Tutti gli oneri fiscali derivanti dal presente atto sono a carico deII'Azienda; il
presente atto sarà sottoposto a registrazione ai sensi dell'art. 55, comma 2 ed
art. 3, comma 1 del Decreto Legislativo 346/1990 .
Letto confermato e sottoscritto.
Per L'UNIVERSITÀ
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tecnico-Scientifici
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Allegati: Progetto di Ricerca (AIl.A).
Ai sensi e per gli effetti deII'articolo
1341 del Codice Civile, le Parti
dichiarano di approvare tutte le clausole della presente convenzione ed in
particolare
gli articoli 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, lO, Il,
12, 15, 16, e di
approvarne il contenuto in modo specifico.
Letto confermato e sottoscritto.
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Per L'UNIVERSITÀ
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DISTRIBUZIONE ED EFFETTI DI MICROINQUINANTI
NELL'AREA CIRCOSTANTE IL COMPLESSO INDUSTRIALE
CHIMET BASATA SULL'UTILIZZO DI BIOINDICATORI
Sintesi del progetto
L'ambiente circostante il complesso industriale CHIMET potrebbe essere interessato
dalla ricaduta al suolo di sostanze inquinanti derivanti dai processi di combustione
largamente impiegati dall'azienda. Le principali famiglie di inquinanti ad elevato
potenziale ecotossicologico che potrebbero teoricamente essere presenti nell'area sono
i metalli pesanti, gli idrocarburi policiclici aromatici, gli idrocarburi clorurati, le diossine
e i dibenzofurani, il micro e il nano particolato.
Lo studio che viene proposto dal Dipartimento di Scienze Ambientali dell'Università di
Siena prevede un1ndagine ambientale sulla distribuzione e gli effetti dei contaminanti
citati attraverso l'uso di organismi biondicatori e l'applicazione di un approccio
metodologico basato sui biomarker.
L'indagine si compone di due differenti fasi. Con la prima si intende realizzare una
mappatura della distribuzione dei metalli pesanti accumulati in una specie vegetale
usata come biondicatore. I punti mappati saranno circa 30 e situati a distanze crescenti
dalla'area industriale Chimet. Nella seconda fase saranno utilizzati organismi animali
(gasteropodi e rettili) e su questi saranno misurati:
a. i livelli di bioaccumulo di metalli pesanti e idrocarburi clorurati e policiclici aromatici
b. gli effetti a livello molecolare della presenza di inquinanti, in particolare saranno
misurati i livelli di porfirine, l'induzione delle monossigenasi a funzione mista ed il
danno sul DNA
Le informazioni derivanti da questo studio permetteranno di individuare una eventuale
relazione tra la distanza dal complesso industriale Chimet ed i livelli di accumulo nel
biota (piante e animali) ed i relativi effetti a livello biochimico inclusi gli effetti
genotossici.
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1. Premessa
Effetti dei microinquinanti sulle comunità naturali: bioindicatori
e biomarker
I contaminanti ambientali (naturali e di sintesi, quali IPA, diossine, metalli pesanti, PCBs)si
distribuiscono nei vari comparti ambientali in funzione delle loro caratteristiche chimicofisiche, causando modificazioni che si ripercuotono sulla componente biologica. Attraverso
l'utilizzo di organismi animali e vegetali è possibile ottenere indicazioni sul livello di
contaminazione di un determinata area. Questi organismi prendono il nome di
bioindicatori che vengono definiti come " ...tutti gli organismi che mediante reazioni
identificabili (biochimiche, fisiologiche, morfologiche ecc.) forniscono informazioni sulla
qualità dell'ambiente (o di una parte di esso}' mentre vengono definiti bioaccumulatori:
" ...tutti quegli organismi che assimilano dal suolo, dall'acqua o dall'atmosfera quantità
misurabili di elementi chimici e/o composti xenobiotici" (Bargagli 1998).
Gli organismi bioindicatori e bioaccumulatori, per descrivere quantitativamente lo stress
ambientale a cui sono sottoposti, vengono selezionati in base al loro ruolo ecologico e alle
caratteristiche dei contaminanti. In presenza di una fonte di contaminazione puntiforme,
come nel caso di questo progetto, vengono selezionate specie con un home range limitato
(scarsa mobilità), facile identificazione sistematica ed ampia distribuzione nell'area di
studio.
I modelli diffusionali, basandosi sullo studio delle caratteristiche chimico-fisiche delle
molecole inquinanti, permettono una valutazione delle concentrazione teoriche delle
sostanze e indicano quali comparti saranno interessati dal trasporto e dall'accumulo dei
contaminanti. La valutazione dei contaminanti bioaccumulati dagli organismi bioindicatori,
permette una validazione in vivo dei modelli diffusionali mostrando che le previsioni
teoriche si riferiscono effettivamente ad un fenomeno reale, oltre a permettere una
valutazione degli effetti biologici che si manifestano sugli organismi.
La moderna tossicologia ambientale, per affrontare queste problematiche, ha
gradualmente affiancato alle indagini di "biomonitoring', basate sulla stima dei livelli di
residui negli organismi "bioindicatori", un nuovo approccio metodologico basato sulla
valutazione delle risposte che possono essere date da un organismo, una popolazione o
una comunità naturale in seguito ad uno stress chimico ambientale. Ciascuna di queste
risposte, comunemente definite come "biomarket', rappresenta un segnale integrato del
livello di contaminazione di una determinata area e, di conseguenza, costituisce un
indicatore del livello di rischio tossicologico a cui una determinata popolazione naturale
può essere sottoposta (Bayne et aL, 1976; Payne et aL, 1977; McCarthy et aL, 1990).
Depledge & Fossi (1994) hanno definito i biomarker come ''quella variazione biochimica,
cellulare, fisiologica, '0 comportamentale, che può essere misurata in un tessuto, in un
fluido biologico o a livello dell7ntero organismo (individuo o popolazione) che da evidenza
di esposizione e/o effetto ad uno o più composti inquinanti e/o radiazioni."Quando un
composto tossico penetra in un ecosistema, sia questo terrestre, marino o di acqua dolce,
può provocare una serie di alterazioni o danni a diversi livelli strutturali che, seguendo la
complessità dell'organizzazione gerarchica, vanno dal danno molecolare alle alterazioni a
livello di popolazione e comunità. La tossicità primaria di un contaminante si esercita, in
..IiAea~.genefale, a IiveHe~bieeAimi€e-e-melecolare-tmooiftCfrzIDnidi attività ~nzimatk:-he,-~
alterazioni a livello del DNA), successivamente gli effetti si possono riscontrare, con un
meccanismo a cascata, ai'
.. uccessivi dell'organizzazione gerarchica: cellula, tessuto,
organismo, popolazio ~
"Vèr~e risposte che l'organismo genera nei confronti
dell'insulto ~
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ecotossicologiche. L'obiettivo di tale metodologia è quindi quello di prevedere e, di
conseguenza, evitare eventi inaccettabili a livello ecologico. Infatti l'utilizzo di biomarker,
attraverso lo studio di risposte immediate (induzione sistemi detossificanti, inibizioni
enzimatiche, danni al DNA), permette di prevedere il verificarsi di effetti negativi a lungo
termine (cancerogenesi, alterazioni patologiche, diminuzione delle capacità riproduttive)
(McCarthy et al., 1990).
I vantaggi dell'utilizzo di tale approccio metodologico rispetto ai convenzionali metodi di
biomonitoraggio vengono riportati di seguito:
•
i biomarker forniscono una risposta "integrata" dell'esposizione complessiva della
specie bioindicatrice, considerando la sommatoria sia delle diverse vie di assunzione che
dell'esposizione nel tempo entro un determinato range spaziale;
•
i biomarker forniscono una risposta "integrata" dell'insieme delle interazioni
tossicologiche e farmacologiche della miscela di composti a cui e' sottoposto l'organismo
"sentinella";
•
i biomarker forniscono una risposta immediata all'esposizione al tossico; questo
dato permette di prevedere l'effetto negativo a lungo termine;
•
i biomarker possono potenzialmente indicare l'effetto ecologico a lungo termine di
un contaminante a seconda che l'organismo risulti esposto oppure no.
In sintesi un organismo bioindicatore:
- permette di misurare i livelli dei contaminanti persistenti bioaccumulati negli organismi,
fornendo un dato integrato in termini spazio-temporali dell1nput tossicologico dell'area
oggetto di studio.
- fornisce, attraverso l'applicazione di biomarker, dati relativi alle attività enzimatiche
attivate o inibite da gruppi specifici di inquinanti, alla formazione di metaboliti, allo
sviluppo di danni più o meno reversibili a livello di DNA, cellulare o istologico.
In ogni comparto ambientale interessato da un fenomeno di contaminazione è quindi
possibile reperire specie adatte alla bioindicazione e su di questi quantificare i livelli di
contaminazione (bioaccumulo) e le risposte precoci (biomarkel) ai vari livelli di
complessità, da quello molecolare fino agli effetti sulle comunità.
2. Obbiettivi del progetto
L'area di studio di questo progetto è costituita dalla zona circostante il complesso
industriale Chimet situato nel comune di Civitella val di Chiana a meno di 1 km dalla
frazione di Badia al Pino. La Chimet realizza processi di recupero di metalli preziosi da
materiale di risulta delle attività orafe nonché la termodistruzione
di rifiuti speciali e
tossico-nocivi.
Il termodistruttore rappresenta la fonte puntiforme potenziale di
diffusione di gruppi di microinquinanti (diossine, idrocarburi clorurati, metalli pesanti).
In quest'area si prevede la realizzazione di una serie di indagini, basate sull'utilizzo di
organismi bioindicatori, per verificare:
1. la distribuzione dei contaminanti a livello del suolo, negli organismi scelti come
-GiOiAGiEateFi-fmellus€J'li--gaster6f}Odi,rettiH--s-atlr~-mierom-ammifertF--2. gli effetti degli stessi contaminanti in specie selezionate attraverso l'utilizzo di
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3. la magnitudine degli effetti in funzione della distanza dalla fonte potenziale di
emissione ed eventualmente identificare altre origini degli effetti registrati (traffico
veicolare, industrie limitrofe, centri abitati).
3. Articolazione del Progetto
AI fine di raggiungere gli obiettivi sopra detti, di seguito saranno riportate le principali
fasi in cui il progetto verrà articolato.
Fase 1
MAPPA TURA DEGLI ELEMENTI IN TRACCE MEDIANTE BIONDICA TORI VEGETALI
In questa fase verrà effettuato uno studio per la caratterizzazione del territorio interrato
dalle ricadute degli elementi in tracce provenienti dall1mpianto. Sulla base dei dati forniti
dai modelli teorici di diffusione già realizzati, verranno selezionati una serie di punti di
campionamento (circa 20 punti) orientati secondo due ellissi concentriche e con 3-4 punti
di riferimento più distanti. L'obiettivo è quello di individuare eventuali aree di ricaduta di
elementi in tracce riconducibili alle emissioni della Chimet che possano essere distinte dal
fondo naturale della zona.
Le specie vegetali candidate per questa fase dello studio sono la roverella (Quercus
pubescens), il leccio (Quercus i/eX) e la robinia (Robinia pseudoacacia). Sulle foglie
verranno misurate le concentrazioni dii cadmio, piombo, mercurio, zinco, rame, argento,
antimonio.
I risultati ottenuti verranno elaborati su di un programma grafico statistico per simulare la
distribuzione a terra degli inquinanti analizzati (surfef).
Si prevede la definizione di una griglia di campionamento su unità territoriali di 150-200 m
di lato. Nelle unità dove saranno individuati i picchi più elevati, e sicuramente riconducibili
alla fonte di emissione in oggetto, saranno realizzati gli approfondimenti della fase 2.
Fase 2
BIOMONITORAGGIO SU ORGANISMI ANIMALI
Sulla base di risultati ottenuti nella fase precedente saranno individuate circa 10 stazioni di
campionamento a distanze crescenti dalla sorgente (es: 400, 700, 1000 m.). Verrà inoltre
selezionata un'area di controllo in modo da confrontare i risultati dei vari punti di
campionamento con quelli ottenuti da una zona potenzialmente non soggetta a
contaminazione.
A seguito di sopralluoghi e studi sulle cenosi animali del luogo sarà selezionata una o più
specie tra quelle disponibili, ritenute più adatte come bioindicatori (molluschi gasteropodi,
rettili sauri). Per ogni punto di campionamento saranno prelevati in media 10 esemplari e
realizzate le seguenti analisi:
- valutare i livelli di bioaccumulo dei metalli pesanti (Cd, Hg, Pb, Zn) e, su campioni
selezionati idrocarburi clorurati (lC) e idrocarburi aromatici (IPA).
. Per quaAte~uarda-+-biemarker su tutti glt--orgòntsminnbioindicatoJt-campionatin-verrarlllo
effettuate:
Il sistema delle monoossigenasi a funzione mista rappresenta il principale sistema
enzimatico, presente nel regno animale, devoluto alla biotrasformazione di
contaminanti ambientali di sintesi. Il suo nucleo funzionale è rappresentato da un
emoproteina, il citocromo P450, che è composto da una porzione proteica
(apoproteina) e da una porzione prostetica responsabile del processo ossidativo (il
gruppo eme). Il gruppo prostetico, attraverso reazioni di ossidazione, rende reattivo il
composto Iipofilico, inserendo nella molecola gruppi funzionali polari come -OH, -SH e COOH. Tale attivazione del substrato rende possibile il successivo attacco da parte
degli enzimi coniuganti (Fase II) e la successiva eliminazione dall'organismo. In certi
casi la bioattivazione da parte degli enzimi di fase I può produrre metaboliti
estremamente reattivi che possono innescare una serie di reazioni tossiche per
l'organismo.
Per misurare l'attività MFO verrà utilizzato il test dell'attività EROD, un test sviluppato
da Lubert et al (1985), che quantifica la trasformazione di etossiresorufina (substrato
specifico) in resorufina tramite spettrofluorimetria.
2. Porfirine epatiche (biomarker di esposizione a composti quali PCBs, pesticidi
organoclorurati, organofosforici, diossine e metalli pesanti). Le porfirine sono pigmenti
tetrapirrolici ampiamente distribuiti in natura. Il loro ruolo fisiologico fondamentale è
legato al processo di sintesi dell'eme di cui sono metaboliti intermedi o loro prodotti di
ossidazione. Quando il processo di Sintesi dell'eme subisce interferenze si possono
creare alterazioni nel profilo delle porfirine che sono prodotte, accumulate ed eliminate.
Alcuni contaminanti agiscono molto selettivamente su alcuni enzimi della catena
biosintetica dell'eme alterando il metabolismo porfirinico senza produrre solitamente
drammatici effetti macroscopici. L'accumulo delle porfirine epatiche (coproporfirine,
uroporfirine, protoporfirine) viene valutato f1uorimetricamente utilizzando il metodo di
Grandchamp et al, (1980).
3. Analisi del Cornet assay e dell'ENA assay
Il test ENA assay (Erythrocytic nuclear abnormalities assay), che viene eseguito
utilizzando il metodo di Pacheco& Santos (1997), è una tecnica citogenetica che serve
per individuare un danno citogenetico irreversibile indotto sia da un'aberrazione
cromosomica di tipo strutturale, che da un'aneuploidia. Tale metodologia permette di
valutare non solo la presenza del micronucleo (danno genotossico irreversibile) ma
anche le varie alterazioni nelle forme dei nuclei delle cellule degli eritrociti maturi
(Iobati, kidney e segmentati) che potrebbero portare alla formazione dei micronuclei. Il
Comet assay detto anche SCGE(Single Celi Gel Electrophoresis), diffuso da Singh et
aL, (1988) è una tecnica citogenetica che permette di rilevare nelle cellule eucariotiche
danni al DNA di vario tipo come rotture del filamento, lesioni ossidative, siti labili e
cross-Iink causati da agenti genotossici e/o mutageni di natura endogena e/o esogena
(Speit & Hartmann, 2006; Burlinson et aL, 2007). Secondo il metodo elaborato da
Frenzilli et al. (1999) le cellule, sospese in agarosio, vengono stratificate su un vetrino
da microscopia, Iisate con soluzioni saline e il DNA viene fatto correre in un campo
elettroforetico. I vetrini così ottenuti, dopo colorazione, vengono osservati al
-miGr.()sc-opiea fJuores€em:a~--In assenza--di---danno,.'it--nucleo risulta-compatto-e---rotondeggiante. Nel caso in cui vi siano rotture nel DNA, i frammenti, carichi
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Il Comet assay è una tecnica
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permette di individuare il danno a livello di una singola cellula e in molti tipi di cellule
eucariotiche purché siano nucleate.
Fase 3
ELABORAZIONE STA TISTICA DEI RISULTATI, DEFINIZIONE DELLA DISTRIBUZIONE DEI
CONTAMINANTI, DEGU EFFE7TI E DEL PERICOLO POTENZIALE SULL 'AMBIENTE
Tutti i dati saranno analizzati utilizzando il programma STATISTICA 6.0; per stimare la
normalità dei dati verrà utilizzato il test di Shapiro-Wilks. Se la distribuzione dei dati risulta
non normale, per valutare eventuali correlazioni e differenze tra i vari gruppi saranno
utilizzati test non parametrici. Il test statistico che sarà utilizzato per fare un confronto tra
due gruppi è Kolmogorov-Smirnov.
I risultati ottenuti saranno anche confrontati con i dati presenti in letteratura con il metodo
degli analoghi, cercando di ottenere il massimo dell1nformazione possibile.
sarà altresì definito un livello di pericolo potenziale sia per l'ecosistema che per le
popolazioni umane.
4. Piano di lavoro
Il Piano di lavoro si basa su di un cronoprogramma articolato in 12 mesi operativi (Tabella
1). L1nizio dei lavori è previsto per il mese di ottobre 2010.
Fase 1
Pianificazione del Biomonitoraggio
A. Studio delle comunità vegetali e animali e definizione delle specie bioindicatrici
B. Definizione delle zone di campionamento in base al modello di diffusione
C. campionamento bioindicatori vegetali
D. Analisi di bioaccumulo del tracciante
E. Elaborazione dei dati
Fase 2
Biomonitoraggio su organismi animali
F. Definizione delle zone di campionamento in base allo studio effettuato nella fase 1.
G. campionamento degli organismi bioindicatori animali
H. Analisi dei residui e dei biomarker
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Fase3
I. Analisi statistica e significato ecotossicologicodei risultati
Mesi
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A
Fase1
Fase2
Fase3
B
C
D
E
F
G
H
I
Tabella 1. Diagramma di Gantt del progetto di biomonitoraggio sul sistema terrestre (24 mesi)
5. Risultati attesi
La realizzazione della fase 1 (pianificazione del biomonitoraggio) fornirà informazioni
dettagliate sulla distribuzione dei contaminanti emessi dal termodistruttore e permetterà di
valutare una eventuale presenza di altre fonti di contaminazione (traffico veicolare,
industrie).
Prima di tutto, con la caratterizzazione dell'area di studio, saranno reperite informazioni
dettagliate sulle specie vegetali e animali maggiormente presenti da impiegare come
bioindicatori e bioaccumulatori; successivamente, con l'applicazione del modello di
diffusione dei contaminanti e la sua validazione, attraverso l'utilizzo del cadmio come
tracciante sui bioindicatori vegetali selezionati, sarà possibile elaborare una mappa dei
livelli di contaminazione nella zona circostante 11mpiantoChimet.
Per l'esecuzione di questa fase sarà essenziale effettuare una ricerca bibliografica su
articoli scientifici, per ottenere informazioni sulle caratteristiche geografiche e
geomorfologiche dell'area di studio, sulle caratteristiche delle specie vegetali presenti,
nonché informazioni sull'evoluzione storica del complesso industriale e di tutta l'area.
Dovranno essere effettuate ricerche di report prodotti a livello nazionale e regionale su
studi effettuati su aree industriali in cui si abbia lo scarico di effluenti gassosi da impianti di
combustione oppure su aree rurali soggette ad elevato impatto antropico. Questi dati
" serviranno ad effettuare un confronto con i risultati ottenuti con questo progetto.
La fase 2 (Biomonitoraggio su organismi animali) consentirà di definire, sulla base dei dati
ottenuti dalla validazione del modello di diffusione, le zone di campionamento degli
organismi bioindicatori animali a distanze crescenti dall'origine della contaminazione. Dopo
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bioindicatrici animali presenti nella zona oggetto di studio, sarà effettuato il
campionamento.
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ionati consentiranno di valutare livelli
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organoclorurati. Le risposte ottenute dai vari biomarker analizzati sui bioindicatori
campionati verranno valutate per evidenziare le metodologie che hanno fornito una
risposta più sensibile e per stimare gli effetti tossicologici, nelle specie bioindicatrici,
causati dalle emissioni gassoseche incidono sulle zone limitrofe all'impianto Chimet.
Nella fase 3 (elaborazione statistica e definizione dello stato di salute dell'ecosistema),
tramite l'analisi statistica dei dati ottenuti verranno integrate le risposte dei biomarker ed i
livelli dei contaminanti. Sarà effettuato un confronto tra i siti di controllo e quelli definiti
con il modello di dispersione al fine di investigare quanto gli scarichi del complesso
industriale Chimet influiscano sullo stato di salute delle comunità biologiche. Dopodiché,
analizzando nel complesso tutte le risposte fornite, sarà valutato il rischio tossicologico a
cui le comunità biologiche potrebbero essere sottoposte. In particolare saranno valutati: i
livelli di esposizione a contaminanti gassosi, considerando la sommatoria sia delle diverse
vie di assunzione che dell'esposizione nel tempo entro un determinato range spaziale e le
risposte precoci che si evidenziano in seguito all'esposizione al composto tossico, in modo
da prevedere così i potenziali effetti negativi a lungo termine.
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