Diss. ETH No. 20847
Surface Microstructuring and
Particle Nanoengineering
for Cell Motion and Behavioral
Tagging
A dissertation submitted to
ETH Zurich
for the degree
Doctor of Sciences
presented by
Davide Franco
MSc. Biomedical Engineering, Politecnico di Milano
born May 20th , 1984
citizen of Italy
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Dimos Poulikakos, examiner
Prof. Dr. Joachim Spatz, co-examiner
Prof. Dr. Vartan Kurtcuoglu, co-examiner
Dr. Aldo Ferrari, co-examiner
2012
Abstract
In the present thesis nano and micro engineering technologies are exploited to develop new experimental approaches in the field of biomedical research. In the first part, shortcomings of cardiovascular devices such
as stents and vascular grafts are addressed.
Upon implant placement the local vascular tissue is mechanically damaged and the luminal endothelial layer continuity is lost. The wounding
associated with stenting procedures triggers an inflammatory response
that, in time, may compromise the vascular function, thus leading to
the implant failure. Healing of endothelial wounds, a process generally
named re-endothelialization, involves two main mechanisms: the spreading and adhesion of circulating endothelial cells and the migration of
cells from the wound edges. Therefore, enhancing endothelial spreading
and/or migration on the surface of the implanted device may favor the
re-establishment of a functional endothelium minimizing the occurrence
of post-surgical complications.
It is now well established that the surface topography of a substrate
represents a powerful and independent parameter that cells read and
respond to activating or demoting specific cellular responses, including proliferation, migration, adhesion, and apoptosis. Thus, modulating mammalian cell responses with nano and micro scale topographies
replicated on implant surfaces represents a promising strategy to enhance
their performance. The main aim of this work is to investigate the interaction between endothelial cells and textured substrates. Additionally, the
biological machineries involved are investigated to implement a rational
design of engineered surfaces for cardiovascular devices.
In this frame, endothelial cell spreading dynamic is investigated both
on flat and micro-engineered substrates. In particular, micro-structured
gratings with lateral period ranging from 2 to 5 µm and groove depth
ranging from 0.1 to 2 µm are employed in the present work. The time
to onset of spreading and texture-mediated cell polarization (i.e. conix
tact guidance) of cell contacting both flat and engineered substrates are
quantified. Biochemical tests are employed to reveal the activity of two
independent cell machineries: signaling through Focal Adhesion Kinase
(FAK) triggered by integrins engagement which leads to a faster cell
spreading on specific micro-gratings, and ROCK 1/2 and myosin-II cellmediated contractility which promotes the contact guidance effect.
Endothelial migration is analyzed in wound healing assays. When
the continuity of a cell monolayer is mechanically compromised, borders
cells (the cells facing the open space) are induced to migrate into the
open space and cover the wounded area thus re-establishing a functional
monolayer. To reproduce this process in vitro, and study the effect of
topography, endothelial monolayers are grown both on flat and microstructured gratings. Growth-arrested differentiated monolayers are then
mechanically scratched to obtain model wounds of controlled size and
orientation. Additionally, to capture entirely the environmental conditions in which wound healing takes place in vivo, the reconstituted endothelia are exposed to flow mediated shear stress in an original flow
bioreactor. The wound healing dynamic is then recorded and analyzed.
When the direction of the flow is perpendicular to the longitudinal
wound, endothelial regeneration is drastically enhanced by the interaction with gratings oriented parallel with the flow. This effect is functionally linked to the stability of cell-to-cell junctions within the monolayer. Specifically, the biochemical analysis of adherens junctions (AJs;
specialized cell-to-cell contacts regulating the permeability and function
of the endothelial monolayer) reveals that vascular endothelial cadherin
(VEC, a major player regulating the function of AJs) phosphorylation is
reduced by the underlying micro-topography. Altogether this effect ensures stronger cell-to-cell adhesions and reinforces coherent cell motility
inside the monolayer thus preserving its integrity.
Since topography-mediated cell responses are cell-type specific, the
concept is further extended and devised to induce selective separation of
different cell lineages. In the thesis a computational tool, based on Monte
Carlo simulations, to predict the selective cell separation performance of
experimentally characterized topographies is reported. This in silica tool
represents a facile screening approach that decouples the contribution of
cell proliferation and migration to the final separation effect and may
indicate a simple optimization procedure to maximize cell separation.
The second part of the thesis reports on artificial nanoparticles and
their use in biomedical applications. In particular the potential use for
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specific and functional cell labeling is investigated. Y2 O3 :Tb3+ nanophosphors coated with an homogenous layer of SiO2 (kindly provided by collaborators) are employed as bioimaging dyes. The toxicity of the above
mentioned nanoparticles is evaluated trough a neuronal cell-based method.
The results show that the SiO2 coating reduces the nanoparticle toxicity
effect even at high incubation concentration. Their superior optical stability and the possibility to functionalize the SiO2 trough surface absorption
of biological molecules make these nanoparticles a very suitable tool for
cell imaging.
As example, the interaction within melanoma cell and SiO2 -coated
Y2 O3 :Tb3+ functionalized with Epidermial Growth Factor (EGF) is reported. Confocal microscopy is used to visualize the cellular uptake,
while biochemical techniques are employed to revealed to EGF receptors
activation and thus to confirm that the cellular uptake is EGF receptors
mediated.
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Sommario
Nella presente tesi di dottorato nano e micro-tecnologie ingegneristiche
vengono utilizzate per sviluppare nuovi approcci sperimentali nel campo
della ricerca biomedicale. In particolare gli studi presentati nella prima
parte della tesi, sono rivolti al miglioramento di dispositivi cardiovascolari come stent o graft.
A causa dell’intervento chirurgico necessario per l’impianto, il tessuto vascolare locale viene danneggiato e lo strato endoteliale presente
sulla superficie interna del vaso perde la sua fisiologica continuità. Il
danneggiamento del vaso causato dall’operazione chirurgica di posizionamento dello stent attiva una serie di risposte infiammatorie che possono
compromettere le funzione vascolari e quindi di conseguenza, portare
al fallimento dell’impianto. La procedura di guarigione del vaso, chiamata riendotelizzazione, coinvolge principalmente due processi cellulari:
lo spreading e l’adesione di cellule endoteliali circolanti e la migrazione
delle cellule dai bordi della ferita. Favorire lo spreading e la migrazione
endoteliale sulla superficie dell’impanto può quindi promuove una riendotelizzazione più rapida e di conseguenza minimizzare l’occorrenza di
complicazioni post-chirurgiche.
Oggi è ben noto che modifiche topografiche superficiali di substrati
rappresentato un potente ed indipendente parametro che le cellule "leggono" e al quale rispondono attivando o riducendo la loro proliferazione,
migrazione, adesione e apoptosi. Modulare la risposta di cellule mammali con topografie nano e micro-metriche replicate sulle superfici di
dispositivi cardiovascolari, rappresenta quindi una strategia promettente
per migliorare le loro prestazioni cliniche. Lo scopo principale di questo
lavoro è di studiare l’interazione tra cellule endoteliali e substrati ingegnerizzati con strutture micrometriche. Inoltre vengono studiati anche i
meccanismi biologici coinvolti con lo scopo di aprire la strada alla progettazione razionale di superfici ingegnerizzate per dispositivi cardiovascolari.
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In questo scenario, lo spreading di cellule endoteliali è studiato sia su
substrati piani che ingegnerizzati. In particolare nel presente lavoro, vengono utilizzate griglie micrometriche (gratings) con un periodo laterale
compreso tra 2 e 5 µm e con una scanalatura compresa tra 0.1 e 2 µm. Sia
la latenza dello spreading, sia la polarizzazione spaziale mediata dai substrati (contact guidance) sono quantificate per cellule endoteliali a contatto
con superfici piane o ingegnerizzate. Test biochimici vengono utilizzati
per rivelare l’attività di due independenti meccanismi cellulari: signaling
cellulare mediato da Focal Adhesion Kinase che porta ad uno spreading più
rapido sui substrati ingegnerizzati, e la contrattilità cellulare mediata da
ROCK 1/2 e myosin-II che invece promuovono l’effetto di contact guidance.
La migrazione endoteliale è analizzata con saggi di wound healing.
Quando la continuità di uno strato cellulare è meccanicamente compromessa, le cellule al bordo (quelle che si affacciano sullo spazio vuoto)
sono indotte a migrare nello spazio libero per ricoprire l’area danneggiata
e ristabilire uno strato cellulare funzionale. Per riprodurre questo processo in vitro e studiare l’effetto della topografia, cellule endoteliali sono
coltivate fino al raggiungimento di uno stato di confluenza (monolayer)
sia su substarti piatti che micro-topograficamente modificati. I monolayers così ottenuti vengono poi meccanicamente danneggiati per ottenere
ferite (wound) di diversa dimensione e con diverso orientamento. Inoltre,
per riprodure fedelmente le condizioni fisiologiche ambientali nella quali
il wound healing avviene in vivo, il campione cellulare è esposto a sforzi
di taglio indotti da un flusso utilizzando un particolare bio-reattore. La
dinamica del wound healing viene quindi video registrata e analizzata.
Quando la direzione del flusso è perpendicolare al wound la rigenerazione endoteliale è drasticamente migliorata dall’interazione con gratings orientati parallelamente alla direzione del flusso. Questo effetto è
legato alla stabilità delle giunzioni cellula-cellula all’interno dello strato
cellulare. In particolare, l’analisi biochimica delle giunzione adesive (adherens junctions, AJs, le quali controllano la permeabilità dello strato endoteliale) rivela che la fosforilazione della vascular endothelial cadherin (VEC,
un componente importante delle AJs) è ridotta dalla micro-topografia sottostante le cellule.
Poichè le risposte cellulari mediate dalla topografia sono specifiche
per ogni linea cellulare, questo effetto viene ulteriormente espanso e utilizzato per indurre una selettiva selezione cellulare. Nella tesi viene presentato un metodo computazionale, basato su simulazioni Monte Carlo,
per predirre la performance di separazione cellulare selettiva di topografie
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caratterizate sperimentalmente. Questo metodo computazionale rappresenta un semplice approccio selettivo che permette di disaccoppiare il
contributo di proliferazione e migrazione cellulare all’ effetto di separazione finale.
La seconda parte della tesi tratta l’uso di nanoparticelle artificiali per
uso biomedicale. In particolare, nel lavoro svolto, viene investigato il loro
potenziale uso per la microscopia cellulare.
Y2 O3 :Tb3+ nanoparticelle rivestite con un strato di SiO2 (gentilmente
messe a disposizioni da collaboratori), sono usate come marcatori cellulari. La tossicità delle sopra citate particelle è valutata con un metodo
sperimentale basato sulla crescita neuronale. I risultati mostrano che il
rivestimento di SiO2 riduce l’effetto tossico delle nanoparticelle quando
incubate in culture cellulari ad alta concentrazione. La loro elevata stabilità ottica e la possibilità di funzionalizzare il rivestimento di SiO2 grazie
all’assorbimento superficiale di molecole biologiche rende queste nanoparticelle uno strumento estremamente adatto per la microscopia cellulare.
Come esempio, viene riportata l’interazione tra cellule di melanoma
e Y2 O3 :Tb3+ con rivestimento SiO2 funzionalizzate con Epidermal Growth
Factor (EGF). Microscopia confocale è utilizzata per visualizzare l’internalizzazione
cellulare delle nanoparticelle, mentre tecniche biochimiche sono usate per
rivelare l’attivazione dei recettori EGF e quindi confermare che la internalizzazione è mediata da tali recettori.
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