DCM017i-1
Ed. 05/2013
Helicobacter pylori IgG
per analisi di routine
Determinazione immunoenzimatica qualitativa e quantitativa degli anticorpi di classe IgG anti Helicobacter
pylori nel siero o plasma umano
LOT
IVD
Vedere etichetta esterna
DESTINAZIONE D’ USO
Il kit Diametra Helicobacter pylori IgG fornisce
materiale per la determinazione quantitativa e
qualitativa degli anticorpi di classe IgG anti
Helicobacter pylori nel siero e plasma umano.
Il kit Diametra Helicobacter pylori IgG è destinato al
solo uso di laboratorio.
1. SIGNIFICATO CLINICO
Helicobacter pylori è un batterio Gram-negativo a
spirale (dimensioni di 2-6,5 µm, flagellato) che
colonizza la mucosa gastrica umana. L'organismo si
trova nello strato di muco e aderisce alla superficie
dell'epitelio dello stomaco, ma generalmente non
penetra la mucosa gastrica direttamente. Tuttavia, vi è
una risposta infiammatoria secondaria nella mucosa
che porta a gastrite cronica attiva.
Helicobacter pylori è l'agente eziologico primario nella
maggior parte dei casi di ulcera peptica.
Nel 1994 l'OMS ha classificato l'Helicobacter pylori
come un carcinoma di categoria 1. Il tasso di infezione
in Europa è di circa il 30-40%, nel mondo circa il 50%.
Esiste una relazione inversa tra la presenza di
infezione da Helicobacter pylori e lo stato socioeconomico. Nei paesi in via di sviluppo le persone
acquisiscono l'infezione in giovane età; ne consegue
che in età adulta ben il 90% della popolazione
potrebbe avere gastrite da Helicobacter pylori. Nei
paesi occidentali sviluppati la prevalenza della gastrite
da Helicobacter pylori è molto più bassa. In queste
condizioni, la velocità di acquisizione è molto più lenta
(circa 1% all'anno) e con l'avanzare dell'età si è più
soggetti ad essere infettati con l'organismo.
2. PRINCIPIO DEL TEST
Il kit ELISA Diametra Helicobacter pylori IgG è un test
immunoenzimatico in fase solida (ELISA). La
micropiastra (fase solida) è coattata con l'antigene
ricombinante Cag A di Helicobacter pylori.
Campioni diluiti di pazienti e controlli pronti all'uso
sono pipettati nei pozzetti della micropiastra.
Durante l'incubazione gli anticorpi specifici contro
l'Helicobacter pylori nei campioni positivi e nei controlli
si legano agli antigeni immobilizzati.
Dopo gli step di lavaggio per rimuovere i componenti
non legati dei campioni e dei controlli, vengono
aggiunti ai pozzetti anticorpi anti-IgG umane coniugati
a perossidasi di rafano. Durante una seconda
Σ = 96 test
REF DKI017
incubazione questo coniugato anti-IgG si lega in
maniera specifica agli anticorpi IgG, dando luogo alla
formazione di complessi immunologici-enzimatici.
Dopo un secondo step di lavaggio per rimuovere il
coniugato non legato, i complessi immunologici formati
(nel caso di risultati positivi) sono evidenziati mediante
incubazione con Substrato TMB e conseguente
sviluppo di colore blu. Il colore blu vira al giallo dopo
l'arresto della reazione enzimatica con acido sulforico.
L'intensità di questo colore è direttamente
proporzionale alla quantità di anticorpo IgG anti
Helicobacter pylori nel campione del paziente.
L'assorbanza a 450 nm viene determinata con un
spettrofotometro ELISA per micropiastre.
3. REAGENTI, MATERIALI E STRUMENTAZIONE
3.1 Reagenti e materiali forniti nel kit
1. Calibrators (3 flaconi, 2 mL ciascuno, pronti all'uso)
CAL1
REF DCE002/01707i-0
CAL2
REF DCE002/01708i-0
CAL3
REF DCE002/01709i-0
2. Controlli (2 flaconi, 2 mL ciascuno, pronti all'uso)
La concentrazione del Controllo è lotto-specifica ed è
indicata sul Certificato di Analisi
Controllo Positivo
Controllo Negativo
REF DCE045/01702i-0
REF DCE045/01701i-0
3. Conjugate (1 flacone, 20 mL)
Anticorpi anti IgG umane coniugati a perossidasi di
rafano
REF DCE002/01702i-0
4. Coated Microplate (1 microplate breakable)
Micropiastra coattata con antigeni Helicobacter pylori
Cag A ricombinanti
REF DCE002/01703i-0
5. TMB Substrate (1 flacone, 14 mL)
H2O2-TMB (evitare il contatto con la pelle)
REF DCE004/01704i-0
6. Stop Solution (1 flacone, 14 mL)
Acido Solforico 0,2 mol/L (evitare il contatto con la pelle)
REF DCE005/01705i-0
7. 20X Conc. Wash Solution (1 flacone, 30 mL)
Soluzione tamponata a pH 7.2 REF DCE007/01707i-0
8. Sample diluent (1 flacone, 100 mL)
Soluzione tamponata a pH 7.2 REF DCE053/01753i-0
3.2 Reattivi necessari non forniti nel kit
Acqua distillata.
3.3 Materiale e strumentazione ausiliare
Dispensatori automatici.
Lettore per micropiastre (450 nm)
•
•
Note
Conservare i reattivi a 2÷8°C, al riparo dalla luce.
Aprire la busta del reattivo 4 (Coated Microplate)
solo dopo averla riportata a temperatura ambiente e
chiuderla subito dopo il prelievo delle strip da
utilizzare. Il kit aperto mantiene l'attività per 2
mesi se conservato come descritto sopra.
4. AVVERTENZE
• Questo test kit è per uso in vitro, da eseguire da
parte di personale esperto. Non per uso interno o
esterno su esseri Umani o Animali.
• Usare i previsti dispositivi di protezione individuale
mentre si lavora con i reagenti forniti.
• Seguire le Buone Pratiche di Laboratorio (GLP) per
la manipolazione di prodotti derivati da sangue.
• Tutti i reattivi di origine umana usati nella
preparazione dei reagenti sono stati testati e sono
risultati negativi per la presenza di anticorpi antiHIV 1&2, per HbsAg e per anticorpi anti-HCV.
Tuttavia nessun test offre la certezza completa
dell’assenza di HIV, HBV, HCV o di altri agenti
infettivi. Pertanto, i reagenti devono essere
maneggiati come materiali potenzialmente infettivi.
• Alcuni reagenti contengono piccole quantità di
R
Proclin 300 come conservante. Evitare il contatto
con la pelle e le mucose.
• Il TMB Substrato contiene un irritante, che può
essere dannoso se inalato, ingerito o assorbito
attraverso la cute. Per prevenire lesioni, evitare
l’inalazione, l’ingestione o il contatto con la cute e
con gli occhi.
• La Stop Solution è costituita da una soluzione di
acido solforico diluito. L’acido solforico è velenoso
e corrosivo e può essere tossico se ingerito. Per
prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il
contatto con la cute e con gli occhi.
• Evitare l’esposizione del reagente TMB/H2O2 a luce
solare diretta, metalli o ossidanti. Non congelare la
soluzione.
5. PRECAUZIONI
• Si prega di attenersi rigorosamente alla sequenza
dei passaggi indicata in questo protocollo. I risultati
presentati qui sono stati ottenuti usando specifici
reagenti elencati in queste Istruzioni per l’Uso.
• Tutti i reattivi devono essere conservati a
temperatura controllata di 2-8°C nei loro contenitori
originali. Eventuali eccezioni sono chiaramente
indicate. I reagenti sono stabili fino alla data di
scadenza se conservati e trattati seguendo le
istruzioni fornite.
• Prima dell’uso lasciare tutti i componenti dei kit e i
campioni a temperatura ambiente (22-28°C) e
mescolare accuratamente.
• Non scambiare componenti dei kit di lotti diversi.
Devono essere osservate le date di scadenza
•
•
•
•
•
•
riportate sulle etichette della scatola e di tutte le
fiale. Non utilizzare componenti oltre la data di
scadenza.
Qualora si utilizzi strumentazione automatica, è
responsabilità dell’utilizzatore assicurarsi che il kit
sia stato opportunamente validato.
Un lavaggio incompleto o non accurato dei pozzetti
può causare una scarsa precisione e/o un’elevato
background.
Per la riproducibilità dei risultati, è importante che il
tempo di reazione di ogni pozzetto sia lo stesso.
Per evitare il time shifting durante la dispensazione
degli reagenti, il tempo di dispensazione dei
pozzetti non dovrebbe estendersi oltre i 10 minuti.
Se si protrae oltre, si raccomanda di seguire lo
stesso ordine di dispensazione. Se si utilizza più di
una piastra, si raccomanda di ripetere la curva di
calibrazione in ogni piastra.
L’addizione del TMB Substrato dà inizio ad una
reazione cinetica, la quale termina con l’addizione
della Stop Solution. L’addizione del TMB Substrato
e della Stop Solution deve avvenire nella stessa
sequenza per evitare tempi di reazione differenti.
Osservare le linee guida per l’esecuzione del
controllo di qualità nei laboratori clinici testando
controlli e/o pool di sieri.
Osservare
la
massima
precisione
nella
ricostituzione e dispensazione dei reagenti.
Non
usare
campioni
microbiologicamente
contaminati, altamente lipemici o emolizzati.
I lettori di micropiastre leggono l’assorbanza
verticalmente. Non toccare il fondo dei pozzetti.
6. PROCEDIMENTO
6.1. Preparazione dei Calibratori (C1…C3)
I Calibratori sono pronti all'uso ed hanno le seguenti
concentrazioni:
C1
C2
C3
AU/mL
15
75
150
6.2. Preparazione della soluzione di lavaggio
Prima dell’uso, diluire il contenuto di ogni fiala di "20X
Conc. Wash Solution" con acqua distillata fino al
volume di 600 mL. Per preparare volumi minori
rispettare il rapporto di diluizione di 1:20. La soluzione
di lavaggio diluita è stabile a 2÷8°C per 30 giorni.
Nella wash solution concentrata è possibile osservare
la presenza di cristalli, in tal caso riscaldare
brevemente a 37°C fino alla completa dissoluzione dei
cristalli.
6.3. Preparazione del Campione
I campioni devono essere siero o plasma umano.
Prima dell'uso diluire i campioni 1:101 con Sample
diluent (ad esempio, aggiungere 10 µL di siero a 1 mL
di Sample diluent), mescolare bene, lasciare
riposare per 15 minuti, mescolare nuovamente
prima dell'uso.
NB: Calibratori e Controlli sono pronti all'uso e non
devono essere diluiti.
Per ottenere il siero, raccogliere il sangue per via
venosa, far coagulare e separare il siero per
centrifugazione a temperatura ambiente; non
centrifugare prima che la coagulazione sia completata;
il sangue di pazienti sottoposti a terapia anticoagulante
può richiedere più tempo per la coagulazione.
Per ottenere il plasma, il sangue intero deve essere
raccolto in provette contenenti anti coagulante e
centrifugati subito dopo la raccolta.
Non usare campioni emolitici, itterici o lipemici.
Conservazione: i campioni devono essere ben chiusi
e possono essere conservati per un massimo di 24
ore a 2-8°C prima di essere analizzati; per periodi di
conservazione più lunghi dovrebbero essere congelati
a -20°C (solo una volta); i campioni decongelati
devono essere miscelati bene prima della prova.
•
•
•
•
•
6.4. Procedimento
Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente
(22-28°C).
Le strisce di pozzetti non utilizzate devono essere
rimesse immediatamente nella busta richiudibile
contenente il materiale essicante e conservate a 28°C.
Per evitare potenziali contaminazioni microbiche
e/o chimiche non rimettere i reagenti inutilizzati nei
flaconi originali; utilizzare puntali per pipette usa e
getta nuovi per ogni Calibratore, Controllo e
campione, e dispensare il coniugato con precisione
sul fondo dei pozzetti.
Al fine di aumentare l’accuratezza dei risultati del
test è necessario operare in doppio, allestendo due
pozzetti per ogni punto della curva di calibrazione
(C1-C3), due per ogni Controllo, due per ogni
Campione ed uno per il Bianco.
Durante le incubazioni coprire la micropiastra con
la sheet fornita per eviatre evaporazioni.
Reagenti
Calibratori
C1-C3
Calibratori
Campioni
/Controllo
Bianco
100 µL
Campioni
diluiti
100 µL
Controlli
100 µL
Coprire i pozzetti con la sheet fornita nel kit.
Incubare per 60 minuti a 37°C.
Svuotare il contenuto dei pozzetti. Lavare i pozzetti 5
volte con la Wash Solution diluita (300 µL per
pozzetto). Sbattere delicatamente la micropiastra su
carta assorbente per eliminare le gocce residue.
Nota importante:
La sensibilità e la precisione di questo dosaggio sono
fortemente influenzate dal corretto svolgimento della
procedura di lavaggio.
Conjugate
100 µL
100 µL
Coprire i pozzetti con la sheet fornita nel kit.
Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente (2228°C).
Non esporre a luce solare diretta!
Svuotare il contenuto dei pozzetti. Lavare i pozzetti 5
volte con la Wash Solution diluita (300 µL per
pozzetto). Sbattere delicatamente la micropiastra su
carta assorbente per eliminare le gocce residue.
TMB
100 µL
100 µL
100 µL
Substrate
Coprire i pozzetti con la sheet.
Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente (2228°C) al buio.
Stop
Solution
100 µL
100 µL
100 µL
Attenzione: campioni altamente positivi possono
causare precipitati scuri del cromogeno.
Leggere la densità ottica a 450/620 nm entro 30 minuti
dopo l'aggiunta della Stop Solution (vedi Misurazione
sotto).
Misurazione:
Regolare il lettore di micropiastra sullo zero usando il
Bianco.
Se - per motivi tecnici - il lettore ELISA non può essere
regolato a zero usando il Bianco, sottrarre il valore di
assorbanza del bianco da tutti i valori delle altre
assorbanze in modo da ottenere risultati attendibili.
Misurare l'assorbanza di tutti i pozzetti a 450 nm e
inserire tutti i valori di estinzione di ogni controllo e
campione dei pazienti nel piano di distribuzione ed
identificazione dei risultati.
È raccomandata una lettura a doppia lunghezza
d'onda utilizzando i 620 nm come lunghezza di
riferimento. Laddove applicabile, calcolare la media
delle assorbanze di tutti i duplicati.
7. CONTROLLO DI QUALITÀ
Si raccomanda di utilizzare i campioni di controllo
secondo le norme statali e federali. L'uso di campioni
di controllo è consigliato per assicurare il
mantenimento della validità dei risultati. Utilizzare
controlli sia a livello normale che patologico.
Si raccomanda inoltre di utilizzare programmi di
valutazione per la qualità nazionali o internazionali, al
fine di assicurare l'accuratezza dei risultati.
Se i risultati del test non sono in accordo con i range di
accettazione dei controlli, il risultato deve essere
considerato non valido.
In questo caso, si prega di consultare i seguenti fattori
tecnici:
pipettaggio
e
apparecchiature
di
cronometraggio; fotometro, date di scadenza dei
reagenti, metodi di conservazione e condizioni di
incubazione, metodi di aspirazione e lavaggio.
Se dopo il controllo dei suddetti fattori non è rilevabile
alcun errore, contattare il proprio distributore o
direttamente Diametra.
8. RISULTATI
8.1. Validazione del dosaggio
Il dosaggio può essere considerato valido se sono
soddisfatti i seguenti criteri:
Blank
Negative Control
Positive Control
Calibrator 1
Calibrator 2
Calibrator 3
Absorbance value
lower than 0.100
lower than 0.200
between 0.650 – 3.000
between 0.350 – 0.850
between 0.900 – 2.100
between 1.800 – 3.000
8.2. Calcolo dei risultati quantitativi
Al fine di ottenere risultati quantitativi in AU/mL (Unità
Arbitrarie) tracciare i valori medi di assorbanza del
Controllo Negativo e dei Calibratori 1, 2 e 3 su carta
millimetrata in un sistema di coordinate lineare/lineare
contro le rispettive concentrazioni (0, 15, 75, 150
AU/mL) e disegnare una curva di calibrazione (valori di
assorbanza sulla verticale y, concentrazioni sull'asse
orizzontale asse x).
Leggere i risultati su questa curva di calibrazione
utilizzando le medie dei valori di assorbanza di ciascun
campione e controllo.
Tutti i programmi per computer disponibili possono
essere utilizzati per la lettura automatica ed il calcolo
del risultato. Possono essere utilizzate le seguenti
funzioni matematiche: "regressione lineare" o "Calcolo
Point to Point della curva di calibrazione".
Nota: i valori dei campioni dei pazienti ulteriormente
diluiti devono essere moltiplicati per il fattore di
diluizione, al fine di ottenere risultati corretti.
8.3. Interpretazione dei risultati quantitativi
Gli intervalli di valori normali per questo test ELISA
devono essere stabiliti da ciascun laboratorio in base
alle proprie popolazioni di pazienti nelle aree
geografiche servite.
I seguenti valori dovrebbero essere considerati come
una linea guida:
Helicobacter pylori IgG
CUT-OFF
15 AU/mL
Positive
> 18 AU/mL
Gray Zone (equivocal)
15 - 18 AU/mL
Negative
< 15 AU/mL
8.4. Calcolo dei risultati qualitativi
Absorbance value of Calibrator 1 (Cut-Off) = CO
Example: 0.56 = CO
8.5. Interpretazione dei risultati qualitativi
• Positivo: valore di assorbenza (media) del
paziente oltre il 20% sopra il CO (OD paziente
media > 1.2 * CO)
• Zona Grigia: valore di assorbenza (media) del
paziente compreso tra CO e il 20% sopra il
CO; ripetere il test 2-4 settimane più tardi con
un nuovo campione del paziente (CO ≤ OD
media paziente ≤ 1,2 * CO)
•
Se il risultato della seconda prova è di nuovo
nella zona grigia, considerare il test negativo
Negativi: valore medio di assorbanza dei
pazienti al di sotto di CO (OD media paziente
< CO)
9. PARAMETRI CARATTERISTICI
9.1. Specificità diagnostica
La specificità diagnostica é la probabilità del test di
fornire un risultato negativo in assenza di anticorpi
specifici. Per la valutazione sono stati utilizzati 81 sieri
da donatori di sangue. I sieri sono stati testati con il kit
Diametra Helicobacter pylori IgG in aggiunta ad un
altro kit ELISA disponibile in commercio.
La specificità diagnostica è del 92%.
9.2. Sensibilità diagnostica
La sensibilità diagnostica é la probabilità del test di
fornire un risultato positivo in presenza di anticorpi
specifici. Per la valutazione sono stati utilizzati 81 sieri
da donatori di sangue. I sieri sono stati testati con il kit
Diametra Helicobacter pylori IgG in aggiunta ad un
altro kit ELISA disponibile in commercio.
La sensibilità diagnostica è > 99%.
9.3. Precisione
La variazione inter-assay del kit Diametra ELISA è
stato determinato mediante misurazioni ripetute di tre
campioni di controllo in tre giorni diversi.
OD media
SD
CV (%)
n
Campione 1
OD
Campione 2
OD
Campione 3
OD
0.03
0.00
5.48
12
0.44
0.02
3.76
11
1.64
0.10
6.11
12
La variazione intra-assay del kit Diametra ELISA è
stato determinato mediante misurazioni ripetute di tre
campioni di controllo.
OD media
SD
CV (%)
n
Campione 1
OD
Campione 2
OD
Campione 3
OD
0.03
0.00
8.7
20
0.46
0.02
3.8
20
1.73
0.04
2.6
20
9.4. Sensibilità analitica
La sensibilità analitica è stata calcolata dalla media
meno due deviazioni standard di venti replicati del
controllo negativo ed è 0.245 AU/mL.
10. LIMITI DELLA PROCEDURA
La contaminazione batterica o ripetuti cicli di
congelamento-scongelamento del campione possono
influenzare i valori di assorbanza.
Nei pazienti immuno-compromessi e nei neonati i dati
sierologici hanno un valore limitato.
10.1. Sostanze interferenti
Emoglobina (fino a 4 mg/mL), bilirubina (fino a 0,5
mg/mL) e trigliceridi (fino a 30 mg/mL) non influenzano
i risultati del saggio.
11. DISPOSIZIONI PER LO SMALTIMENTO
I reagenti devono essere smaltiti in accordo con le
leggi locali.
BIBLIOGRAFIA
• Stolte, M. Eidt, S. (1993) Healing gastric MALT
lymphomas by eradicating H.Pylori Lancet
342:568
• Stolte, M. (1992) H.Pylori and gastric MALT
lymphoma Lancet 339:745-746
• Parsonnet, J., Friedman, G.D., Vanderstetten,
D.P., Chang, y., Vogelman, J.H., Orentreich, N.,
Sibley, R.K. (1991) H. Pylori infection and the risk
of gastric carcinoma. N Engl J Med 325: 11271131
• Warren J.R. (1983) Unidentified curved bacilli on
gastric epithelIUm in active chronic gastritis,
Lancet: 1273-1275
• Marshall, B.J., Royce, H., D.I., Goodwin, C.S.,
Taylor, N.S., Edmonds, P., Sly, L.I., Brenner, D.J.
(1982) Orginal Isolation of Campylobacter
pyloridis from human gastric mucosa. Microbios
Letter 25:83
Ed. 05/2013
DCM017i-1
DiaMetra S.r.l. Headquater: Via Garibaldi, 18
20090 SEGRATE (MI) Italy
Tel. 0039-02-2139184 – 02-26921595
Fax 0039–02–2133354.
Manufactory: Via Pozzuolo 14, 06038 SPELLO (PG)
Italy
Tel. 0039-0742–2485
Fax 0039–0742–316197
E-mail: [email protected]
DCM017i-1
Ed. 05/2013
Helicobacter pylori IgG
for routine analysis
Qualitative and quantitative immunoenzymatic determination of IgG class antibodies to Helicobacter pylori
in human serum or plasma.
LOT
IVD
See external label
INTENDED USE
Diametra ELISA Helicobacter pylori IgG kit provides
materials for the quantitative and qualitative
determination of IgG class antibodies to Helicobacter
pylori in human serum and plasma.
Helicobacter pylori IgG kit is intended for in vitro
diagnostic use only.
1. CLINICAL SIGNIFICANCE
Helicobacter pylori is a spiral Gram-negative
bacterium (2-6.5 µm in size, flagellated) which
colonizes the human gastric mucosa. The organism is
found in the mucus layer and adheres to the surface
mucus epithelium of the stomach but generally does
not penetrate the gastric mucosa directly. However,
there is a secondary inflammatory response in the
mucosa leading to chronic active gastritis.
Helicobacter pylori is the primary causative agent in
most cases of peptic ulcer disease.
In 1994 the WHO classified Helicobacter pylori as a
category 1 carcinoma. Infection rate in Europe is
about 30%-40%, worldwide about 50%. There is an
inverse relationship between the presence of
Helicobacter pylori infection and socioeconomicus
status. In developing countries, people acquire the
infection at an early age such that by young adulthood
as many as 90% of the population might have
Helicobacter pylori gastritis. In developed western
countries the prevalence of Helicobacter pylori
gastritis is much lower. Under these conditions, the
rate of acquisition is much slower (roughly 1% per
annum) and the older one is the more likely one to be
infected with the organism.
2. PRINCIPLE OF THE METHOD
Diametra Helicobacter pylori IgG ELISA kit is a solid
phase enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
Microtiter wells as a solid phase are coated with
recombinant Helicobacter pylori Cag A antigen.
Diluted patient specimens and ready-for-use controls
are pipetted into these wells. During incubation
Helicobacter pylori-specific antibodies of positive
specimens and controls are bound to the immobilized
antigens.
After a washing step to remove unbound sample and
control material horseradish peroxidase conjugated
anti-human IgG antibodies are dispensed into the
Σ = 96 tests
REF DKI017
wells. During a second incubation this anti-IgG
conjugate binds specifically to IgG antibodies
resulting in the formation of enzyme-linked immune
complexes.
After a second washing step to remove unbound
conjugate the immune complexes formed (in case of
positive results) are detected by incubation with TMB
substrate and development of a blue color. The blue
color turns into yellow by stopping the enzymatic
indicator reaction with sulfuric acid.
The intensity of this color is directly proportional to the
amount of Helicobacter pylori-specific IgG antibody in
the patient specimen. Absorbance at 450 nm is read
using an ELISA microtiter plate reader.
3. REAGENTS, MATERIALS AND INSTRUMENTATION
3.1 Reagents and Materials Supplied in the Kit
1. Calibrators (3 vials, 2 mL each, ready to use)
CAL1
REF DCE002/01707i-0
CAL2
REF DCE002/01708i-0
CAL3
REF DCE002/01709i-0
2. Controls (2 vial, 2 mL each, ready to use)
Control concentration is Lot-specific and it is
indicated on the Certificate of Analysis
Positive Control
Negative Control
REF DCE045/01702i-0
REF DCE045/01701i-0
3. Conjugate (1 vial, 20 mL)
Antibody to human IgG conjugated to horseradish
peroxidase
REF DCE002/01702i-0
4. Coated Microplate (1 breakable microplate)
Microplate coated with recombinant Helicobacter pylori
Cag A antigen
REF DCE002/01703i-0
5. TMB Substrate (1 vial, 14 mL)
H2O2-TMB (avoid any skin contact)
REF DCE004/01704i-0
6. Stop Solution (1 vial, 14 mL)
Sulphuric acid 0.2 mol/L (avoid any skin contact)
REF DCE005/01705i-0
7. 20X Conc. Wash Solution (1 vial, 30 mL)
Buffer solution pH 7.2
REF DCE007/01707i-0
8. Sample diluent (1 vial, 100 mL)
Buffer solution pH 7.2
REF DCE053/01753i-0
3.2 Reagents necessary not supplied
Distilled water.
3.3 Auxiliary materials and instrumentation
Automatic dispenser.
Microplates reader (450 nm)
Note
Store all reagents at 2÷8°C in the dark.
Open the bag of reagent 4 (Coated Microplate) only
when it is at room temperature and close it
immediately after use. Opened kit retains activity
for two months if stored as described above.
4. WARNINGS
• This kit is intended for in vitro use by professional
persons only. Not for internal or external use in
Humans or Animals.
• Use appropriate personal protective equipment
while working with the reagents provided.
• Follow Good Laboratory Practice (GLP) for
handling blood products.
• All human source material used in the preparation
of the reagents has been tested and found
negative for antibody to HIV 1&2, HbsAg, and
HCV. No test method however can offer complete
assurance that HIV, HBV, HCV or other infectious
agents are absent. Therefore, the reagents should
be handled in the same manner as potentially
infectious material.
• Some reagents contain small amounts of Proclin
R
300 as preservative. Avoid the contact with skin
or mucosa.
• The TMB Substrate contains an irritant, which may
be harmful if inhaled, ingested or absorbed
through the skin. To prevent injury, avoid
inhalation, ingestion or contact with skin and eyes.
• The Stop Solution consists of a diluted sulphuric
acid solution. Sulphuric acid is poisonous and
corrosive and can be toxic if ingested. To prevent
chemical burns, avoid contact with skin and eyes.
• Avoid the exposure of reagent TMB/H2O2 to
directed sunlight, metals or oxidants. Do not
freeze the solution.
5. PRECAUTIONS
• Please adhere strictly to the sequence of pipetting
steps provided in this protocol. The performance
data represented here were obtained using
specific reagents listed in this Instruction For Use.
• All reagents should be stored refrigerated at 2-8°C
in their original container. Any exceptions are
clearly indicated. The reagents are stable until the
expiry date when stored and handled as indicated.
• Allow all kit components and specimens to reach
room temperature (22-28°C) and mix well prior to
use.
• Do not interchange kit components from different
lots. The expiry date printed on box and vials
labels must be observed. Do not use any kit
component beyond their expiry date.
• If you use automated equipment, the user has the
responsibility to make sure that the kit has been
appropriately tested.
•
•
•
•
•
•
•
The incomplete or inaccurate liquid removal from
the wells could influence the assay precision
and/or increase the background.
It is important that the time of reaction in each well
is held constant for reproducible results. Pipetting
of samples should not extend beyond ten minutes
to avoid assay drift. If more than 10 minutes are
needed, follow the same order of dispensation. If
more than one plate is used, it is recommended to
repeat the dose response curve in each plate
Addition of the TMB Substrate solution initiates a
kinetic reaction, which is terminated by the
addition of the Stop Solution. Therefore, the TMB
Substrate and the Stop Solution should be added
in the same sequence to eliminate any time
deviation during the reaction.
Observe the guidelines for performing quality
control in medical laboratories by assaying
controls and/or pooled sera.
Maximum precision is required for reconstitution
and dispensation of reagents.
Samples microbiologically contaminated, highly
lipemeic or haemolysed should not be used in the
assay.
Plate readers measure vertically. Do not touch the
bottom of the wells.
6. PROCEDURE
6.1. Preparation of the Calibrators (C1…C3)
The Calibrators are ready to use and have the
following concentration:
C1
C2
C3
AU/mL
15
75
150
6.2. Preparation of the Wash Solution
Dilute the content of each vial of the "20X Conc.
Wash Solution" with distilled water to a final volume
of 600 mL prior to use. For smaller volumes respect
the 1:20 dilution ratio. The diluted wash solution is
stable for 1 month at 2÷8°C.
In concentrated wash solution is possible to observe
the presence of crystals, in this case warm briefly at
37°C in a water bath until complete dissolution of
crystals.
6.3. Preparation of the sample
The specimens should be human serum or plasma.
Prior to assaying dilute each patient specimen
1:101 with Sample diluent (for example, add 10 µL
of serum to 1 mL of Sample diluent), mix well, let
stand for 15 minutes, mix weel again before use.
NB: Calibrators and Controls are ready for use and
must not be diluted.
To obtain the serum, collect blood by venipuncture,
allow to clot and separate the serum by centrifugation
at room temperature; do not centrifuge before
complete clotting has occurred; patients receiving
anticoagulant therapy may require increased clotting
time.
To obtain the plasma, whole blood should be
collected into centrifuge tubes containing anti
coagulant and centrifuged immediately after
collection.
Do not use haemolytic, icteric or lipaemic specimens.
Storage: specimens should be well capped and may
be stored for up to 24 hours at 2-8°C prior to
assaying; specimens held for a longer time should be
frozen only once at –20°C prior to assay; thawed
samples should be inverted several times prior to
testing.
•
•
•
•
•
6.4. Procedure
Allow all reagents to reach room temperature
(22-28°C).
Unused coated microwell strips should be
released securely in the foil pouch containing
desiccant and stored at 2-8°C.
To avoid potential microbial and/or chemical
contamination, unused reagents should never be
transferred into the original vials; use new disposal
plastic pipette tips for each Calibrator, Control and
sample, and dispense conjugate without splashing
accurately to the bottom of wells.
As it is necessary to perform the determination in
duplicate in order to improve accuracy of the test
results, prepare two wells for each point of the
calibration curve (C1-C3), two for each Control, two
for each sample, one for Blank.
During incubation cover microtiter strips with foil to
avoid evaporation
Reagent
Calibrators
C1-C3
Calibrator
Sample/
Control
Blank
100 µL
Diluted
Sample
100 µL
Controls
100 µL
Cover wells with foil supplied in the kit.
Incubate for 60 minutes at 37°C.
Briskly shake out the contents of the wells. Rinse the
wells 5 times with the diluted Wash Solution (300 µL
per well). Strike the wells sharply on absorbent paper
to remove residual droplets.
Important note:
The sensitivity and precision of this assay is markedly
influenced by the correct performance of the washing
procedure.
Conjugate
100 µL
100 µL
Cover wells with foil.
Incubate for 30 minutes at room temperature (2228°C).
Do not expose to direct sun light!
Briskly shake out the contents of the wells. Rinse the
wells 5 times with the diluted Wash Solution (300 µL
per well). Strike the wells sharply on absorbent paper
to remove residual droplets.
TMB
100 µL
100 µL
100 µL
Substrate
Cover wells with foil.
Incubate for 15 minutes at room temperature (2228°C) in the dark.
Stop
100 µL
100 µL
100 µL
Solution
Note: highly positive patient samples can cause dark
precipitates of the chromogen.
Read the optical density at 450/620 nm within 30
minutes after adding the Stop Solution (see
Measurement below).
Measurement:
Adjust the ELISA microplate or microstrip reader to
zero using the Blank.
If - due to technical reasons - the ELISA reader cannot
be adjusted to zero using the Blank in well, subtract
the absorbance value of Blank well from all other
absorbance values measured in order to obtain
reliable results.
Measure the absorbance of all wells at 450 nm and
record the absorbance values for each control and
patient sample in the distribution and identification
plan.
Dual wavelength reading using 620 nm as reference
wavelength is recommended. Where applicable
calculate the mean absorbance values of all
duplicates.
7. QUALITY CONTROL
It is recommended to use control samples according
to state and federal regulations. The use of control
samples is advised to assure the day to day validity
of results. Use controls at both normal and
pathological levels.
It is also recommended to make use of national or
international Quality Assessment programs in order
to ensure the accuracy of the results.
If the results of the assay do not fit to the established
acceptable ranges of control materials patient results
should be considered invalid.
In this case, please check the following technical
areas: pipetting and timing devices; photometer,
expiration dates of reagents, storage and incubation
conditions, aspiration and washing methods.
After checking the above mentioned items without
finding any error contact your distributor or Diametra
directly.
8. RESULTS
8.1. Validation of the test run
The test run may be considered valid provided the
following criteria are met:
Blank
Negative Control
Positive Control
Calibrator 1
Calibrator 2
Calibrator 3
Absorbance value
lower than 0.100
lower than 0.200
between 0.650 – 3.000
between 0.350 – 0.850
between 0.900 – 2.100
between 1.800 – 3.000
8.2. Calculation of quantitative results
In order to obtain quantitative results in AU/mL
(Arbitrary Units) plot the (mean) absorbance values
of Negative Control and Calibrator 1, 2 and 3 on
(linear/linear) graph paper in a system of coordinates
against their corresponding concentrations (0, 15,
75, 150 AU/mL) and draw a calibration curve
(absorbance values on the vertical y-axis,
concentrations on the horizontal x-axis).
Read results from this calibration curve employing
the (mean) absorbance values of each patient
specimen and control.
All suitable computer programs available can be
used for automated result reading and calculation.
The following mathematical functions can be used:
Linear regression or Point to Point calculation of the
calibration curve.
Note: values of additionally diluted patient samples
must be multiplied by the appropriate dilution factor
in order to obtain correct results.
8.3. Interpretation of quantitative results
Normal value ranges for this ELISA should be
established by each laboratory based on its own
patient populations in the geographical areas
serviced.
The following values should be considered as a
guideline:
Helicobacter pylori IgG
CUT-OFF
15 AU/mL
Positive
> 18 AU/mL
Grey Zone (equivocal)
15 - 18 AU/mL
Negative
< 15 AU/mL
8.4. Calculation of qualitative results
Absorbance value of Calibrator 1 (Cut-Off) = CO
Example: 0.56 = CO
8.5. Interpretation of qualitative results
• Positive: patient (mean) absorbance values
more than 20% above CO (mean OD patient
> 1.2 * CO)
• Grey Zone: patient (mean) absorbance
values from CO to 20% above CO; repeat
test 2 - 4 weeks later with new patient sample
(CO ≤ mean OD patient ≤ 1.2 * CO)
If the result in the second test is again in the
grey zone, consider the test negative
•
Negative: patient (mean) absorbance values
below CO (mean OD patient < CO)
9. PERFORMANCE AND CHARACTERISTICS
9.1. Diagnostic Specificity
The diagnostic specificity is defined as the probability
of the assay of scoring negative in the absence of
the specific analyte. For the evaluation 81 unselected
blood donor sera were used. These sera were tested
with Diametra Helicobacter pylori IgG ELISA in
addition to another commercially available IgG
ELISA.
The diagnostic specificity is 92%.
9.2. Diagnostic Sensitivity
The diagnostic sensitivity is defined as the probability
of the assay of scoring positive in the presence of
the specific analyte. For the evaluation 81 unselected
blood donor sera were used. These sera were tested
with Diametra Helicobacter pylori IgG ELISA in
addition to another commercially available IgG
ELISA.
The diagnostic sensitivity is > 99%.
9.3. Precision
The Inter-assay variation of the Diametra ELISA was
determined by repeated measurements of three
control samples at three different days.
Mean OD
SD
CV (%)
n
Sample 1
OD
0.03
0.00
5.48
12
Sample 2
OD
0.44
0.02
3.76
11
Sample 3
OD
1.64
0.10
6.11
12
The Intra-assay (within-run) variation of the Diametra
ELISA was determined by repeated measurements of
three control samples.
Mean OD
SD
CV (%)
n
Sample 1
OD
0.03
0.00
8.7
20
Sample 2
OD
0.46
0.02
3.8
20
Sample 3
OD
1.73
0.04
2.6
20
9.4. Analytical Sensitivity
The analytical sensitivity was calculated from the
mean minus two standard deviations of twenty (20)
replicate analyses of Negative Control and was found
to be 0,245 AU/mL.
10. LIMITATIONS OF USE
Bacterial contamination or repeated freeze-thaw
cycles of the specimen may affect the absorbance
values.
In immunocompromised patients and newborns
serological data only have restricted value.
10.1. Interfering Substances
Haemoglobin (up to 4 mg/mL), Bilirubin (up to 0.5
mg/mL) and Triglyceride (up to 30 mg/mL) have no
influence on the assay results.
11. WASTE MANAGEMENT
Reagents must be disposed off in accordance with
local regulations.
BIBLIOGRAPHY
• Stolte, M. Eidt, S. (1993) Healing gastric MALT
lymphomas by eradicating H.Pylori Lancet
342:568
• Stolte, M. (1992) H.Pylori and gastric MALT
lymphoma Lancet 339:745-746
• Parsonnet, J., Friedman, G.D., Vanderstetten,
D.P., Chang, y., Vogelman, J.H., Orentreich, N.,
Sibley, R.K. (1991) H. Pylori infection and the risk
of gastric carcinoma. N Engl J Med 325: 11271131
• Warren J.R. (1983) Unidentified curved bacilli on
gastric epithelIUm in active chronic gastritis,
Lancet: 1273-1275
• Marshall, B.J., Royce, H., D.I., Goodwin, C.S.,
Taylor, N.S., Edmonds, P., Sly, L.I., Brenner, D.J.
(1982) Orginal Isolation of Campylobacter
pyloridis from human gastric mucosa. Microbios
Letter 25:83
Ed. 05/2013
DCM017i-1
DiaMetra S.r.l. Headquater: Via Garibaldi, 18 –
20090 SEGRATE (MI) Italy
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