DCM018i-0
Ed. 07/2012
Helicobacter pylori IgM
per analisi di routine
Saggio immunoenzimatico per la determinazione degli anticorpi di classe IgM anti Helicobacter pylori nel
siero umano
LOT
IVD
Vedere etichetta esterna
DESTINAZIONE D’USO
Il kit Diametra Helicobacter pylori IgM fornisce
materiale per la determinazione degli anticorpi di
classe IgM diretti control l'Helicobacter pylori nel siero
umano, al fine di determinare lo stato sierologico
dell'infezione da Helicobacter pylori in pazienti con
sintomi gastrointestinali.
Il kit Diametra Helicobacter pylori IgM è destinato al
solo uso di laboratorio.
1. SIGNIFICATO CLINICO
L'Helicobacter pylori è un batterio a spirale coltivato da
mucosa gastrica umana scoperto da BJ Marshall nel
1982. Gli studi hanno indicato che la presenza di H.
pylori è associata ad una varietà di malattie
gastrointestinali quali gastrite, ulcere duodenali e
gastriche, dispepsia non ulcerosa, adenocarcinoma
gastrico e linfoma. Il microrganismo è presente nel 9598% dei pazienti con ulcere duodenali e 60-90% dei
pazienti con ulcere gastriche. Gli studi hanno inoltre
dimostrato che la rimozione del microrganismo
mediante terapia antimicrobica è correlata con la
risoluzione dei sintomi e la cura della malattia.
I pazienti che presentano sintomi clinici relativi al tratto
gastrointestinale possono essere diagnosticati per
l'infezione da H. pylori tramite due metodi:
1. Tecniche invasive - includono una biopsia seguita
da cultura batterica, l'esame istologico della
biopsia campione o il rilevamento diretto di
ureasi.
2. Tecniche non invasive - includono test dell'urea e
metodi sierologici.
Tutti i test eseguiti su campioni derivati da biopsia
sono soggetti ad errori relativi al campionamento e
all'interferenza di altri batteri contaminanti. Il test
ELISA per la presenza di anticorpi IgM specifici per H.
pylori è una tecnica molto utilizzata per test sierologici
per la sua precisione e semplicità.
2. PRINCIPIO DEL TEST
Il kit ELISA Diametra Helicobacter pylori IgM è un test
immunoenzimatico in fase solida (ELISA). La
micropiastra (fase solida) è coattata con antigeni
purificati di Helicobacter pylori. I campioni sierici diluiti
dei pazienti vengono pipettati nei pozzetti della
micropiastra, e gli anticorpi IgM specifici per H. Pylori,
se presenti, si legano all'antigene. Dopo l'incubazione i
componenti non legati sono lavati via.
Σ = 96 test
REF DKI018
Successivamente viene aggiunto l'enzima coniugato,
che si lega ai complessi anticorpo-antigene.
Dopo un secondo step di lavaggio per rimuovere il
coniugato non legato, i complessi immunologici formati
sono evidenziati mediante incubazione con Substrato
TMB. L'intensità del colore è direttamente
proporzionale alla quantità di anticorpo IgM anti
Helicobacter pylori nel campione del paziente.
L'assorbanza a 450 nm viene determinata con un
spettrofotometro ELISA per micropiastre.
3. REAGENTI, MATERIALI E STRUMENTAZIONE
3.1 Reagenti e materiali forniti nel kit
1. Calibratori (100 µL/vial)
CAL cut-off (H.pylori IgM Index = 1)
REF DCE002/01807i-0
2. Controlli (100 µL/vial)
Controllo Negativo (siero negativo a H. pylori IgM)
REF DCE045/01801i-0
Controllo Positivo (siero positivo a H. pylori IgM)
REF DCE045/01802i-0
3. Conjugate (1 flacone, 13 mL)
Anticorpi anti IgM umane coniugati a perossidasi di
rafano
REF DCE002/01802i-0
4. Coated Microplate (1 microplate breakable)
Micropiastra coattata con antigeni H. pylori purificati
REF DCE002/01803i-0
5. TMB Substrate (1 flacone, 11 mL)
H2O2-TMB (evitare il contatto con la pelle)
REF DCE004/01804i-0
6. Stop Solution (1 flacone, 11 mL)
Acido cloridrico 1N (evitare il contatto con la pelle)
REF DCE005/01805i-0
7. 20X Conc. Wash Solution (1 flacone, 50 mL)
Tampone fosfato - Tween 20 REF DCE007/01807i-0
8. Sample diluent (1 flacone, 22 mL)
Tampone fosfato
REF DCE053/01853i-0
3.2 Reattivi necessari non forniti nel kit
Acqua distillata.
3.3 Materiale e strumentazione ausiliare
Dispensatori automatici.
Lettore per micropiastre (450 nm)
Note
Conservare i reattivi a 2÷8°C, al riparo dalla luce.
Aprire la busta del reattivo 4 (Coated Microplate)
solo dopo averla riportata a temperatura ambiente e
chiuderla subito dopo il prelievo delle strip da
utilizzare. Il kit aperto mantiene l'attività per 2
mesi se conservato come descritto sopra.
4. AVVERTENZE
• Questo test kit è per uso in vitro, da eseguire da
parte di personale esperto. Non per uso interno o
esterno su esseri Umani o Animali.
• Usare i previsti dispositivi di protezione individuale
mentre si lavora con i reagenti forniti.
• Seguire le Buone Pratiche di Laboratorio (GLP) per
la manipolazione di prodotti derivati da sangue.
• Tutti i reattivi di origine umana usati nella
preparazione dei reagenti sono stati testati e sono
risultati negativi per la presenza di anticorpi antiHIV 1&2, per HbsAg e per anticorpi anti-HCV.
Tuttavia nessun test offre la certezza completa
dell’assenza di HIV, HBV, HCV o di altri agenti
infettivi. Pertanto, i reagenti devono essere
maneggiati come materiali potenzialmente infettivi.
• Alcuni reagenti contengono piccole quantità di
R
Proclin 300 come conservante. Evitare il contatto
con la pelle e le mucose.
• Il TMB Substrato contiene un irritante, che può
essere dannoso se inalato, ingerito o assorbito
attraverso la cute. Per prevenire lesioni, evitare
l’inalazione, l’ingestione o il contatto con la cute e
con gli occhi.
• La Stop Solution è costituita da una soluzione di
acido cloridrico diluito. L’acido cloridrico è velenoso
e corrosivo e può essere tossico se ingerito. Per
prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il
contatto con la cute e con gli occhi.
• Evitare l’esposizione del reagente TMB/H2O2 a luce
solare diretta, metalli o ossidanti. Non congelare la
soluzione.
5. PRECAUZIONI
• Si prega di attenersi rigorosamente alla sequenza
dei passaggi indicata in questo protocollo. I risultati
presentati qui sono stati ottenuti usando specifici
reagenti elencati in queste Istruzioni per l’Uso.
• Tutti i reattivi devono essere conservati a
temperatura controllata di 2-8°C nei loro contenitori
originali. Eventuali eccezioni sono chiaramente
indicate. I reagenti sono stabili fino alla data di
scadenza se conservati e trattati seguendo le
istruzioni fornite.
• Prima dell’uso lasciare tutti i componenti dei kit e i
campioni a temperatura ambiente (22-28°C) e
mescolare accuratamente.
• Non scambiare componenti dei kit di lotti diversi.
Devono essere osservate le date di scadenza
riportate sulle etichette della scatola e di tutte le
fiale. Non utilizzare componenti oltre la data di
scadenza.
• Qualora si utilizzi strumentazione automatica, è
responsabilità dell’utilizzatore assicurarsi che il kit
sia stato opportunamente validato.
•
•
•
•
•
•
•
Un lavaggio incompleto o non accurato dei pozzetti
può causare una scarsa precisione e/o un’elevato
background.
Per la riproducibilità dei risultati, è importante che il
tempo di reazione di ogni pozzetto sia lo stesso.
Per evitare il time shifting durante la dispensazione
degli reagenti, il tempo di dispensazione dei
pozzetti non dovrebbe estendersi oltre i 10 minuti.
Se si protrae oltre, si raccomanda di seguire lo
stesso ordine di dispensazione. Se si utilizza più di
una piastra, si raccomanda di ripetere la curva di
calibrazione in ogni piastra.
L’addizione del TMB Substrato dà inizio ad una
reazione cinetica, la quale termina con l’addizione
della Stop Solution. L’addizione del TMB Substrato
e della Stop Solution deve avvenire nella stessa
sequenza per evitare tempi di reazione differenti.
Osservare le linee guida per l’esecuzione del
controllo di qualità nei laboratori clinici testando
controlli e/o pool di sieri.
Osservare
la
massima
precisione
nella
ricostituzione e dispensazione dei reagenti.
Non
usare
campioni
microbiologicamente
contaminati, altamente lipemici o emolizzati.
I lettori di micropiastre leggono l’assorbanza
verticalmente. Non toccare il fondo dei pozzetti.
6. PROCEDIMENTO
6.1. Preparazione della soluzione di lavaggio
Prima dell’uso, diluire il contenuto di ogni fiala di "20X
Conc. Wash Solution" con acqua distillata fino al
volume di 1000 mL. Per preparare volumi minori
rispettare il rapporto di diluizione di 1:20. La soluzione
di lavaggio diluita è stabile a 2÷8°C per 30 giorni.
6.2. Preparazione del Campione
Il siero deve essere preparato da un campione di
sangue intero ottenuto con tecniche mediche
accettate. Questo kit deve essere utilizzato con
campioni di siero privi di additivi.
Tutti i campioni di siero, il controllo negativo,
controllo positivo e il calibratore devono essere
diluiti 1:40 con Sample diluent (per esempio, diluire
5 µL in 195 µL di Sample diluent). Mescolare bene.
I campioni possono essere conservati in frigorifero a
2-8°C per un massimo di 7 giorni oppure congelati per
un massimo di 6 mesi. Evitare ripetuti congelamenti e
scongelamenti dei campioni di siero.
•
•
•
6.3. Procedimento
Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente
(22-28°C).
Le strisce di pozzetti non utilizzate devono essere
rimesse immediatamente nella busta richiudibile
contenente il materiale essicante e conservate a 28°C.
Per evitare potenziali contaminazioni microbiche
e/o chimiche non rimettere i reagenti inutilizzati nei
flaconi originali; utilizzare puntali per pipette usa e
getta nuovi per ogni Calibratore, Controllo e
campione, e dispensare il coniugato con precisione
sul fondo dei pozzetti.
•
Al fine di aumentare l’accuratezza dei risultati del
test è necessario operare in doppio, allestendo due
pozzetti per ogni Calibratore, due per ogni
Controllo, due per ogni Campione ed uno per il
Bianco.
Reagenti
Calibratori e
Controlli,
diluiti
Campioni
diluiti
Sample
diluent
Calibratori
Campioni
/Controllo
Bianco
100 µL
/
/
/
100 µL
/
/
/
100 µL
Agitare delicatamente per 10 secondi.
Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente (2228°C).
Svuotare il contenuto dei pozzetti. Lavare i pozzetti 4
volte con la Wash Solution diluita (300 µL per
pozzetto) e successivamente 1 volta con acqua
distillata.
Nota importante:
La procedura di lavaggio è critica. Un lavaggio
insufficiente può portare a risultati errati.
Conjugate
100 µL
100 µL
100 µL
Agitare delicatamente per 10 secondi.
Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente (2228°C).
Svuotare il contenuto dei pozzetti. Lavare i pozzetti 4
volte con la Wash Solution diluita (300 µL per
pozzetto) e successivamente 1 volta con acqua
distillata.
TMB
Substrate
100 µL
100 µL
100 µL
Agitare delicatamente per 10 secondi.
Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente (2228°C) al buio.
Stop
Solution
100 µL
100 µL
100 µL
Agitare delicatamente per 30 secondi. Assicurarsi
che il colore blu viri totalmente al giallo.
Leggere la densità ottica a 450 nm entro 15 minuti.
7. CONTROLLO DI QUALITÀ
Il dosaggio può essere considerato valido se sono
soddisfatti i seguenti criteri:
1. il valore di OD del bianco deve essere minore
di 0.250.
2. il valore di OD del Calibratore Cut-off deve
essere maggiore di 0.250.
8. RISULTATI
8.1. Calcolo dei risultati quantitativi
1. Calcolare la media dei duplicati del calibratore
(Xc).
2. Calcolare la media dei duplicati del controllo
positivo, del controllo negativo e dei campioni
3. Calcolare l'"Indice per H.pylori IgM" per ogni
determinazione, dividendo il valore medio di
ogni campione per il valore medio del
Calibratore (Xc).
Esempio:
Indice H. pylori IgM del Calibratore Cut-off = 1
1. OD Calibratore Cut-off = 0.650, 0.630 xc = 0.640
2. OD Controllo Negativo = 0.210, 0.230 xn = 0.220
Indice H. pylori IgM =
xn / xc = 0.220 / 0.640 = 0.340
3. OD Controllo Positivo = 1.105, 1.210 xp = 1.200
Indice H. pylori IgM =
xp / xc = 1.200 / 0.640 = 1.80
4. OD campione = 1.501, 1.670 xs = 1.600
Indice H. pylori IgM =
xs / xc = 1.600 / 0.640 = 2.50
8.2. Interpretazione dei risultati
Negativo
Un'Indice H. pylori IgM minore di 0.90
è negativo per gli anticorpi IgM anti
H.pylori. Il campione potrebbe essere
stato prelevato troppo presto.
Equivoco
Un'Indice H. pylori IgM compreso tra
0.91 e 0.99 è equivoco. Ridosare il
paziente utilizzando un nuovo prelievo
sierico ottenuto dopo 3 settimane.
Positivo
Un'Indice H. pylori IgM maggiore di
1.00 (o uguale) è positivo.
9. LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA
1. Risultati affidabili e riproducibili si ottengono
quando la procedura del test è effettuata attraverso
una completa comprensione delle istruzioni per
l'uso e seguendo le buone pratiche di laboratorio.
2. La procedura di lavaggio è critica. Un lavaggio
insufficiente comporta una scarsa precisione e
letture di assorbanza falsamente elevate.
3. Sieri che mostrano lipemia, emolisi o torbidità non
devono essere utilizzati con questo test.
4. I risultati ottenuti con l'uso di questo kit devono
essere usati solo in aggiunta ad altre procedure
diagnostiche e alle informazioni a disposizione del
medico.
10. PARAMETRI CARATTERISTICI
10.1. Specificità Diagnostica
La specificità diagnostica é definita come la probabilità
del test di fornire un risultato negativo in assenza di
anticorpi specifici. La specificità diagnostica è 96%.
10.2. Sensibilità Diagnostica
La sensibilità diagnostica è definita come la probabilità
di fornire un risultato positivo in presenza di anticorpi
specifici. La sensibilità diagnostica è 97%.
11. DISPOSIZIONI PER LO SMALTIMENTO
I reagenti devono essere smaltiti in accordo con le
leggi locali.
BIBLIOGRAFIA
1. Marshall, B.J. and J.R. Warren.
Unidentified
curved bacilli in the stomach of patients with
gastritis and Peptic ulceration. Lancet 1: 13111314, 1984.
2. Ruaws, E.A.J. and G.N.J. Tytgat.
Cure of
duodenal ulcer associated with eradication of
Helicobacter pylori, Lancet 335: 1233-35, 1990.
3. Perez-Perez, G.I., S.S. Wilkin, M.D. Decker and
M.J. Blaswer. Seroprevalence of Helicobacter
pylori infection in couples. J. Clin. Microbiol.
29:642-644, 1991.
Ed. 07/2012
DCM018i-0
DiaMetra S.r.l. Headquater: Via Garibaldi, 18
20090 SEGRATE (MI) Italy
Tel. 0039-02-2139184 – 02-26921595
Fax 0039–02–2133354.
Manufactory: Via Pozzuolo 14, 06038 SPELLO (PG)
Italy
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Fax 0039–0742–316197
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DCM018i-0
Ed. 07/2012
Helicobacter pylori IgM
for routine analysis
Enzyme immunoassay for the detection of IgM antibodies to Helicobacter pylori in human serum.
LOT
IVD
See external label
INTENDED USE
Diametra ELISA Helicobacter pylori IgM kit provides
materials for the detection of IgM class antibodies to
Helicobacter pylori in human serum, to evaluate the
serologic status to Helicobacter pylori infection in
patients with gastrointestinal symptoms.
Helicobacter pylori IgM kit is intended for in vitro
diagnostic use only.
1. CLINICAL SIGNIFICANCE
Helicobacter pylori is a spiral bacterium cultured from
human gastric mucosa discovered by B.J. Marshall in
1982. Studies have indicated that the presence of H.
pylori is associated with a variety of gastrointestinal
diseases including gastritis, duodenal and gastric
ulcers,
non-ulcer
dyspepsia,
and
gastric
adenocarcinoma and lymphoma. The organism is
present in 95-98% of patients with duodenal ulcers
and 60-90% of patients with gastric ulcers. The
studies have also demonstrated that removal of the
organism by anti-microbial therapy is correlated with
the resolution of symptoms and cure of diseases.
Patients who present clinical symptoms relating to the
gastrointestinal tract can be diagnosed for H. pylori
infection by two methods:
1. Invasive techniques – include biopsy followed by
culture or histologic examination of biopsy
specimen or direct detection of urease activity.
2. Non-invasive techniques – include urea breath
tests and serological methods.
All of the testing performed on biopsy samples is
subject to errors related to sampling and interference
of contaminated bacteria. An ELISA test for the
presence of H. pylori specific IgM antibody is the
technique of choice for serologic tests because of its
accuracy and simplicity.
2. PRINCIPLE OF THE METHOD
Purified H. pylori antigen is coated on the surface of
microwells. Diluted patients serum is added to the
wells, and the H. pylori IgM specific antibody, if
present, binds to the antigen. All unbound materials
are washed away. Enzyme conjugate is added, which
binds to the antibody-antigen complex.
Excess
enzyme conjugate is washed off and a solution of
TMB Reagent is added. The enzyme conjugate
catalytic reaction is stopped at a specific time. The
intensity of the color generated is proportional to the
Σ = 96 tests
REF DKI018
amount of IgM-specific antibody in the sample. The
results are read by a microwell reader compared in a
parallel manner with calibrator and controls.
3. REAGENTS, MATERIALS AND INSTRUMENTATION
3.1 Reagents and Materials Supplied in the Kit
1. Calibrator (100 µL/vial)
CAL cut-off (H. pylori IgM Index = 1)
REF DCE002/01807i-0
2. Controls (100 µL/vial)
Negative Control (H. pylori IgM negative serum)
REF DCE045/01801i-0
Positive Control (H. pylori IgM positive patient serum)
REF DCE045/01802i-0
3. Conjugate (1 vial, 13 mL)
Antibody to human IgM conjugated to horseradish
peroxidase
REF DCE002/01802i-0
4. Coated Microplate (1 breakable microplate)
Microplate coated with purified H. pylori antigen
REF DCE002/01803i-0
5. TMB Substrate (1 vial, 11 mL)
H2O2-TMB (avoid any skin contact)
REF DCE004/01804i-0
6. Stop Solution (1 vial, 11 mL)
Hydrochloric acid 1N (avoid any skin contact)
REF DCE005/01805i-0
7. 20X Conc. Wash Solution (1 vial, 50 mL)
Phosphate buffer - Tween 20 REF DCE007/01807i-0
8. Sample diluent (1 vial, 22 mL)
Phosphate buffer
REF DCE053/01853i-0
3.2 Reagents necessary not supplied
Distilled water.
3.3 Auxiliary materials and instrumentation
Automatic dispenser.
Microplates reader (450 nm)
Note
Store all reagents at 2÷8°C in the dark.
Open the bag of reagent 4 (Coated Microplate) only
when it is at room temperature and close it
immediately after use. Opened kit retains activity
until the expiry date shown, provided it is stored as
described above.
4. WARNINGS
• This kit is intended for in vitro use by professional
persons only. Not for internal or external use in
Humans or Animals.
• Use appropriate personal protective equipment
while working with the reagents provided.
• Follow Good Laboratory Practice (GLP) for
handling blood products.
• All human source material used in the preparation
of the reagents has been tested and found
negative for antibody to HIV 1&2, HbsAg, and
HCV. No test method however can offer complete
assurance that HIV, HBV, HCV or other infectious
agents are absent. Therefore, the reagents should
be handled in the same manner as potentially
infectious material.
• Some reagents contain small amounts of Proclin
R
300 as preservative. Avoid the contact with skin
or mucosa.
• The TMB Substrate contains an irritant, which may
be harmful if inhaled, ingested or absorbed
through the skin. To prevent injury, avoid
inhalation, ingestion or contact with skin and eyes.
• The Stop Solution consists of a diluted
hydrochloric acid solution. Hydrochloric acid is
poisonous and corrosive and can be toxic if
ingested. To prevent chemical burns, avoid
contact with skin and eyes.
• Avoid the exposure of reagent TMB/H2O2 to
directed sunlight, metals or oxidants. Do not
freeze the solution.
5. PRECAUTIONS
• Please adhere strictly to the sequence of pipetting
steps provided in this protocol. The performance
data represented here were obtained using
specific reagents listed in this Instruction For Use.
• All reagents should be stored refrigerated at 2-8°C
in their original container. Any exceptions are
clearly indicated. The reagents are stable until the
expiry date when stored and handled as indicated.
• Allow all kit components and specimens to reach
room temperature (22-28°C) and mix well prior to
use.
• Do not interchange kit components from different
lots. The expiry date printed on box and vials
labels must be observed. Do not use any kit
component beyond their expiry date.
• If you use automated equipment, the user has the
responsibility to make sure that the kit has been
appropriately tested.
• The incomplete or inaccurate liquid removal from
the wells could influence the assay precision
and/or increase the background.
• It is important that the time of reaction in each well
is held constant for reproducible results. Pipetting
of samples should not extend beyond ten minutes
to avoid assay drift. If more than 10 minutes are
needed, follow the same order of dispensation. If
more than one plate is used, it is recommended to
repeat the dose response curve in each plate
•
•
•
•
•
Addition of the TMB Substrate solution initiates a
kinetic reaction, which is terminated by the
addition of the Stop Solution. Therefore, the TMB
Substrate and the Stop Solution should be added
in the same sequence to eliminate any time
deviation during the reaction.
Observe the guidelines for performing quality
control in medical laboratories by assaying
controls and/or pooled sera.
Maximum precision is required for reconstitution
and dispensation of reagents.
Samples microbiologically contaminated, highly
lipemic or haemolysed should not be used in the
assay.
Plate readers measure vertically. Do not touch the
bottom of the wells.
6. PROCEDURE
6.1. Preparation of the Wash Solution
Dilute the content of each vial of the "20X Conc.
Wash Solution" 1:20 with distilled water; for example
dilute 50 mL of "20X Conc. Wash Solution" in 950 mL
of distilled water. For smaller volumes respect the
1:20 dilution ratio. The diluted wash solution is stable
for 1 month at 2÷8°C.
6.2. Preparation of the sample
Serum should be prepared from a whole blood
specimen
obtained
by
acceptable
medical
techniques. This kit is for use with serum samples
without additives only.
All serum samples, Negative Control, Positive
Control and the Calibrator must be diluted 1:40
with the Sample Diluent (for example, dilute 5 µL in
195 µL of sample diluent). Mix well.
Specimens may be refrigerated at 2-8° C for up to 7
days or frozen for up to 6 months.
Avoid repetitive freezing and thawing of serum
sample.
•
•
•
•
6.3. Procedure
Allow all reagents to reach room temperature
(22-28°C).
Unused coated microwell strips should be
released securely in the foil pouch containing
desiccant and stored at 2-8°C.
To avoid potential microbial and/or chemical
contamination, unused reagents should never be
transferred into the original vials; use new disposal
plastic pipette tips for each Calibrator, Control and
sample, and dispense conjugate without splashing
accurately to the bottom of wells.
As it is necessary to perform the determination in
duplicate in order to improve accuracy of the test
results, prepare two wells for the Calibrator, two for
each Control, two for each sample, one for Blank.
Reagent
Diluted
Calibrator and
Controls
Diluted
Sample
Sample/
Control
Blank
100 µL
/
/
/
100 µL
/
Calibrator
Sample
/
/
100 µL
Diluent
Tap the holder to remove air bubbles from the liquid
and mix well for 10 seconds.
Incubate for 30 minutes at room temperature (2228°C).
Briskly shake out the contents of the wells. Rinse the
wells 4 times with the diluted Wash Solution (300 µL
per well), and then 1 time with distilled water (please
do not use tap water).
Important note:
The wash procedure is critical. Insufficient washing
will result in improper color development.
Conjugate
100 µL
100 µL
100 µL
Mix gently for 10 seconds.
Incubate for 30 minutes at room temperature (2228°C).
Briskly shake out the contents of the wells. Rinse the
wells 4 times with the diluted Wash Solution (300 µL
per well), and then 1 time with distilled water (please
do not use tap water).
8. RESULTS
8.1. Calculation of results
1. Calculate the mean of duplicate calibrator value
(xc).
2. Calculate the mean of duplicate positive control,
negative control and patient samples.
3. Calculate the H. pylori IgM EIA Index of each
determination by dividing the mean values of each
sample by calibrator mean value (xc).
Example of typical results
Cut-off Calibrator H. pylori IgM EIA Index = 1
5. Cut-off Calibrator O.D. = 0.650, 0.630 xc = 0.640
6. Negative Control O.D. = 0.210, 0.230 xn = 0.220
H. pylori IgM EIA Index =
xn / xc = 0.220 / 0.640 = 0.340
7. Positive Control O.D. = 1.105, 1.210 xp = 1.200
H. pylori IgM EIA Index =
xp / xc = 1.200 / 0.640 = 1.80
8. Patient sample O.D. = 1.501, 1.670 xs = 1.600
H. pylori IgM EIA Index =
xs / xc = 1.600 / 0.640 = 2.50
8.2. Interpretation of results
Negative
H. pylori IgM EIA Index less than
0.90 is seronegative for IgM
antibody to H. pylori. The serum
sample may have been taken too
early.
Mix gently for 10 seconds.
Incubate for 20 minutes at room temperature (2228°C) in the dark.
Equivocal
H. pylori IgM EIA Index between
0.91 - 0.99 is equivocal. Retest in a
parallel fashion with a new serum
sample drawn 3 weeks later.
Stop
Solution
Positive
H. pylori IgM EIA Index of 1.00 or
greater is seropositive.
TMB
Substrate
100 µL
100 µL
100 µL
100 µL
100 µL
100 µL
Mix gently for 30 seconds. It is important to make
sure that all the blue color changes to yellow
color completely.
Read the optical density at 450 nm within 15
minutes with a microtiter plate reader.
7. QUALITY CONTROL
The test run may be considered valid provided the
following criteria are met:
1. The O.D. value of the reagent blank against air
from a microwell reader should be less than
0.250.
2. If the O.D. value of the Cut-off Calibrator is lower
than 0.250, the test is not valid and must be
repeated.
9. LIMITATIONS OF USE
1. Reliable and reproducible results will be obtained
when the assay procedure is carried out with a
complete understanding of the package insert
instructions and with adherence to good laboratory
practice.
2. The wash procedure is critical. Insufficient
washing will result in poor precision and falsely
elevated absorbance readings.
3. Serum samples demonstrating gross lipemia,
gross hemolysis, or turbidity should not be used
with this test.
4. The results obtained from the use of this kit should
be used only as an adjunct to other diagnostic
procedures and
information available to the
physician.
10. PERFORMANCE AND CHARACTERISTICS
10.1. Diagnostic Specificity
The diagnostic specificity is defined as the probability
of the assay of scoring negative in the absence of the
specific analyte. It is 96%.
10.2. Diagnostic Sensitivity
The diagnostic sensitivity is defined as the probability
of the assay of scoring positive in the presence of the
specific analyte. It is 97%.
11. WASTE MANAGEMENT
Reagents must be disposed off in accordance with
local regulations.
BIBLIOGRAPHY
1. Marshall, B.J. and J.R. Warren. Unidentified
curved bacilli in the stomach of patients with
gastritis and Peptic ulceration. Lancet 1: 13111314, 1984.
2. Ruaws, E.A.J. and G.N.J. Tytgat.
Cure of
duodenal ulcer associated with eradication of
Helicobacter pylori, Lancet 335: 1233-35, 1990.
3. Perez-Perez, G.I., S.S. Wilkin, M.D. Decker and
M.J. Blaswer. Seroprevalence of Helicobacter
pylori infection in couples. J. Clin. Microbiol.
29:642-644, 1991.
Ed. 07/2012
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