BEIA Helicobacter pylori IgA
20996
.
Edizione
20/04/2013
Solo per uso professionale
TECHNOGENETICS SRL
N° 00539
Pag. 1 - 24 BEIA Helicobacter pylori IgA Ed. 20/04/2013
INTRODUZIONE
Il kit BEIA Helicobacter pylori IgA è un test immunoenzimatico
qualitativo (ELISA) per la determinazione nel siero o nel plasma umano
degli anticorpi di classe IgA specifici verso il batterio Helicobacter
pylori.
SIGNIFICATO CLINICO
Nel 1983 Warren e Marshall identificarono, in pazienti affetti da gastrite,
un nuovo patogeno batterico gram-negativo che fu denominato
Helicobacter Pylori. In seguito sono stati eseguiti diversi studi allo scopo
di chiarire il rapporto tra l’infezione batterica e patologie gastriche
croniche. E’ stato dimostrato che il patogeno è associato all’ulcera peptica,
alla gastrite cronica di tipo B ed alla duodenite. Inoltre è stato dimostrato
che, in pazienti affetti da gastrite, l’eliminazione del batterio portava alla
guarigione della lesione anatomica. Le procedure diagnostiche dirette alla
rilevazione dell’organismo e della patologia gastrica prevedono
normalmente delle tecniche invasive (gastroscopia), tuttavia si può
osservare nel paziente infetto una risposta immuno-specifica. Il test
sierologico rappresenta quindi un metodo alternativo, rapido e semplice
rispetto alla tecnica bioptica.Numerosi studi hanno evidenziato che la
concentrazione delle IgG anti Helicobacter pylori, anche se nella fase
iniziale può non correlare con la severità della malattia, gioca un ruolo
importante nella fase successiva di monitoraggio del trattamento
terapeutico. Oltre alle IgG anche le IgA possono essere presenti e la loro
rilevazione può essere di ausilio per dirimere i casi dove la
determinazione delle IgG ha dato valori dubbi.
Recentemente numerosi studi hanno evidenziato la correlazione tra
proteine ad alto peso molecolare ( 120-140 KDa ) codificate dal gene CagA
ed un maggior rischio di sviluppare cancro allo stomaco ed ulcere
duodenali. Pertanto la determinazione delle IgG anti-CagA si rivela un
test sicuramente molto sensibile per diagnosticare tali patologie.
PRINCIPIO DEL METODO
Il test BEIA Helicobacter pylori IgA è un dosaggio immunoenzimatico in
micropozzetti. I micropozzetti di polistirene sono rivestiti con gli antigeni
rappresentativi dell’ Helicobacter pylori. I campioni da esaminare
vengono incubati nei micropozzetti; le IgA del campione si legano
Pag. 2 - 24 BEIA Helicobacter pylori IgA Ed. 20/04/2013
formando un complesso antigene-anticorpo. Dopo eliminazione mediante
lavaggio dei componenti del siero non legati alla fase solida, la presenza
di IgA anti-Helicobacter pylori viene rilevata attraverso il legame con un
anticorpo monoclonale anti-IgA umane coniugato con perossidasi. Dopo
allontanamento del coniugato enzimatico non legato, viene aggiunto il
substrato-TMB che, per azione dell’enzima presente sulla fase solida,
sviluppa una colorazione azzurra. L’aggiunta di una soluzione di acido
solforico 1N blocca la reazione e provoca il viraggio del colore
dall’azzurro al giallo. La densità ottica letta a 450/620 nm è direttamente
proporzionale alla quantità di IgA specifiche presenti nel campione in
esame.
CONTENUTO DELLA CONFEZIONE
La confezione è sufficiente per 96 determinazioni.
Componente
SORB
A
Strip da 8 micropozzetti frazionabili
12x8x1
CONTROL
-
B
Controllo Negativo
1 x 2 mL
CAL
CO
C
Calibratore Cut-Off
1 x 2 mL
CONTROL
+
D
Controlo Positivo
1 x 2 mL
DIL
SPE
E
Diluente Campioni BEIA System
1 x 120 mL
BUF
WASH 20X
F
Tampone di Lavaggio
1 x 100 mL
G
Coniugato
1 x 13,5 mL
H
Substrato-TMB
1 x 13,5 mL
I
Soluzione Stoppante
1 x 25 mL
Istruzioni per l’uso
1
CONJ
SUBS
TMB
H2SO4
A.
B.
Strip sensibilizzate
Strip sensibilizzate con antigeni purificati da Helicobacter pylori
inattivato, in busta ermetica richiudibile. Riporre le strip non
utilizzate nella busta e richiudere. Le strip sono frazionabili in
micropozzetti singoli.
Controllo negativo
Siero umano negativo per anticorpi IgA anti-Helicobacter pylori.
Contiene 0,09% p/p di sodio azide come conservante.
Reagente pronto all'uso.
Pag. 3 - 24 BEIA Helicobacter pylori IgA Ed. 20/04/2013
C.
D.
E.
F.
G.
H.
I.
Calibratore Cut-off
Siero umano a concentrazione nota di anticorpi IgA antiHelicobacter pylori. Contiene 0,09% p/p di sodio azide come
conservante. Reagente pronto all’uso.
Controllo positivo
Siero umano positivo per anticorpi IgA anti-Helicobacter pylori.
Contiene 0,09% p/p di sodio azide come conservante.
Reagente pronto all'uso.
Diluente Campioni BEIA System
Soluzione salina tamponata (PBS) e proteine. Contiene 0,09% p/p di
sodio azide come conservante e Tween 20. Reagente pronto all'uso.
Tampone di Lavaggio
Soluzione salina tamponata (PBS) concentrata 20 volte. Contiene 0,1 %
di Kathon CG e Tween 20. Vedi preparazione dei reagenti.
Coniugato
Soluzione contenente anticorpo monoclonale anti-IgA umane,
marcato con perossidasi. Reagente pronto all'uso.
Substrato-TMB
Soluzione contenente H2O2/TMB, stabilizzanti e colorante (rosa).
Reagente pronto all'uso.
Soluzione Stoppante
Soluzione 1N di acido solforico. Reagente pronto all'uso.
MODALITÀ DI CONSERVAZIONE
Tutti i reattivi devono essere conservati a 2-8°C al riparo dalla luce. Non
utilizzare i reattivi oltre la data di scadenza riportata sull’etichetta.
REAGENTI INTERCAMBIABILI
Il Diluente Campioni BEIA System, il Tampone di Lavaggio, il Substrato-TMB
e la Soluzione Stoppante sono intercambiabili tra i diversi kit della linea
BEIA.
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MATERIALE E STRUMENTI RICHIESTI, MA NON FORNITI





Lettore di colorimetria per micropiastre con filtro a 450/620 nm.
Apparecchiatura manuale o automatica per il lavaggio di
micropiastre.
Micropipette con puntali monouso da 10, 100, 1000 µL.
Provette monouso e normale vetreria da laboratorio.
Acqua distillata o deionizzata.
AVVERTENZE E PRECAUZIONI









Prima dell'uso portare tutti i reattivi a temperatura ambiente (1825°C). Prelevare solo la quantità necessaria per l'analisi.
Evitare l'essiccamento dei micropozzetti.
Usare esclusivamente vetreria accuratamente pulita.
Non utilizzare uno stesso puntale per pipettare reagenti diversi.
Cambiare il puntale tra un campione e l’altro.
Qualora il Substrato-TMB evidenziasse un viraggio da rosa ad
azzurro, il reagente non deve essere utilizzato.
Se il dosaggio viene ripetuto, preparare una nuova diluizione del
campione.
Si raccomanda di inserire in ogni corsa analitica dei campioni di
controllo al fine di validare i risultati ottenuti, secondo criteri e
procedure che ciascun utilizzatore deve definire.
Procedere periodicamente alla manutenzione e taratura delle
pipette e del lettore.
AUTOMAZIONE
Il test può essere eseguito con sistemi automatici per kit ELISA, nel qual
caso Vi invitiamo a consultare il manuale specifico dello strumento per
una corretta esecuzione della corsa analitica.
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PRELIEVO E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
Il dosaggio può essere eseguito su siero o plasma (Eparina-EDTA). Se il
dosaggio è eseguito entro 5 giorni dal prelievo, i campioni possono essere
conservati a 2-8 °C. In caso contrario, aliquotare i campioni e congelarli a 20°C. Evitare ripetuti scongelamenti e congelamenti. Si sconsiglia l’uso di
campioni lipemici, torbidi ed emolizzati. I campioni devono essere
opportunamente diluiti con il Diluente Campioni BEIA System prima del
dosaggio. Vedi esecuzione del test.
PREPARAZIONE DEI REAGENTI

Tampone di Lavaggio
Diluire il Tampone di Lavaggio (20x) 1:20 con acqua distillata o
deionizzata prima dell'uso. Dopo ricostituzione il tampone è stabile
15 giorni se conservato a 2-8°C e comunque non oltre la data di
scadenza riportata sull'etichetta originaria. Nel Tampone di Lavaggio
concentrato si possono formare dei precipitati cristallini che si
solubilizzano portando il reagente a 37°C prima della diluizione. Si
raccomanda di diluire la quantità di tampone necessaria per
eseguire i lavaggi dell'analisi in corso.
CICLO DI LAVAGGIO
Si consiglia di procedere come segue sia nel caso in cui si utilizzi un
lavatore automatico di micropiastre sia nel caso in cui si operi
manualmente.
1. Svuotare completamente i pozzetti.
2. Riempirli con 300 µL di tampone di lavaggio.
3. Svuotare i pozzetti.
4. Ripetere i punti 2 e 3 per ulteriori 3 cicli.
5. Asciugare con carta assorbente la superficie esterna dei pozzetti al
termine del lavaggio.
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ESECUZIONE DEL TEST
Portare i reagenti a temperatura ambiente (almeno 30-60 minuti a 1825°C).
1. Diluire (1:81) i campioni in esame con il Diluente Campioni BEIA
System (esempio 10 µL di siero e 800 µL di Diluente Campioni BEIA
System). Agitare su Vortex.
2. Prelevare il numero di strip necessario per l'analisi in funzione del
numero di campioni in esame, dei Controlli e del Calibratore cut-off
(vedi il paragrafo “Schema del dosaggio”). Richiudere
accuratamente la busta.
3. Dispensare nei rispettivi pozzetti 100 L di ciascun siero prediluito
in esame, dei Controlli e del Calibratore cut-off.
4. Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25°C) per 30 minuti.
5. Eseguire la procedura di lavaggio dei pozzetti seguendo il
procedimento raccomandato (vedi Ciclo di lavaggio).
6. Dispensare in ciascun pozzetto 100 µL di Coniugato.
7. Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25°C) per 30 minuti.
8. Eseguire la procedura di lavaggio dei pozzetti seguendo il
procedimento raccomandato (vedi Ciclo di lavaggio).
9. Dispensare in ciascun pozzetto 100 µL di Substrato-TMB.
10. Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25°C) per 15 minuti.
11. Bloccare la reazione cromogenica dispensando in ciascun pozzetto
100 µL di Soluzione Stoppante.
12. Leggere la densità ottica (DO) in bicromatismo a 450/620 nm.
CALCOLO ED INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
VALIDAZIONE DELLA SEDUTA ANALITICA
Le condizioni che consentono l’accettazione dei risultati sono :


il rapporto tra la DO del Controllo positivo la DO del Calibratore
Cut-off deve essere > 1,5
il rapporto tra la DO del Controllo negativo e la DO del Calibratore
Cut-off deve essere < 0,3
Pag. 7 - 24 BEIA Helicobacter pylori IgA Ed. 20/04/2013
Qualora la seduta dia risultati non conformi alle condizioni sopra
elencate, essa non è validabile ed i risultati relativi ai campioni non
possono essere refertati senza analisi critica documentata. La non
conformità va qualificata e trattata secondo le procedure di Assicurazione
Qualità proprie del laboratorio.
Si consiglia di instaurare ed attuare procedure di Controllo Qualità
interne al laboratorio, i cui risultati concorrano alla validazione delle
sedute ed alla gestione di eventuali non conformità.
CALCOLO DEI RISULTATI
Al fine di correlare il risultato analitico allo stato immunitario del
campione si suggerisce di determinare i risultati calcolando l’index
anticorpale (I.A.) con la seguente formula:
DO campione
Index Anticorpale (I.A.)
=
_______________________________________________
DO Calibratore Cut-off
Per il Calibratore Cut-off calcolare, se eseguito in multiplo, il valore
medio di densità ottica (mDO). I seguenti valori devono essere
considerati solo come un esempio e non devono essere usati in luogo dei
dati ottenuti dall'utilizzatore.
Esempio di calcolo:
Controllo negativo
Calibratore Cut-off
Controllo positivo
Campione A
Campione B
Campione C
1ª DO
0,125
0,511
1,095
0,170
0,710
1,058
2ª DO
0,081
0,503
1,072
-
mDO
0,103
0,507
1,083
I.A.
0,20
2,14
0,34
1,40
2,09
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INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Studi effettuati su campioni di popolazione equivalente a quella europea
hanno condotto a stabilire i seguenti criteri interpretativi:
I.A.
> 1,1
 0,9
0,9 1,1
INTERPRETAZIONE
Il campione è da considerare POSITIVO per la
presenza di anticorpi di classe IgA antiHelicobacter pylori
Il campione è da considerare NEGATIVO per la
presenza di anticorpi di classe IgA antiHelicobacter pylori
ZONA GRIGIA: Il campione è da considerare
DUBBIO per la presenza di anticorpi di classe
IgA anti-Helicobacter pylori
Va tenuto presente che:
- il test indica solo la presenza o assenza di anticorpi specifici di classe
IgA. Non è di per sé e univocamente indice di uno stato infettivo;
- una decisione medica non può essere basata sul risultato di un solo test,
ma va fondata sull’insieme dei dati clinici disponibili;
- dati clinici discrepanti vanno risolti prima di prendere la decisione,
eventualmente col conforto di test di conferma o di II livello;
- risultati compresi entro la zona grigia vanno chiariti: con la ripetizione
del test sullo stesso campione; con la ripetizione del test su un prelievo
successivo; col confronto con un test di riferimento.
PRESTAZIONI DEL KIT
Avvertenza: i dati presentati sotto questa voce non rappresentano le
specifiche di funzionamento del kit, ma costituiscono evidenza
sperimentale di come il kit funzioni entro tali specifiche nel modo
previsto dal fabbricante.
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SENSIBILITÀ E SPECIFICITÀ
Sensibilità e specificità sono state valutate confrontando le prestazioni del
kit BEIA Helicobacter pylori IgA nei confronti di un kit già immesso sul
mercato con prestazioni accettabili (EIA Helicobacter pylori IgA).
BEIA
Helicobacter p. IgA
+
-
EIA Helicobacter p. IgA
+
48
11
7
121
Da questi dati si ottiene:
Sensibilità relativa
Specificità relativa
Concordanza
87,3%
91,7%
90,4%
SPECIFICITÀ ANALITICA
Non è stata rilevata alcuna interferenza in sieri contenenti fino a 10
mg/mL di emoglobina, fino a 1 mg/mL di bilirubina e fino a 30
mg/mL di trioleina. L’uso di campioni lipemici, torbidi o emolizzati
viene comunque sconsigliato.
RIPETIBILITÀ
La variabilità intra-saggio ed inter-saggio è stata determinata valutando
un campione negativo con I.A. < 0,5 e due campioni positivi
rispettivamente con I.A. di circa 1,5 e 2,0. I campioni sono stati replicati 6
volte per seduta in ciascuna di 12 sedute diverse per l’intra-assay ed 1
replicato per seduta in ciascuna di 12 diverse sedute per l’inter-assay.
Sono stati ottenuti coefficienti di variazione inferiori al 15 % per il
campione negativo ed inferiori al 10 % per i due campioni positivi.
LIMITAZIONI
Contaminazione batterica o ripetuti scongelamenti e congelamenti dei
campioni possono alterare i livelli rilevabili di IgA specifiche.
Pag. 10 - 24 BEIA Helicobacter pylori IgA Ed. 20/04/2013
PRINCIPI GENERALI DI SICUREZZA

Tenere in ordine il laboratorio ed effettuare con cura le operazioni
previste per l'esecuzione del test.

Non mangiare, bere, fumare o usare cosmetici nell’area di
laboratorio designata.

Non pipettare soluzioni o campioni con la bocca.

Evitare il contatto diretto con i reattivi ed i campioni indossando
guanti monouso e camici.

Lavare accuratamente le mani al termine del dosaggio.

Pulire immediatamente con opportuni detergenti le superfici di
lavoro eventualmente contaminate.

Raccogliere il materiale solido o liquido utilizzato per il dosaggio in
appositi contenitori ed effettuare lo smaltimento secondo le norme
vigenti.

Controllare periodicamente il grado di contaminazione
dell'ambiente di lavoro e degli operatori.
Reagenti contenenti siero

I derivati da sangue umano inclusi nel kit sono stati analizzati e
trovati negativi per HbsAg, anti-HCV ed anticorpi anti-HIV. Poiché
nessun metodo può garantire che tali derivati non possano
trasmettere epatite, AIDS o altre infezioni, si raccomanda di
manipolare i reagenti con le opportune cautele.
Reagenti pericolosi

Soluzione Stoppante (Council Directive 88/379/EEC)
R36/38
Irritante per gli occhi e per la pelle
S26
In caso di contatto con gli occhi, lavare
immediatamente ed abbondantemente con acqua e consultare un
medico.
Pag. 11 - 24 BEIA Helicobacter pylori IgA Ed. 20/04/2013
SCHEMA DEL DOSAGGIO












A
B
C
D
E
F
G
H
Preparare i reattivi e portarli a temperatura ambiente
Diluire i campioni 1:81 con il Diluente Campioni BEIA System
Dispensare :
- 100 L di Controllo Negativo in singolo o doppio
- 100 L di Calibratore Cut-off in doppio
- 100 L di Controllo Positivo in singolo o doppio
- 100 L di campioni prediluiti in singolo o doppio
Incubare 30 minuti a T.A. (18-25°C)
Eseguire 4 cicli di lavaggio
Dispensare 100 L di Coniugato
Incubare 30 minuti a T.A. (18-25°C)
Eseguire 4 cicli di lavaggio
Dispensare 100 L di Substrato-TMB
Incubare 15 minuti a T.A. (18-25°C)
Dispensare 100 L di Soluzione Stoppante
Leggere le densità ottiche al fotometro a 450/620 nm
1
CN
CN
CCO
CCO
CP
CP
P1
P2
2
P3
P4
P5
…
…
…
…
…
3
4
…
Pag. 12 - 24 BEIA Helicobacter pylori IgA Ed. 20/04/2013
BEIA Helicobacter pylori IgA
20996
Version
20/04/2013
For professional use only
TECHNOGENETICS SRL
Pag. 13 - 24 BEIA Helicobacter pylori IgA Ed. 20/04/2013
INTENDED USE
The BEIA Helicobacter pylori IgA kit is a qualitative enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA) for the detection of IgA antibodies to
Helicobacter pylori , in human serum or plasma samples.
CLINICAL RELEVANCE
In 1983 Warren and Marshall identified, in patients with gastric disease,
a new gram-negative pathogenous bacterium, which was denominated
Helicobacter pylori. Afterwards many works were carried out to correlate
the bacterial infection with the gastric disease. It has been demonstrated
that the Helicobacter pylori infection is related with peptic ulcer, type B
chronic gastritis and duodenitis. Moreover it has been demonstrated that,
in patients with gastric disease, the bacterium eradication gave the
recovery from the anatomic lesion. The microrganism can be isolated and
diagnosed with invasive techniques (gastroscopy); it is possible to
diagnose the infection with a serologic assay as it has been observed an
immunospecific answer by the microrganism. Many studies have
pointed out that the IgG and/or IgA antibodies concentration is a
predective value to diagnose the Helicobacter pylori infection. Moreover
it has been demonstrated that the IgG and IgA fall significantly after
successful antibacterial therapy.
Recently it has been demonstrated the correlation between the presence of
antibodies to proteins with high molecular weight (120-140 kDa),
expressed by the gene CagA, and pathologic states like duodenal ulcer
and gastric cancer. So the IgG anti-CagA determination is a sensitive test
to point out these pathologies.
PRINCIPLE OF THE ASSAY
The BEIA Helicobacter pylori IgA kit is a qualitative enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA) for the detection of specific IgA antibodies
to Helicobacter pylori, in human serum or plasma. During the first
incubation, only anti-Helicobacter pylori specific antibodies present in
serum or plasma bind to the inner surface of the wells coated with the
Helicobacter pylori antigen. After the first incubation the wells are
washed to remove non-reactive serum components. During the second
incubation a monoclonal antibody anti-human IgA conjugated with
horseradish peroxidase (HRP) is added.
Pag. 14 - 24 BEIA Helicobacter pylori IgA Ed. 20/04/2013
After a second washing cycle, a Substrate-TMB solution is dispensed into
the wells in order to detect specific antibodies during a subsequent
incubation. The enzymatic reaction is then stopped by adding a Stop
Solution which changes to yellow the blue colour developed into the
wells. The amount of colour is directly proportional to the specific IgA
anti-Helicobacter pylori concentration in the patient samples.
KIT COMPONENTS
Package size: 96 tests.
Component
SORB
CONTROL
-
A
Coated Strip
B
Negative Control
1 x 2 mL
1 x 2 mL
CAL
CO
C
Cut-off Calibrator
CONTROL
+
D
Positive Control
DIL
SPE
E
Sample Diluent BEIA System
BUF
WASH 20X
CONJ
SUBS
TMB
H2SO4
F
Wash Buffer
G
Conjugate
H
Substrate-TMB
I
Soluzione Stoppante
Istruzioni per l’uso
A.
B.
C.
12x8x1
1 x 2 mL
1 x 120 mL
1 x 100 mL
1 x 13,5 mL
1 x 13,5 mL
1 x 13,5 mL
1
Coated strips
Breakable strips coated with purified inactivated Helicobacter
pylori antigens, packed in sealed pouch. Place the unused strips in
the pouch and reseal.
Negative Control
Negative human serum for IgA antibodies anti-Helicobacter pylori.
Contains 0.09% w/w of Sodium azide as preservative. Ready to use
reagent.
Cut-off Calibrator
Human serum, containing IgA antibodies anti-Helicobacter with
known concentration. Contains 0.09% w/w of Sodium azide as
preservative. Ready to use reagent.
Pag. 15 - 24 BEIA Helicobacter pylori IgA Ed. 20/04/2013
D.
E.
F.
G.
H.
I.
Positive Control
Positive human serum for IgA antibodies anti-Helicobacter pylori.
Contains 0.09% w/w of Sodium azide as preservative. Ready to use
reagent.
Sample Diluent BEIA System
Buffered salt solution (PBS). Contains protein, 0,09 % w/w Sodium
azide and Tween 20. Ready to use reagent
Wash Buffer
Buffered salt solution (PBS) 20x concentrated. Contains 0,1 % di
Kathon CG and Tween 20. See “Preparation of reagents”.
Conjugate
Monoclonal anti-human IgA antibody conjugated with horseradish
peroxidase. Ready to use reagent.
Substrate-TMB
Tetramethylbenzidine H2O2/TMB in stabilizing buffered solution.
Contains pink dye. Ready to use reagent.
Stop Solution
1N Sulphuric acid solution.
Ready to use reagent.
STORAGE OF REAGENTS
Store all reagents at 2-8°C avoiding exposure to light. Do not use reagents
after the expiry date indicated on the label.
INTERCHANGEABLE REAGENTS
The Sample Diluent BEIA System, Wash Buffer, Substrate-TMB and Stop
Solution are common to all BEIA kits.
MATERIALS/EQUIPMENT REQUIRED BUT NOT PROVIDED





Microplate reader with 450/620 nm filters.
Manual or automated microplate washing device.
Precision pipettes with disposable tips 10,100,1000 L .
Disposable pipettes and normal glassware.
Distilled or deionised water.
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WARNINGS AND PRECAUTIONS









Bring all reagents to room temperature (18-25°C) before use. Only
take the quantity necessary for the assay.
Avoid wells drying.
Use clean glassware.
Use a clean disposable pipette tip for each reagent.
Use a clean disposable pipette tip for each sample.
If the Substrate-TMB shows a change from pink to blue colour,
discard the reagent.
For repeated assays, each time provide for new diluted samples.
Every analytical run should include control samples in order to
validate the results, according to criteria and procedures
established by each laboratory.
Periodical maintenance and calibration of pipettes and microplate
reader are required.
AUTOMATION
The test can be performed on automated ELISA processor. Please refer to
specific instrument manual for proper applications.
SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION
The test can be performed on serum or plasma (heparin – EDTA).
Specimens may be stored refrigerated at 2-8 °C up to 5 days. For longer
storage they should be aliquoted and stored frozen at – 20°C. Avoid
repeated thawing and freezing. Do not use haemolyzed, lipemic or turbid
specimens. All serum and plasma samples must be pre-diluted with
Sample Diluent BEIA System prior to assay. See assay protocol.
PREPARATION OF REAGENTS

Wash Buffer (20 X)
Dilute 1:20 the content of the Wash Buffer bottle with distilled or
deionised water. The diluted Wash Buffer is stable 15 days when stored
at 2-8 °C; in any case, do not use it after expiry date printed on the
original label. If crystallization occurs in the concentrated Wash Buffer,
Pag. 17 - 24 BEIA Helicobacter pylori IgA Ed. 20/04/2013
warm the solution to 37 °C before diluting. Only dilute the quantity
necessary for the assay.
WASHING CYCLES
Both using a microplate washer and washing the plate manually, perform
the following steps.
1.
Empty the wells
2.
Fill them with 300 µL of Wash Buffer.
3.
Empty the wells
4.
Repeat steps 2 and 3 for other 3 cycles
5.
Dry the rim of the wells with blotting paper at the end of the
washing cycles.
ASSAY PROTOCOL
Allow all reagents to reach room temperature leaving them at least 30-60
minutes at 18-25 °C.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
Dilute the samples to be assayed (1 :81) with the Sample Diluent
BEIA System (i.e. 10 µL of serum and 800 µL of Sample Diluent
BEIA System). Shake on Vortex.
Select the number of strips required for the assay according to the
number of samples to be assayed, Controls and the Calibrator
Cut-off (see paragraph “Summary of protocol” below). Reseal the
pouch.
Dispense 100 µL of Negative and Positive controls, Calibrator Cutoff and of the diluted samples.
Incubate the plate at room temperature (18-25 °C) for 30 minutes.
Perform a washing cycle following the suggested procedure (see
Washing Cycles).
Dispense 100 µL of Conjugate in each well.
Incubate the plate at room temperature (18-25 °C) for 30 minutes.
Perform a washing cycle following the suggested procedure (see
Washing Cycles).
Dispense 100 µL of Substrate-TMB in each well .
Incubate the plate at room temperature (18-25 °C) for 15 minutes.
Stop the chromogenic reaction dispensing 100 µL of Stop Solution
into each well.
Read the optical density in bi-chromatism at 450/620 nm.
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CALCULATION AND INTERPRETATION OF RESULTS
RUN VALIDATION CRITERIA
Criteria used to validate the obtained results are the following:

The ratio of the OD for Positive Control to the OD for the Calibrator
Cut-off must be > 1.5

The ratio of the OD for Negative Control to the OD for the
Calibrator Cut-off must be < 0.3
If the above criteria are not met, the run is invalid and the results cannot
be reported without a documented critical review of the data.
The non conformity must be addressed and treated according to each
laboratory’s Quality Assurance procedures. Each lab should establish and
follow its own internal Quality Control procedures and use the QC
results to validate runs and manage non conformities.
CALCULATION OF RESULTS
In order to correlate the analytical results to the immunity of the sample
results should be determined calculating the antibody index (A.I.) using
the following formula:
O.D. sample
__________________________________________
Antibody Index (A. I.) =
O.D. Cut-off Calibrator
For the Cut-off Calibrator calculate, if assayed in duplicate, the mean OD
value (mOD).
The data below show typical results for the test. These data are intended
as an example only and should not be used to calculate results from
another run.
Negative Control
1st O.D.
0.125
2nd O.D.
0.081
mO.D.
0.103
A.I.
0.20
Cut-off Calibrator
0.511
0.503
0.507
Positive Control
1.095
1.072
1.083
Sample A
0.170
0.34
Sample B
0.710
1.40
Sample C
1.058
2.09
2.14
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INTERPRETATION OF RESULTS
Results from our clinical trials, performed on samples representative of
the European population, suggest the following interpretative criteria:
A.I.
> 1.1
< 0.9
0.9  1.1
INTERPRETATION
Sample should be considered POSITIVE for the
presence of anti-Helicobacter pylori IgA antibodies.
Sample should be considered NEGATIVE for the
presence of anti-Helicobacter pylori IgA antibodies.
GREY ZONE: Sample should be considered
BORDERLINE for the presence of anti-Helicobacter
pylori IgA antibodies.
Please consider that:
- the test only detects specific IgA antibodies. It cannot per se and
univocally be referred to as evidence of infection;
- a medical decision cannot be made on the basis of a single test result but
should be grounded on all the available clinical data; discrepancies in
clinical data should be clarified prior to final decisions, also, if necessary,
by confirmatory or 2nd level tests;
- results within grey zone should be made clear: re-testing the same
sample; testing a sample from another collection from the same patient;
comparing the results with those of a reference test.
PERFORMANCE DATA
Warning: Data below do not represent the performance specifications of
the kit, but only experimental evidence that the performance of the kit is
within such specifications, as intended by the manufacturer.
SPECIFICITY AND SENSITIVITY
The diagnostic sensitivity and specificity were evaluated comparing the
BEIA Helicobacter pylori IgA results versus an established EIA
commercial kit (EIA Helicobacter pylori IgA) with acceptable
performances.
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BEIA Helicobacter p.
IgA
+
-
EIA Helicobacter p. IgA
+
48
11
7
121
From which the following table can be calculated:
Relative Sensitivity
Relative Specificity
Agreement
87.3%
91.7%
90.4%
ANALYTICAL SPECIFICITY
No interference has been observed in samples with haemoglobin up to 10
mg/mL, bilirubin up to 1 mg/mL, triolein up to 30 mg/mL. Lipemic,
turbid or hemolyzed samples, however, should not be
used.
REPEATABILITY
The within-run and run-to-run variability were determined using one
negative sample with A.I. < 0.5 and two positive samples, containing
value of A.I. about : 1.5 and 2.0. These samples were tested 6 times per
single run in 12 different analytical runs for the within-run and 1 time per
single run in 12 different analytical runs for the run-to-run. Coefficients
of variation lower than 15% have been obtained for the negative sample
and 10% for the two positive samples.
LIMITATIONS
Bacterial contamination or repeated freeze-thaw cycles of specimens may
affect the detectable levels of specific IgA.
GENERAL DIRECTIONS FOR A SAFE USE





Keep the laboratory clean and tidy and strictly follow the
procedural directions.
Do not eat, drink, smoke or apply cosmetics in a clinical lab.
Do not pipette solutions or samples by mouth.
Wear disposable gloves and overalls when handling reagents and
samples. Avoid direct contact.
Wash hands thoroughly after assay.
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

Thoroughly clean working area with proper detergent solutions.
Collect solid and liquid waste material in proper containers and
provide for disposal according to the local regulations.

Periodically check contamination level of operators and rooms.
Reagents containing serum

All components of human origin have been tested and found
negative for HbsAg, anti-HCV and anti-HIV antibodies. Since no
known test can guarantee, however, that products derived from
human blood will not transmit Hepatitis, AIDS or other infectious
diseases, these reagents should be handled as hazardous material.
Hazardous Reagents

Stop Solution (Council Directive 88/379/EEC)
R36/38
Irritating to eyes and skin.
S26
In case of contact with eyes, rinse immediately with
plenty of water, and seek for medical advice.
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SUMMARY OF PROTOCOL












A
B
C
D
E
F
G
H
Prepare reagents and take them to room temperature.
Pre-dilute samples 1:81 with Sample Diluent BEIA System
Dispense:
100L of Negative Control in single or duplicate
100L of Cut-off Calibrator in duplicate
100L of Positive Control in single or duplicate
100L of pre-diluted samples in single or duplicate
Incubate 30 minutes at R.T. (18-25°C)
Perform 4 washing cycles
Dispense 100 L of Conjugate
Incubate 30 minutes at R.T. (18-25°C)
Perform 4 washing cycles
Dispense 100 L of Substrate-TMB
Incubate 15 minutes at R.T. (18-25°C)
Dispense 100 L of Stop Solution
Read the O.D. at 450/620nm
1
NC
NC
CCO
CCO
PC
PC
P1
P2
2
P3
P4
P5
…
…
…
…
…
3
4
…
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REFERENCE - BIBLIOGRAFIA
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