METODO NAZIONALE STANDARD
CONTEGGIO DI SPECIE
AEROMONAS CON
MEMBRANA DI FILTRAZIONE
W9
Emesso da Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory
Specialist and Reference Microbiology Division
CONTEGGIO DI SPECIE AEROMONAS CON MEMBRANA DI FILTRAZIONE
Revisione no: 1.3 Data di revisione: 03.05.05 Emesso da Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory, in collaborazione con il Water
Working Group and the Environmental Surveillance Unit, CDSC.
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STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD
I Metodi Nazionali Standard, che includono le procedure operative standard (POS) algoritmi e linee guida,
promuovono l’adozione di elevati livelli di qualità, contribuendo ad assicurare la possibilità di confronto delle
informazioni diagnostiche ottenute in laboratori diversi. Ciò consente la standardizzazione della sorveglianza
sostenuta dalla ricerca, sviluppo e verifica, promovendo nello stesso tempo la salute pubblica e la fiducia del
paziente nelle proprie strutture sanitarie. I metodi sono ben referenziati e rappresentano un buon standard minimo
per la microbiologia clinica e per la salute pubblica. Comunque, utilizzando i Metodi Nazionali Standard, i
laboratori dovranno tenere in considerazione le esigenze locali e potranno intraprendere ricerche addizionali. I
metodi forniscono inoltre un punto di riferimento per un loro ulteriore sviluppo.
I Metodi Nazionali Standard sono stati sviluppati, revisionati ed aggiornati con una procedura aperta di consenso
ove le opinioni di tutti i partecipanti sono state tenute in adeguata considerazione ed i documenti elaborati
riflettono il consenso della maggior parte degli stessi.
I rappresentanti di alcune organizzazioni professionali, incluse quelle il cui logo appare sulla prima pagina, sono
membri dei gruppi di lavoro che sviluppano i Metodi Nazionali Standard. L’inclusione del logo di una
organizzazione nella prima pagina implica sostegno agli obiettivi ed al processo di preparazione dei metodi
standard. I componenti di queste organizzazioni scientifiche hanno partecipato allo sviluppo dei Metodi Nazionali
Standard ma le loro opinioni personali non rispecchiano necessariamente quelle dell’organizzazione di cui sono
membri. L’elenco attuale delle organizzazioni professionali partecipanti può essere ottenuto tramite e-mail
all’indirizzo [email protected].
Le prestazioni dei metodi standard sono condizionate dalla qualità di reagenti, strumentazione, procedure
commerciali o prove messe a punto in loco. I laboratori dovrebbero assicurare che queste siano state validate e
dimostrate idonee allo scopo prefissato. Devono essere adottate procedure di controllo di qualità interno ed
esterno.
Nonostante siano state osservate le più scrupolose attenzioni nella preparazione di questa pubblicazione, la
Health Protection Agency o qualsiasi organizzazione di sostegno non può essere ritenuta responsabile
dell’accuratezza o dell’utilizzo o di qualsiasi conseguenza derivante dall’uso o da modifiche delle informazioni
contenute in questo documento. Queste procedure sono intese solamente come una risorsa generale per i
professionisti che esercitano in questo settore, operanti nel Regno Unito, pertanto si dovrà ricorrere ad altri
consulenti quando ritenuto necessario. Se si apportano modifiche a questa pubblicazione, si deve porre in
evidenza dove sono state apportate modifiche al documento originale. La Health Protection Agency (HPA) dovrà
essere informata in ogni circostanza.
La HPA è una organizzazione indipendente che ha lo scopo di proteggere la salute della popolazione. Ad essa
confluiscono esperienze professionali già appartenenti ad organizzazioni ufficiali. Maggiori informazioni riferibili
alla HPA possono essere ottenute al sito www.hpa.org.uk
La HPA è un’organizzazione che mira ad essere completamente in accordo con le direttive Caldicott. Ciò significa
prendere ogni possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui pazienti e di
garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza1.
Maggiori dettagli possono essere ottenuti dal sito web www.evaluations-standards.org.uk. Contributi allo sviluppo
dei documenti possono essere forniti contattando l’indirizzo [email protected].
Per cortesia prendere nota che la bibliografia è attualmente formattata con il software Reference Manager. Se
si modifica o si cancella il testo senza avere installato nel computer il Reference Manager; la bibliografia non
sarà aggiornata automaticamente
Riferimento suggerito per questo documento:
Health Protection Agency (2004). Enumeration of Aeromonas species by Membrane Filtration.National Standard
Method W 9 Emissione 1. http://www.hpa-standardmethods.org.uk/pdf_sops.asp.
CONTEGGIO DI SPECIE AEROMONAS CON MEMBRANA DI FILTRAZIONE
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INDICE
STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD ...............................................................................................
2
INDICE ..............................................................................................................................................................
3
PROCEDURA DI MODIFICA ............................................................................................................................
4
INTRODUZIONE ..............................................................................................................................................
5
SCOPO ………………………………………………………………………………………………………………
GENERALITA’ ………………………………………………………………..………………………………………
5
5
1.0
DEFINIZIONI ..........................................................................................................................................
6
2.0
PRINCIPIO ............................................................................................................................................
6
3.0
CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA ..............................................................................................
6
3.1 PRELIEVO DEL CAMPIONE ……………………………………………………………………………………..
3.2 TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE ……………………………………………………………..
3.3 PROCEDURA SUL CAMPIONE …………………………………………………………………………………..
6
6
6
4.0
ATTREZZATURA ..................................................................................................................................
6
5.0
TERRENI DI COLTURA ..........................................................................................................................
7
6.0
METODO .................................................................................................................................................
8
6.1 PREPARAZIONE DEL CAMPIONE ………………………………………………………………………………….
6.2 FILTRAZIONE ED INCUBAZIONE …………………………………………………………………………………
6.3 CONTEGGIO DELLE COLONIE ……………………………………………………….…………………………..
8
9
9
7.0
CONTROLLO DI QUALITA’ .................................................................................................................... 10
7.1 MEMBRANA DI FILTRAZIONE …………………………………………………………………………………….. 10
7.2 CONTROLLO DELLE COLTURE PER AAD ………………………………………………………………………... 10
7.3 CONTROLLO COLTURE PER PROVE DI CONFERMA ……………………………………………………………. 10
8.0
CALCOLO DEI RISULTATI ................................................................................................................. 11
9.0
REFERTAZIONE DEI RISULTATI ....................................................................................................... 11
DIAGRAMMA DI FLUSSO CHE ILLUSTRA LA PROCEDURA PER IL CONTEGGIO DI AEROMONAS
CON MEMBRANA DI FILTRAZIONE .............................................................................................................. 12
BIBLIOGRAFIA ................................................................................................................................................. 13
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PROCEDURA DI MODIFICA
Documento di riferimento
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controllato
Titolo del documento controllato Procedura Operativa Standard per il Conteggio di specie Aeromonas
con membrana di filtrazione
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questa revisione sono riportate in questa pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la
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Qualora vi sia una revisione di pagine o vengano emesse pagine nuove il proprietario di ciascun documento
controllato dovrebbe aggiornare la copia in laboratorio.
Modifica
Numero/
Data
5/
03.05.05
Emissione no.
Scartata
1,2
Inserita
Emissione
no.
1.3
Pagina
Sessione(i)
interessate
Modifica
1
Prima pagina
Modificata
2
Stato del
documento
Revisionato
4
Pagina della
procedura di
modifica
Ridisegnata
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PROCEDURA OPERATIVA STANDARD PER
LA RICERCA DI SPECIE AEROMONAS CON
MEMBRANA DI FILTRAZIONE
INTRODUZIONE
Scopo
Il presente metodo è idoneo all’isolamento ed alla ricerca di specie Aeromonas in campioni di acqua potabile,
acque di piscina ed acque di superficie, tranne quelle ad elevata torbidità che possono intasare la membrana.
Generalità
La tassonomia del genere Aeromonas è ancora oggetto di estese ricerche. Possono essere identificate con
tecniche molecolari almeno 13 specie. Non è possibile identificare modo accurato queste specie con prove
biochimiche e la maggior parte degli isolati può essere generalmente suddivisa in tre gruppi: Aeromonas
hydrophila, Aeromonas caviae, Aeromonas veronii biotipo sobria. Tutte le specie Aeromonas possono essere
considerate importanti, pertanto non è necessario identificare oltre il livello di genere.
Per l’isolamento delle specie Aeromonas sono stati sviluppati numerosi terreni, molti dei quali contengono
ampicillina come agente selettivo. L’uso dell’agar ampicillina – destrina (AAD)1 e raccomandato in questa POS. E’
essenzialmente identico all’agar mA2 tranne che quest’ultimo è stato formulato in modo più specifico con la
sostituzione della destrina con il trealosio. Alcune specie Vibrio possono crescere anche sull’AAD e produrre
reazioni simili a quelle delle specie Aeromonas. Se i campioni possono verosimilmente contenere specie Vibrio,
come le acque degli estuari, l’AAD può allora essere reso più selettivo con l’aggiunta di 50 mg/L di fosfato O129.
Il metodo descritto si basa su quello presentato nel documento della Microbiology of Drinking Water 20023.
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1.0 DEFINIZIONI
Per le finalità di questo metodo, sono identificati come Aeromonas ceppi ossidasi-positivi, resistenti
all’ampicillina (10 mg/L) e che fermentano destrina e mannitolo. Sono inoltre Gram-negativi, fermentano
nella prova di Hugh e Leifson (H/L)4, crescono in acqua triptonata 1% senza cloruro di sodio, ma non nello
stesso terreno contenente 6% di cloruro di sodio, sono resistenti all’O129 (2,4-diamino-6,7 diisopropil
pteridina) fosfato (50 mg/L) ed idrolizzano l’arginina5.
2.0 PRINCIPO
Il conteggio delle specie Aeromonas implica la filtrazione con membrana del volume di acqua in esame, e
l’isolamento del microrganismo. Trasferire poi la membrana su terreno di agar contenente ampicillina
come composto selettivo, destrina come carboidrato fermentabile, blu di bromotimolo come indicatore di
sviluppo di acidità. Gli isolati sospetti sono posti in sottocoltura e la loro identificazione è confermata con
le prove elencate nella sezione 1, e descritte nella sezione 6.3.1.
6-15
3.0 CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA
Adottare le normali precauzioni del laboratorio di microbiologia.
3.1
Prelievo dei campioni
N/D
3.2
Trasporto e conservazione dei campioni
E’ essenziale l’osservanza delle attuali regolamentazioni postali e di trasporto.
3.3
Procedura sul campione
!
Deve essere posta attenzione alla rimozione degli oggetti dai bagni di bollitura dopo disinfezione
Le linee guida precedentemente esplicitate devono essere supplementate con la COSHH locale e
con la valutazione del rischio
4.0 ATTREZZATURA
Normale attrezzatura di laboratorio ed aggiungere:
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
Membrane di filtrazione di tipo diverso
Imbuti da filtro graduati da 50 mL a 100 mL
Recipienti di pirex per il vuoto con rivestimento protettivo ( capacità > 5L o equivalenti contenitori di
plastica a pressione
Pompa a vuoto, con raccoglitore di umidità e filtro protettivo, o sorgente alternativa di vuoto
Pinze di acciaio inossidabile a punta piatta
Bagno per bollitura (strumento di sterilizzazione)
Termostato: 30°C "#1.0°C
Piastre di Petri
Membrane filtranti –di estere di cellulosa, 0.45 $m, 47 mm di diametro, con griglia
Pipettatori automatici e punte di pipette sterili per la distribuzione di 1-10 mL (opzionale)
Pipette (sterili a distribuzione totale) da 10 mL ed 1 mL graduate per volumi da 0.1 mL (opzionale)
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5.0 TERRENI DI COLTURA
Si possono utilizzare terreni disidratati pronti all’uso disponibili in commercio con formulazione
equivalente. Seguire le indicazioni della ditta produttrice.
Diluente peptone salino (Diluente di massimo riscontro)
Peptone
Cloruro di sodio
Acqua
pH 7.0 ± 0.2 a 25°C
1.0 g
8.5 g
1L
Soluzione di Ringer a un quarto di concentrazione
Cloruro di sodio
Cloruro di potassio
Calcio cloruro, anidro
Bicarbonato di sodio
Acqua
2.25 g
0.11 g
0.12 g
0.05 g
1L
Agar ampicillina destrina (AAD) (preparazione recente)
Triptosio
Destrina
Estratto di lievito
Cloruro di sodio
Cloruro di potassio
Solfato di magnesio
eptaidrato
Cloruro ferrico
Blu di bromotimolo
Sodio desossicolato
Ampicillina
2-4 diamino 6,7 isopropil pteridina
(O129) fosfato (opzionale)
Agar
Acqua
pH 8.0 ± 0.2 a 25°C
5.0 g
10.0 g
2.0 g
3.0 g
2.0 g
0.2 g
0.1 g
0.08 g
0.1 g
0.01 g
50.0 mg
15.0 g
1L
Agar nutriente (o equivalente)
Estratto di carne
Peptone
Cloruro di sodio
Agar
Acqua
pH 7.5 ± 0.2 a 25°C
10.0 g
10.0 g
5.0 g
15.0 g
1L
Reagente ossidasi (Preparazione recente o usare un prodotto commerciale equivalente)
Tetrametil-p-Parafenilendiamina
cloridrato
Acqua
0.1 g
10.0 mL
Terreno per utilizzazione carboidrati
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Peptone
Estratto di manzo (opzionale)
Cloruro di sodio
Rosso fenolo
Mannitolo (sterilizzato per filtrazione)
Acqua distillata
pH 7.4 ± 0.1
10.0 g
1.0 g
5.0 g
0.018 g
1.0 g
1L
Terreno di Hugh e Leifson H/L
Peptone
Cloruro di sodio
Potassio fosfato monoacido
Blu di bromotimolo
Glucosio
Agar
Acqua
pH 7.1 ± 0.2 a 25°C
2.0 g
5.0 g
0.3 g
0.03 g
10.0 g
3.0 g
1L
Acqua triptonata 1%
Triptone
Acqua distillata
10.0 g
1L
Acqua triptonata 1% con 6% di cloruro di sodio
Triptone
Cloruro di sodio
Acqua distillata
10.0 g
60.0 g
1L
Composto vibriostatico (opzionale)
2-4 diamino 6,7 isopropil pteridina
(O129) fosfato (opzionale)
50.0 mg
Terreno di prova arginina
Peptone
Cloruro di sodio
K2HPO4
Agar
Rosso fenolo
L(+)Arginina HCl
Acqua distillata
pH 7.2 ± 0.1
0.1 g
0.5 g
0.03 g
0.3 g
0.001 g
1.0 g
100.0 mL
Confezioni commerciali per prove biochimiche (opzionale)
6.0
6.1
METODO
Preparazione del campione e diluizioni
I campioni idrici devono essere ricevuti e manipolati come descritto nella SOP: W 1 Sezione 5. La
tipologia della richiesta e le condizioni del campione devono essere registrate all’accettazione. Proteggere
i campioni dalla luce solare diretta e trasportare in contenitore isolato o refrigerato a 2° - 10°C. I campioni
devono essere analizzati il più presto possibile, nel giorno del prelievo. In circostanze eccezionali, se si
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verifica un ritardo, la conservazione non deve prolungarsi oltre le 24 ore prima dell’inizio delle analisi,
nelle condizioni indicate in precedenza.
Seguire queste procedure e selezionare volumi idonei per le analisi e le diluizioni richieste.
6.2
Filtrazione ed incubazione
Seguire le procedure descritte nella SOP 1 sezione 5; filtrare con membrana un determinato volume del
campione di prova. Per acque di qualità potabile utilizzare volumi di 100 mL e per altri tipi di acque
utilizzare 100 mL o volumi minori.
Trasferire la membrana su agar ampicillina destrosio (AAD) ed incubare a 30 ± 1°C per 22 ± 2 ore.
6.3
Conteggio colonie
Dopo incubazione, contare tutte le colonie di colore giallo, o con margine periferico giallo o gialloverdastro. Non contare le colonie completamente blu o bianche traslucide.
6.3.1
Prove di conferma
Utilizzare le procedure descritte nella SOP 1 sezione 5; selezionare per la conferma un certo numero di
colonie presunte positive per Aeromonas.
Prova dell’ossidasi
Eseguire la prova dell’ossidasi su colonie cresciute su piastre di agar nutriente. Immergere un tampone
nel reagente ossidasi e toccare la superficie della colonia da saggiare. La comparsa immediata di un
colore porpora scuro nel punto di contatto denota la positività della reazione. Colore non modificato o
comparsa di colore porpora in un tempo successivo sono entrambi espressione di reazione negativa.
In modo alternativo, inumidire un pezzo di carta da filtro con 2 – 3 gocce di reagente ossidasi, posto in
una scatola di Petri. Utilizzare un bastoncino di legno, di vetro o un’ansa di platino (non di nichelcromo) e
trasferire una colonia del microrganismo ricercato su carta da filtro e strofinarla sull’area inumidita. La
reazione positiva è indicata dalla comparsa di un colore porpora scuro entro 10 secondi.
Le specie sospette per Aeromonas sono ossidasi positive. Alcune specie Vibrio possono comunque
sviluppare reazioni simili.
Fermentazione del mannitolo
Incubare una provetta di terreno per l’utilizzazione dei carboidrati con una parte dei microrganismi in
prova. Incubare a 30 ± 1°C per 24 ore – 7 giorni. Verificare la torbidità del terreno liquido, indice di
crescita del microrganismo saggiato. Registrare il colore della sospensione di prova. La fermentazione
positiva si manifesta con un cambiamento del colore del terreno da rosso a giallo.
Prova di fermentazione
Utilizzare un’ansa diritta, sfiorare una colonia rappresentativa a trasferirne una parte in un settore di agar
nutriente contrassegnato in precedenza. Utilizzare lo stesso inoculo ed inserire l’ansa al fondo di una
provetta con terreno di H/L. Ritornare nel settore di agar nutriente inoculato in precedenza e diffondere la
semina con l’ansa. Al termine dell’incubazione questa piastra sarà utilizzata per la prova dell’ossidasi.
Ricoprire la provetta seminata di H/L con uno strato di paraffina liquida (petrolato4) ed incubare le piastre
a 30 ± 1°C per 22 ± 2 ore.
Controllo della provetta di H/L per la reazione di fermentazione.
Le specie sospette di Aeromonas producono reazione di tipo fermentativo nel terreno di H/L. Questa si
manifesta con un cambiamento del colore all’interno della provetta da blu a giallo. Se non si sviluppa
colore o il colore si modifica appena sotto lo strato di paraffina la reazione di fermentazione è negativa.
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Crescita in acqua triptonata 1%
Inoculare 10 $l di una coltura di 3 – 5 ore di Aeromonas sospetta in una provetta di (a) acqua triptonata
1% priva di cloruro di sodio, e (b) acqua triptonata 1% contenente cloruro di sodio 6%. Incubare le
provette a 30°C ± 1°C ed esaminare dopo 24 e 48 ore. La crescita si manifesta con torbidità dell’acqua
triptonata. Le specie Aeromonas crescono nell’acqua triptonata 1% priva di cloruro di sodio, ma non in
acqua triptonata 1% contenete cloruro di sodio al 6%.
Resistenza all’O129
Preparare una semina uniforme su una piastra di agar nutriente. Trasferire un disco con 150 $g di O129
su di essa ed incubare a 30°C ± 1°C per 22 ± 2 ore. Le specie Aeromonas sono resistenti a 150 $g di
O129 e pertanto, attorno al disco, non producono una zona d’inibizione.
Idrolisi dell’arginina
Utilizzare un’ansa diritta, sfiorare una colonia rappresentativa ed inoculare il fondo di una provetta di
terreno contenente arginina. Incubare a 30°C ± 1°C e leggere ogni giorno fino a 5 giorni. Le specie
Aeromonas sono positive per idrolisi dell’arginina. La reazione positiva si manifesta con cambiamento di
colore dell’indicatore rosso fenolo.
Per le prove di conferma possono essere usate anche le confezioni commerciali disponibili.
7.0 CONTROLLO DI QUALITA’
7.1
Membrana di filtrazione
Quando si utilizza la tecnica di filtrazione con membrana devono essere eseguite le procedure per il
controllo di qualità interno almeno una volta al mese. Se in una sessione analitica si utilizza più di un lotto
di terreno, è necessario ripetere il controllo di qualità su ciascun lotto.
I controlli di qualità interni qualitativi sono eseguiti utilizzando sospensioni di microrganismi di controllo
positivi e negativi, noti per contenere meno di 100 unità formanti colonia per il volume filtrato.
7.2
Controllo delle colture per AAD
Controllo positivo
Aeromonas hydrophila NCTC 8049
Controllo negativo
Escherichia coli NCTC 9001
Preparare sospensioni dei microrganismi di controllo positivo e negativo. Eseguire le prove assieme a
quelle di routine.
Filtrare 100 mL di acqua distillata sterile o di diluente peptone salino con lo stesso imbuto usato per il
controllo positivo dopo la sua sterilizzazione.
Incubare tutte le prove dei controlli di qualità in modo contemporaneo a quelle dei campioni di routine,
eseguire le prove di conferma e determinare i conteggi.
7.3
Controllo colture per prove di conferma
Controllo positivo:
Aeromonas hydrophila NCTC 8049
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Controllo negativo:
Vibrio furnissii NCTC 11218
Processare in modo contemporaneo a quelle dei campioni di routine utilizzando le prove descritte nella
sezione 6.3.1.
8.0 CALCOLO DEI RISULTATI
Calcolare i conteggi delle specie di Aeromonas sospette in 100 mL nel modo seguente:
Numero presunto = No. colonie conteggiate x 100
Volume saggiato
Calcolare il numero delle specie di Aeromonas confermate in 100 mL di campione originale utilizzando la
procedura descritta nella SOP 1 sezione 7.
9.0 REFERTAZIONE RISULTATI
Refertare i risultati secondo le procedure descritte nella SOP 1: W 1 Sezione 9.
Se non sono riscontrate specie Aeromonas, refertare nel modo seguente:
“Specie Aeromonas non riscontrate in 100 mL di acqua”
Se sono state isolate specie Aeromonas, refertare nel modo seguente:
“a in 100 mL”
ove a è il numero confermato
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Diagramma di flusso che illustra il conteggio di specie Aeromonas con membrana di filtrazione
Trasportare in laboratorio a 2°C –10° C senza esporre alla luce solare diretta
Ø
Analizzare i campioni il più presto possibile, nel giorno del prelievo, altrimenti
entro 24 ore dal prelievo
Ø
Miscelare il campione in modo adeguato e preparare le diluizioni necessarie
Ø
Filtrare
Ø
ҏ
Trasferire la membrana su agar ampicillina destrosio
Ø
Incubare a 30° Cr1° C per 22r2 ore le colonie gialle (includendo quelle con parte periferica
gialla- verdastra)
Ø
Eseguire le prove di conferma
Ø
Calcolare i conteggi confermati delle specie Aeromonas
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BIBLIOGRAFIA
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Havelaar AH, During M, Versteegh JFM. Ampicillin- dextrin agar medium for the enumeration
of
Aeromonas species in water by membrane filtration. J Appl Bacteriol 1987;62:279-87
2
Rippey SR, Cabelli VJ. Membrane filter procedure for enumeration of Aeromonas hydrophila
in
fresh waters. Appl and Environ Microbiol 1979;38:108-13
3
Standing Committee of Analysts. The Microbiology of Drinking Water (2002). Methods for the
Examination of Waters and Associated Materials. Part 8: Methods for the isolation and
enumeration
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CONTEGGIO DI SPECIE AEROMONAS CON MEMBRANA DI FILTRAZIONE
Revisione no: 1.3 Data di revisione: 03.05.05 Emesso da Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory, in collaborazione con il Water
Working Group and the Environmental Surveillance Unit, CDSC.
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Riferimento no: W 9i1.3
Questa POS deve essere usata congiuntamente con le altre POS emesse dalla Health Protection Agency
www.evaluations-standards.org.uk
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