Trasformazione di cellule
competenti con DNA plasmidico
Metti il DNA e le cellule insieme
Fai qualcosa di speciale
Scatola nera
Poi succede qualcosa …….
Trasformazione batterica
Uptake of DNA nudo, spesso un plasmide circolare
Cell wall
GFP
Bacterial
chromosomal DNA
pGLO plasmids
Beta lactamase
(ampicillin resistance)
Metodi di trasformazione
• Elettroporazione
– shock elettrico che rende le
membrane cellulari permeabili al
DNA(si usa anche per le lellule
eucariotiche)
• Calcio cloruro/Heat Shock
– Cellule, rese competenti
chimicamente, incorporano DNA nudo
dopo heat shock
Ruolo del CaCl2 per rendere le
cellule competenti
• CaCl2 genera buchi nella membrana dei
batteri rendendoli capaci di incorporare
DNA
Ruolo del CaCl2 per rendere le
cellule competenti- cont
Ca++
O
Ca++
O P O
Base
O
 Gli ioni of
carichi
positivamente
mascherano le cariche
negative dei gruppi
fosfato presenti nel
DNA
O
CH2
Ca+2
Sugar
O
Ca++
O P O
Base
O
CH2
O
Sugar
OH
Attenzione!!!!
• CaCl2 rende le cellule più fragili
• Delicatezza (ghiaccio e pipettata
gentile)
Trasformazione di cellule
competenti con DNA plasmidico
Metti il DNA e le cellule insieme
45 minuti
in ghiaccio
Il DNA aderisce ai batteri
Shock termico
42 °C per 2 min
Il DNA entra nei batteri
Trasformazione di cellule competenti
con DNA plasmidico - cont
Periodo di recupero a 37 °C in presenza di terreno che
permette la replicazione del DNA plasmidico
nelle cellule in cui è entrato
1 ora a 37 °C
Questo periodo permette alle cellule di esprimere
il gene di resistenza all’ antibiotico
(ampicillina) e di potere
replicare successivamente sulle piastre
Controlli della
Trasformazione
Spread plate
Spread plate
Spread plate
• Piastre rigorosamente asciutte
• MAI piastrare più di 300 µl o MENO di
50 µl
• Raffreddare bene la bacchetta di vetro
• Lasciare asciugare prima di spostare le
piastre
• Le piastre danno conteggi affidabili solo
se il numero di colonie é tra 30 e 500
Finalmente….
Se non avete la disponibilità di un
incubatore a 37 °C potete
lasciare le piastre sul banco.
Vedrete le colonie dopo 2 3 giorni.
EFFICIENZA DI
TRASFORMAZIONE
Colony Forming Unit (CFU)/µg DNA
• Calcolre i µg totali di DNA usati
• Calcolare il fattore di diluizione della piastratura (se
é stata fatta)
• Contare le colonie
• Moltiplicare il numero di colonie per la
diluizione di piastratura
• Dividere per i ng di DNA utilizzato
• Efficienza di trasformazione (CFU/g)= n°colonie
g DNA