Istituto tecnico industriale “E.
Divini”
anno scolastico 2004/2005
Specializzazione Chimica
Broglia Alessandro
• ANALISI DELLA FRAZIONE INSAPONIFICABILE DELL’OLIO
• STUDIO DEI PIGMENTI COLORATI
• TECNICA HPLC
FORSE NON TUTTI SANNO CHE …
L’olio di oliva non solo rende saporiti e gustosi i nostri piatti,ma è
un componente essenziale della dieta mediterranea e tra i prodotti
più ricercati sui mercati di tutto il mondo.
Ma c’è di più … la pianta dell’ulivo ha origini antichissime e tutte le
civiltà mediterranee le attribuivano un valore sacro: Omero la
chiamava “ oro liquido”; gli Egizi ne facevano dono votivo alla dea
Iside; i Greci la ritenevano sacra a Minerva e ne facevano corone
per gli eroi delle Olimpiadi;i Romani se ne servivano per insignire i
cittadini meritevoli; i Cristiani ne fecero il simbolo della pace e
dell’amore.
Oggi, grazie alla ricerca scientifica e alla sperimentazione, se ne apprezza l’
inestimabile valore terapeutico per le sue svariate e preziosissime proprietà.
COMPOSIZIONE DELL’OLIO D’OLIVA
L’olio di oliva, al pari di tutti gli oli vegetali, è composto da:
• FRAZIONE SAPONIFICABILE:costituisce la quasi totalità del prodotto 99%.
Risulta formata da acidi grassi saturi o insaturi,
variabili a seconda delle regioni di provenienza.
• FRAZIONE INSAPONIFICABILE: è la frazione estraibile con etere di petrolio
dopo saponificazione della sostanza grassa
con potassa alcolica.
FRAZIONE SAPONIFICABILE
Costituisce la quasi totalità del prodotto (99%). Risulta formata da acidi grassi
saturi o insaturi, variabili a seconda della regione di provenienza.
In linea generale esiste una maggior percentuale dell’acido oleico, monoinsaturo.
O
H3C
(CH2)7
C
H
Acido oleico
H
C
C
(CH2)7 OH
A. 9-ottadecenoico
FRAZIONE INSAPONIFICABILE
Si intende quella frazione estraibile con etere di petrolio dopo
saponificazione della sostanza grassa con potassa alcolica.
Caratteristiche:
• Organolettiche dell’olio d’oliva (profumi,aromi,odori).
• Capacità antiossidante
• Maggiore possibilità di rilevare frodi
Componenti:
Idrocarburi
Costituiscono il 30-50% della frazione insaponificabile. Tra i più
rappresentativi vi è lo squalene: terpene costituito da sei unità
isopreniche.
H
H2C
C
C
CH2
CH3
Isoprene C5H8
Squalene
C30H50
Alcoli
Coprono dal 20 al 35% della frazione e sono molecole generalmente volatili,
dotate di odore, cioè in grado di stimolare le terminazioni olfattive.
Si suddividono in:
ALCOLI TRITERPENICI: costituiscono la maggiore parte della frazione alcolica
nell’insaponificabile.
ALCOLI ALIFATICI:a questi, ed ai prodotti che da loro possono originarsi, si
deve gran parte del profumo dell’olio.
ALCOLI BITERPENICI:sono presi a riferimento per scoprire frodi. La loro
concentrazione risulta notevolmente più elevata negli oli di oliva di estrazione
rispetto ad altri oli che li contengono (oli di oliva di pressione).
CH2OH
CH2OH
HO
HO
Eritrodiolo
Uvaolo
VITAMINE
LIPOSOLUBILI
La vitamina maggiormente presente negli oli di oliva è la vitamina E (23%). Dotata di spiccata capacità antiossidante e di alti valori energetici,è
facilmente degradabile.
R
HO
CH3
R'
O
R''
CH3
vitamina E
CH3
CH3
CH3
Polifenoli
Costituiscono il 18-36% della frazione insaponificabile. Sono molecole in cui
compaiono più nuclei fenolici legati a radicali di varia natura. Posseggono tutti
una spiccata capacità antiossidante, ma l’abbassamento di essi causa la scarsa
conservabilità dell’olio proveniente da olive lacerate o da olive colpite dalla
mosca olearia.
Steroli:
Sono composti policiclici aventi quattro anelli condensati: tre sono nuclei
cicloesanici ed uno ciclopentanico. Sono presenti in quasi tutti gli organismi
viventi ed in alcune specie (gli animali per esempio) svolgono funzione ormonale.
26
21
12
11
2
9
10
3
8
5
4
16
14
H
15
H
7
6
22
H
17
H
19
1
13
23
20
18
colestano
25
24
27
PIGMENTI COLORATI
I composti che impartiscono le colorazioni agli oli di oliva appartengono
essenzialmente a due famiglie:
Carotenoidi
Clorofilla
Carotenoidi
Sono idrocarburi insaturi responsabili del colore giallo.
La loro struttura è caratterizzata da un sistema tipico di doppi legami coniugati,
disposti in una catena alifatica che deriva dalla condensazione di un numero
variabile di unità isopreniche.
Vengono suddivisi in quattro categorie: caroteni, carotenoceridi, derivati
ossigenati dei caroteni (o xantofille) e acidi carotenoidi.
Tra questi il più conosciuto è sicuramente il b-carotene o provitamina A.
-carotene
+ 2H20
+ CAROTENASI
(enzima del fegato e dell'intestino)
CH2OH
2
vitamina A
Clorofilla:
Trasforma l’energia radiante del sole in energia necessaria per la trasformazione
dell’anidride carbonica dell’aria in composti organici.
E’ presente come un miscuglio di clorofilla “a” di color verde-bluastro e di clorofilla
“b” di color verde-giallo; hanno formula quasi analoga e sono contenute
maggiormente negli oli aventi tendenza più o meno marcata al color verde. La loro
concentrazione nell’olio è pari all’1%.
Esame della frazione insaponificabile
PREPARAZIONE DELLA FRAZIONE INSAPONIFICABILE
•10 grammi di campione d’olio d’oliva + 100 ml di KOH in etanolo.
•Riscaldamento sotto energica agitazione; a soluzione limpida ( saponificazione
avvenuta), si procede per altri 20 minuti.
•Si versa il tutto in un imbuto separatore, si aggiungono 150 ml di etere etilico e
dopo aver agitato energicamente si lascia riposare per qualche minuto fino a
completa stratificazione delle due fasi.
•Si procede quindi alla loro separazione e su quella acquosa si effettuano altre tre
estrazioni con 150 ml complessivi di etere.
•Sulla fase organica si controlla il pH neutro; in caso contrario si procede a
successive estrazioni fino ad ottenere tale risultato.
•Tramite aggiunta di Na2SO4 si disidrata la fase organica.
SEPARAZIONE DEI COMPONENTI TRAMITE TLC
•0,3 di soluzione si depositano a 1,5 cm circa dal bordo inferiore di una lastrina
cromatografica contenente come indicatore 2,7-difluororesceina.
•Si depositano come riferimento alcuni ml di una soluzione al 5% in cloroformio di
colesterolo.
•Si deposita la lastrina all’interno di una camera satura di una soluzione di 1:1di
esano-etere fino a che l’eluente non l’abbia attraversata completamente.
•Si evapora il solvente in corrente di aria calda.
Le macchie individuabili (dalla più alta alla linea di partenza) sono le seguenti:
Carotenoidi
Idrocarburi
Tocoferoli
Alcoli superiori e triterpenici
Steroidi
Colesterolo
Eritrodiolo e uvaolo
HPLC
ASPETTI GENERALI
La cromatografia in fase liquida ad elevate prestazioni (HPLC) rappresenta la
naturale evoluzione strumentale della cromatografia su colonna a bassa
pressione. Le elevate prestazioni che si possono ottenere con questa particolare
tecnica ne giustificano ampiamente il nome. L’HPLC,oggi, è considerata la
tecnica cromatografia più diffusa, efficace e versatile.
CLASSIFICAZIONE DELLE TECNICHE
L’HPLC può essere classificata con diversi criteri:
• Cromatografia “normale” eseguita con fase stazionaria polare e fase mobile apolare.
• Cromatografia in fase inversa che utilizza stazionarie apolari e fasi mobili polari.
Se invece ci si basa sul meccanismo principale della separazione e sulla natura delle fasi, si
distingue fra:
• Cromatografia di assorbimento liquido-solido (LSC)
• Cromatografia di ripartizione liquido-liquido (LLC)
• Cromatografia di esclusione (SEC)
• Cromatografia di scambio ionico (IEC)
• Cromatografia di coppia ionica (IPC)
Infine, se si fa riferimento alle particolari caratteristiche della fase stazionaria, si può
distinguere fra:
 Cromatografia su fase legata (BPC)
 Cromatografia su fase chirale (CPC)
FASI MOBILI
Le fasi mobili utilizzate in HPLC sono liquide. La scelta di esse dipende dalla fase
stazionaria utilizzata.I requisiti generali cui deve rispondere un eluente
indipendentemente sono:
•Bassa viscosità
 Immiscibilità con la fase stazionaria
• Basso costo e facile reperibilità
• Capacità di solubilizzare il campione
• Bassa volatilità
• Compatibilità con il rivelatore
• Minima tossicità possibile
 Bassa corrosività
• Elevata purezza
FASE STAZIONARIA
La fase stazionaria è costituita da materiale solido con una granulometria in
genere dell’ordine di 3/10 mm.
Esistono due diverse tipologie di fasi stazionarie:
1. Costituite da microparticelle porose di forma irregolare o sferiche e con
diverso grado di porosità,eventualmente imbevute di un liquido.
2. Costituite da particelle pellicolari, con nucleo non poroso, di forma sferica
rivestito da uno strato microporoso solido.
Strumentazione
Il cromatografo per HPLC può assumere diverse configurazioni a seconda che sia
destinato a funzionare in condizioni isocratiche oppure in gradiente di eluizione.
Inoltre, nel caso della eluizione in gradiente la miscelazione dei solventi può
essere effettuata ad alta o a bassa pressione ovvero, in altri termini, prima o dopo
l’ingresso nella pompa.
Schema generale HPLC
ELUENTE
POMPA
INIETTORE
PRECOLONNA
COLONNA
RIVELATORE
ANALIZZATORE
HPLC
STOCCAGGIO DELLA FASE MOBILE
I contenitori destinati allo stoccaggio del carrier in ingresso devono essere
di materiale inerte e devono avere una capacità tale da assicurare
l’esecuzione di un certo numero d’analisi. I materiali usati sono
solitamente il vetro o l’acciaio inox; per quanto riguarda la capacità sono
sufficienti contenitori da 1-2 l.
POMPE
Le pompe hanno un importante ruolo nell’HPLC. Vengono utilizzate pompe
pneumatiche e pompe meccaniche ma tutte devono fornire un flusso costante e
riproducibile. Devono inoltre:
• Fornire elevate pressioni in ingresso
• Avere un adeguato sistema di smorzamento delle pulsazioni
• Avere una notevole inerzia chimica
• Avere un ‘elevata autonomia
• Consentire rapide operazioni di ricambio della fase mobile e di pulizia
• Essere poco rumorosa,poco ingombrante e priva di vibrazioni eccessive.
FILTRI
Costituiti da uno strato di materiale inerte, servono ad impedire (tramite filtrazione)
che granelli di materiali di qualunque tipo entrino all’interno della colonna.
Possono essere liberamente applicati in qualsiasi punto ma il sistema più efficace
è quello fissato a monte dell’iniettore.
SISTEMI PER REALIZZARE
IL GRADIENTE DI ELUIZIONE
Quasi tutti i cromatografi sono corredati di un sistema di miscelazione adatto
all’eluizione in gradiente anche se si tratta di un’eluizione isocratica.
La miscelazione dinamica di solventi può essere realizzata in due modi:
• Ad alta pressione, inviando sotto pressione (mediante una pompa per
ciascuno) ogni solvente al sistema.
• A bassa pressione, con una sola pompa.
SISTEMI DI INIEZIONE
Esistono due diversi modi per iniettare il campione in colonna.
• Il primo prevede di iniettare il campione attraverso un foro di iniezione,
direttamente in colonna mentre il sistema è già in funzione (e quindi
sottoposto ad alta pressione).
• L’altro metodo, denominato sistema a valvola, prevede appunto l’utilizzo di
una tipica valvola di iniezione integrata da un capillare (loop) di volume
opportuno in cui viene iniettato il campione mediante una normale siringa.
COLONNE
Le colonne utilizzate in l’HPLC sono generalmente
inossidabile, con una lunghezza che va dai 5 cm a 25 cm.
d’acciaio
TERMOSTATO
La termostatazione, importantissima per garantire la riproducibilità delle analisi,
viene effettuata:
• Mediante la circolazione forzata di aria (la colonna è racchiusa all’interno di una camera)
• Con bagno d’acqua usando colonne con apposita camicia.
RIVELATORI
Quali sistemi di rivelazione, in HPLC vengono utilizzati spettrofotometri UV/visibile,
fluorimetri, rifrattometri o conduttimetri.
Gli spettrofotometri UV/visibile possono essere classificati in due categorie:
• A lunghezza d’onda fissa, che permette di operare solo ad una prestabilita
lambda.
• A lunghezza d’onda variabile.
• Il fluorimetro è un dispositivo che misura le radiazioni di fluorescenza
emesse da particolari classi di sostanze quando vengono eccitate con
radiazioni UV o con laser.
• Il rifrattometro permette invece di misurare l’indice di rifrazione del
solvente il quale varia al passaggio del soluto. Successivamente l’indice
viene convertito in segnale elettrico e inviato al sistema di elaborazione
• Il rivelatore elettrochimico è rappresentato dal conduttimetro. Esso misura
la variazione di conduttanza della fase mobile.
• Lo spettrometro di massa è un rivelatore universale, ad alta sensibilità e con un
buon intervallo di linearità e rappresenta quindi la soluzione ideale per moltissime
applicazioni.
Le difficoltà di affermazione dell’HPLC-MS sono dovute essenzialmente al
problema della loro interfacciabilità.
ANALISI DEGLI SPETTRI
DEI CAROTENOIDI
Per l’analisi gascromatografica dei carotenoidi sono state utilizzate le stesse fasi
della gascromatografia degli steroidi: fase stazionaria polare e fase mobile azoto.
Dopo l’iniezione di 2 ml di campione, il cromatogramma ottenuto mostra due picchi
significativi rispettivamente a 11 e 19 minuti circa e altri picchi molto ridotti,
compresi tra 11 e 19 minuti. Analizzandone uno ad uno mediante la massa sono
stati rilevati diversi componenti presenti nella frazione.
L’analisi del picco a 11 minuti permette l’identificazione dello stesso BHT
presente nella frazione sterolica in quanto anche qui è presente il picco
molecolare 205 ed altri caratteristici del composto stesso.
BHT
La scansione del picco ridottissimo a 18 minuti circa, mostra la presenza di una lieve
quantità, anche nei carotenoidi, di ftalati individuabili dal 149 corrispondente ad un
suo frammento.
Ftalati
L’analisi dei picchi a 19 minuti mostra la presenza di squalene rappresentato dai
picchi corrispondenti a suoi frammenti, quale il 69 appartenente all’isoprene.
Isoprene
Squalene
Dopo aver effettuato l’analisi dei carotenoidi in GAS_MASSA ho ripetuto
l’analisi della frazione stessa in HPLC.
L’utilizzo di C13 come fase stazionaria e metanolo quale fase mobile,
hanno portato al seguente risultato.
Un’analisi globale sui carotenoidi, dovrebbe fornire in linea generale il seguente
cromatogramma.
La fase mobile utilizzata è formata da: 1,2-diclorometano:2-propanolo.acetonitrile.
Flusso 1,5 ml/min. Rilevazione a 458 nm.
LEUTINA
-CRIPTOXANTINA
-CAROTENE
Profilo A:Carotenoidi
estratti da olio extra
vergine.
Profilo B:oli di oliva.
Profilo C: oli di
sansa e di oliva.
I picchi tratteggiati corrispondono ad altri carotenoidi separabili nelle stesse
condizioni ma assenti nei campioni analizzati.
CONCLUSIONI
Dall’analisi gascromatografica effettuata sui carotenoidi risulta la presenza di
BHT, ftalati e squalene: indici di una cattiva separazione dei componenti in partenza
e di una minima presenza nel campione d’olio analizzato della frazione.
Dall’analisi in HPLC, nonostante l’abbondanza dei picchi, non è possibile
individuare con precisione i composti presenti; tuttavia in linea generale si può
notare la presenza di ridotte quantità di carotenoidi non quantificabili con
precisione nei vari componenti.