Le spore batteriche
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LE SPORE
BATTERICHE
SONO FORME DI
RESISTENZA
Descritte da un
gruppo di ricercatori
in colture di batteri del
suolo presi da un
recipiente sigillato per
300 anni
Nella seconda metà del 1800
Ferdinand Julius Cohn
(botanico Polacco)
dimostrò come l'acqua
bollente uccideva le cellule
vegetative del Bacillus
subtilis, ma non le endospore
mettendo così definitivamente
a tacere la vecchia dottrina
della "generazione
spontanea".
Descritte in
mummie egiziane di
4000 anni fa
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SI ORIGINANO
Alcuni bacilli Gram positivi,
aerobi ed anaerobi, appartenenti
al genere Bacillus e Clostridium,
in determinate condizioni
ambientali danno luogo alla
formazione di particolari cellule
strutturalmente e funzionalmente
differenziate a cui si da il nome
di spore
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SI ORIGINANO
Le spore batteriche sono delle
endospore, ossia che originano
all’interno della cellula madre, detta
anche sporangio
La spora, oltre ai componenti
strutturali della cellula vegetativa
possiede molecole e strutture
cellulari specifiche che
condizionano caratteristiche
biologiche peculiari: è
metabolicamente inattiva, altamente
resistente agli insulti ambientali e
stabile per lunghi periodi di tempo
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SI ORIGINANO
LA CELLULA MADRE SI
DISGREGA E LIBERA LA
SPORA NELL’AMBIENTE
UBIQUITARIE
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Chi sporula?
ALCUNI BACILLI GRAM POSITIVI
Bacillus
Clostridium
COCCHI
RICKETTSIE
B. anthracis
B. cereus
B. subtilis
CARBONCHIO
TOSSINFEZIONI ALIMENTARI
INFEZIONI RESPIRATORIE
C. botulinum
C. difficile
C. perfringens
C. tetani
BOTULISMO
Sporasarcina
Coxiella burneti
PATOGENI OPPORTUNISTI
COLITE PSEUDOMEMBRANOSA
GANGRENAGASSOSA
TETANO
FEBBRE Q
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LE ENDOSPORE SONO RESPONSABILI
DI NUMEROSI PROBLEMI
EPIDEMIOLOGIA
ALIMENTAZIONE
FARMACEUTICA
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SI ELIMINANO
STERILIZZAZIONE IN AUTOCLAVE
121°C per 15 minuti
alla pressione di 1.05 Kg/cm2
Uccisione di tutte le forme viventi
BOLLITURA (100°C) INTERMITTENTE
Tre intervalli di 30 minuti seguiti da periodi di
raffreddamento
Prima del secondo e terzo ciclo di bollitura il
materiale viene mantenuto a temperatura
ambiente per almeno 8 ore
100°C = uccisione delle forme vegetative
Raffreddamento = germinazione delle endospore
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CARATTERIZZATE DA
UNO STATO DI CRIPTOBIOSI
IN CUI OGNI SINTESI
MACROMOLECOLARE
E’ ASSENTE.
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CARATTERIZZATE DA
La criptobiosi è uno stato di vita ametabolico nel quale entrano alcuni
organismi semplici in risposta a condizioni ambientali avverse, quali
essiccazione, congelamento, e mancanza di ossigeno.
Nello stato criptobiotico, tutti i processi metabolici si fermano,
impedendo la riproduzione, lo sviluppo e la riparazione. Un organismo
in un stato criptobiotico può vivere essenzialmente per un tempo
indeterminato fino a quando le condizioni ambientali tornare ad essere
ospitali. Quando ciò si verifica, l'organismo tornerà al suo stato di vita
metabolico precedente alla criptobiosi.
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CONSENTONO
CARENZA DI
AD ALCUNI BATTERI DI
SOPRAVVIVERE IN CONDIZIONI
AMBIENTALI SFAVOREVOLI
Possono sopravvivere per
anni in soluzione di alcool al 70%
CARBONIO
AZOTO
FOSFORO
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RESISTONO A
ELEVATE TEMPERATURE
RADIAZIONI UV
CONGELAMENTO
AGENTI BATTERICIDI
CONDIZIONI
NORMALMENTE
LETALI PER
LA CELLULA BATTERICA
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La SPOROGENESI è una
particolare espressione della capacità
di adattamento cellulare alla
disponibilità di nutrienti
nell’ambiente
Ogni specie batterica sporigena può
essere indotta a formare spore o
mantenuta costantemente in fase
vegetativa agendo sulla composizione e
la disponibilità dei nutrienti
“Le spore sono prodotte da cellule sane minacciate dalla fame” Knaysi
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La SPOROGENESI è un processo
altamente energetico in quanto
richiede una serie di modificazioni
morfologiche e la sintesi
di nuovi enzimi e metaboliti
GLICOLISI
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MORFOLOGIA
BATTRIDIO
Spora centrale che non
deforma la cellula madre
Clostridium perfringens
CLOSTRIDIO
Spora centrale con diametro
maggiore che deforma la
cellula madre
Bacillus anthracis
PLETTRIDIO
Spora terminale che
deforma la cellula madre
Clostridium tetano
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SI EVIDENZIANO
AL MICROSCOPIO
OTTICO IN PREPARATI
COLORATI
metodo di Gram
metodo di Schäffer e Fulton
AL MICROSCOPIO
ELETTRONICO
cellula vegetativa
spora
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SI EVIDENZIANO
AL MICROSCOPIO OTTICO IN
PREPARATI COLORATI.
La spora appare come un
corpicciolo rifrangente e
incolore all’interno del
batterio, essendo la spora
difficilmente penetrabile da
sostanze quali i coloranti, per
la complessità dei suoi
involucri
metodo di Gram
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ULTRASTRUTTURA
Le spore batteriche hanno una
struttura molto simile a quella
della cellula vegetativa ma si
differenziano per il fatto di
essere circondate da peculiari
involucri responsabili dei
peculiari aspetti biologici delle
spore
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ULTRASTRUTTURA
La parte centrale, il core, ripete la struttura della cellula vegetativa
intorno alla quale si sviluppano una serie di membrane molto
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peculiari e voluminose
CORE
PROTOPLASTO IN FORMA QUIESCENTE
circondato di una parete sporale
cromosoma addossato alla membrana plasmatica
ribosomi, alcuni tRNA, nessun mRNA
Small acid soluble proteins (SASP). Sono proteine a basso peso
molecolare che consentono alla spora di resistere ai raggi UV.
L’energia è conservata sotto forma di 3-fosfoglicerato, invece che ATP, una
molecola a minore concentrazione energetica ma più stabile
ridotta concentrazione di enzimi della cellula vegetativa
ridotto contenuto di H2O
Enzimi sporali
Acido dipicolinico
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ULTRASTRUTTURA
Una sottile membrana di composizione
fosfolipoproteica simile alla membrana
plasmatica
Due rivestimenti formati da
proteine molto stabili, lipidi (1-2%)
e a volte peptidoglicani, circondano
la cortex
Formata da peptidoglicani.
Circondata da due rivestimenti.
Contiene, inoltre, l’acido
dipicolinico, un acido che insieme
a grandi quantità di calcio
stabilizza la struttura
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CORTEX
costituita soprattutto di
PEPTIDOGLICANO MODIFICATO
Molti residui di acido N-acetilmuramico sono
sostituiti da anelli di acido d lattamico (lattami
muramici) siti di attacco degli enzimi della
germinazione
Formazione di legami crociati tra il peptidoglicano
e il dipicolinato di calcio. Ciò determina contrazione
del peptidoglicano ed eliminazione di acqua per
“strizzamento”
E’ una struttura flessibile poiché il peptidoglicano
sporale contiene un basso numero di legami
trasversi, rispetto a quello della cellula vegetativa.
Ciò è fondamentale per mantenere la disidratazione
sporale
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TUNICA
SPORALE
coat interno (elettronlucido)
coat esterno (elettrondenso)
Contiene diverse proteine cheratino-simili, molto stabili,
ricche di ponti disolfuro. L’impermeabilità di questo strato
rende le spore resistenti alle sostanze antibatteriche ed ai
coloranti
ESOSPORIO
E’ una struttura accessoria, di
natura fosfolipidica, simile alla
membrana plasmatica. Contiene
basse concentrazioni di acidi
teicoici, acido diaminopimelico e
glucosammina. Quando presente
determina massima rifrangenza e
completa impermeabilità ai coloranti
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CORTEX
COATS
ESOSPORIO
TERMORESISTENZA
intrinseca composizione molecolare
disidratazione
mineralizzazione
Il ridotto contenuto di acqua delle spore rende le proteine sporali meno
attive e più resistenti alla denaturazione termica. Contribuisce a tale
peculiare aspetto biologico delle spore la presenza di acido dipicolinico
complessato con ioni calcio, sotto forma di dipicolinato di calcio.
La comparsa della termoresistenza si osserva solo dopo che la cellula
acquisisce rifrangenza per riduzione del contenuto di acqua e dopo che
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l’accumulo di acido dipicolinico ha raggiunto un limite soglia
CORTEX
COATS
ESOSPORIO
TERMORESISTENZA
disidratazione
intrinseca composizione molecolare
mineralizzazione
RESISTENZA Al LISOZIMA
RESISTENZA AI SOLVENTI ORGANICI
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SPORULAZIONE
Processo di differenziamento cellulare
DIVISIONE ASIMMETRICA
DA UNA CELLULA BATTERICA SI
GENERA UNA SOLA SPORA
DIFFERENZIAMENTO
CELLULARE
ATTIVAZIONE DI NUOVI
PROCESSI BIOSINTETICI
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Addensamento del
materiale nucleare
Divisione del cromosoma e
separazione verso il polo
opposto
La membrana
citoplasmatica si introflette
con divisione asimmetrica
della cellula in due
compartimenti di diversa
grandezza
Si forma la prespora
Si completa il setto di
divisione e si formano le
diverse membrane che
caratterizzano la spora
L’INTERO PROCESSO DURA CIRCA 8 ORE E
PUÒ ESSERE SUDDIVISO IN 6-7 STADI
OGNUNO DEI QUALI E’ CARATTERIZZATO DA
EVENTI BIOCHIMICI E MORFOLOGICI
IN PARTE SPECIFICI
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Il processo di
sporulazione nelle
prime fasi è reversibile.
L’evento più importante
della sporulazione è la
sintesi di acido
dipicolinico e delle
SAPS, che legandosi al
DNA lo proteggono dalle
radiazioni UV
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Nelle prime fasi del
processo di sporulazione
è frequente la produzione
da parte dello sporangio di
piccoli peptidi ad attività
antibatterica
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ATTIVAZIONE
La sporulazione inizia quando si
verificano due condizioni
carenza di nutrienti
alta densità cellulare
Il monitoraggio della densità cellulare
si realizza con un MECCANISMO
“QUORUM SENSING”
È un meccanismo di comunicazione
tra cellule batteriche che ha come
finalità il controllo dell’espressione
genica in funzione della densità di
popolazione
La comunicazione tra cellule avviene
per mezzo di molecole segnale
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ATTIVAZIONE
MECCANISMO “QUORUM SENSING”
secrezione e riconoscimento di
EDF-1 (fattore di differenziamento
extracellulare). Si lega al batterio e
segnala ad esso di iniziare il processo
di sporulazione. La sporulazione parte
quindi all’inizio della fase stazionaria di
crescita
< [GTP] (fattore di differenziamento
intracellulare). La ridotta
concentrazione di GTP rappresenta il
segnale biochimico intracellulare che
dà l’avvio alla sporulazione
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ATTIVAZIONE
La formazione di spore implica la produzione di numerose nuove
strutture, enzimi e metaboliti, assieme alla scomparsa di numerosi
componenti della cellula vegetativa.
Affinchè ciò si attui deve essere attivata una serie di geni, i cui prodotti
determinano la formazione e la composizione finale della spora mentre
un’altra serie di geni, quelli necessari alle funzioni della cellula
vegetativa, deve essere inattivata.
La compartimentalizzazione dell’espressione genica riguarda
modificazioni della specificità trascrizionale della RNA polimerasi
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RNA-polimerasi batterica
CELLULA VEGETATIVA
I geni della cellula vegetativa
sono letti da molecole di RNA
polimerasi che contengono
sA
fattori sA di riconoscimento.
La subunità s riconosce il promotore
e legge il DNA in punti specifici
sH
sE
SPORULAZIONE
La RNA polimerasi viene clivata
diventando incapace di riconoscere
i fattori sigma della cellula vegetativa.
Vengono sintetizzati nuovi fattori sigma,
ciascuno specifico per il gruppo di geni
della sporulazione
sF
sG
sK
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RNA-polimerasi batterica
SPORULAZIONE
Tale processo porta quindi ad una
modificazione della RNA polimerasi che rende
capace l’enzima di riconoscere solo i promotori
dei geni sporali
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ATTIVAZIONE
< [GTP] è il segnale biochimico
intracellulare che da l’avvio alla
sporificazione; inoltre, porta alla
sintesi del fattore sH e alla
fosforilazione della proteina
SpoOA, che dereprime i geni
d’inizio della sporulazione
Divisione del DNA
Attivazione di SpoOA “regolatore della risposta”
Sintesi del fattore sH (specifico per il primo gruppo di geni
della sporulazione)
Formazione del setto di divisione asimmetrico, primo
evento irreversibile
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EsH e SpoOA attivano la trascrizione de fattori sF e sE
Formazione della PRESPORE e della
CELLULA MADRE
Sintesi di SpoIIID (proteina binding del DNA)
Localizzazione di sE nella cellula madre
Localizzazione di sF nella prespora
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La sporulazione determina l’attivazione di circa 200
geni che codificano sia per proteine strutturali che
regolatrici e che controllano una cascata di geni
molto complessa
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sF nella prespora attiva la trascrizione di sG e
dei fattori di attivazione di sE nella cellula madre
La prespora è inglobata da una doppia membrana
citoplasmatica
Sintesi delle SAPS nella prespora
La prespora sintetizza i componenti della PARETE SPORALE
La cellula madre sintetizza i componenti della CORTEX
(peptidoglicano modificato e acido dipicolinico)
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Il fattore sE nella cellula madre attiva la trascrizione
di sK e dei fattori di attivazione di sG nella prespora
Lo scambio di segnali
bidirezionali (crisscross) cellula madre prespora e viceversa
assicura che la
sequenza degli eventi
venga rispettata
Sintesi di GerE (proteina bindig del DNA)
La cellula madre completa la sintesi dei componenti della
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cortex e sintetizza i componenti dei COATS
Lo scambio di segnali
bidirezionali (crisscross) cellula madre prespora e viceversa
assicura che la
sequenza degli eventi
venga rispettata
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LA SPORA MATURA SI LIBERA
NELL’AMBIENTE
La cellula madre si lisa e la spora matura
è liberata nell’ambiente
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GERMINAZIONE
In condizione ambientali
favorevoli una spora ritorna alla
condizione di cellula vegetativa
in 90’ e si suddivide in 3 fasi:
ATTIVAZIONE
GERMINAZIONE VERA E PROPRIA
ESOCRESCITA
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GERMINAZIONE IN VITRO
Si può realizzare esponendo le spore per 1 h
alla temperatura di 60°C in presenza di indutturi
del processo di germinazione quali zuccheri,
amminoacidi o lisozima
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ATTIVAZIONE
Perdita delle attività biologiche della
spora senza che siano evidenti
modificazioni morfologiche
INDUTTORE:
FATTORI DI GERMINAZIONE:
Stimolo traumatico
(shock termico)
L-alanina, Asparagina,
inosina, glucosio,
fruttosio, Ca++ Mn++
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Attivazione
Una delle ipotesi più accettabile per spiegare
il fenomeno dell’attivazione si riferisce alla rottura
dei ponti S-S delle proteine dei coats, responsabili
della maggiore permeabilità della spora attivata.
Se non si aggiungono gli induttori del processo di
germinazione, la spora non entra nella seconda
fase.
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GERMINAZIONE
Perdita di frammenti degradati di peptidoglicano e
dipicolinato di Ca++. Assunzione di H2O e aumento di
volume. Perdita della termoresistenza e della resistenza
all’essiccamento, al lisozima e agli agenti chimici
ESOCRESCITA
La cellula vegetativa fuoriesce completamente
dagli involucri sporali e riprende la
sua normale attività metabolica. Ripresa della sintesi
proteica e degli acidi nucleici
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