Lavoro di diploma 2009
Redatto da: Regazzoni Cinzia
Scuola Superiore Medico Tecnica, Locarno
Svolto presso:
Servizio Trasfusionale CRS Svizzera Italiana
Responsabile: Ryser Belinda
INDICE
INDICE ........................................................................................................................................................... 1
1.
2.
RIASSUNTO/ABSTRACT ..................................................................................................................... 2
INTRODUZIONE .................................................................................................................................... 3
2.1. Morbo Emolitico del Neonato (MEN) ................................................................................................................ 3
2.1.1. Condizioni necessarie per lo sviluppo di un MEN ................................................................................. 3
2.1.2. Immunizzazione materna ....................................................................................................................... 3
2.1.3. Valutazione prenatale ............................................................................................................................ 4
2.1.4. Sorveglianza neonatale ......................................................................................................................... 5
2.2. La profilassi anti-D ............................................................................................................................................ 6
2.2.1. A chi e quando viene somministrata la profilassi anti-D ........................................................................ 7
2.2.2. Meccanismo d’azione della profilassi anti-D .......................................................................................... 7
2.2.3. Causa di alloimmunizzazione ................................................................................................................ 7
2.3. La titolazione anticorpi ...................................................................................................................................... 8
2.4. Scopo del lavoro di diploma ............................................................................................................................. 8
2.5. Obiettivi ............................................................................................................................................................. 9
3.
MATERIALE E METODI ...................................................................................................................... 10
3.1. Materiale generale .......................................................................................................................................... 10
3.1.1. Plasma ................................................................................................................................................. 10
3.1.1.1. Criteri per l’accettazione del prelievo ..................................................................................... 10
3.1.2. Selezione eritrociti................................................................................................................................ 10
3.1.2.1. Titolo anti-D ............................................................................................................................ 11
3.1.2.2. Titolo altri alloanticorpi ............................................................................................................ 11
3.1.3. Materiale tecnico .................................................................................................................................. 11
3.1.3.1. Centrifuga lava globuli – metodo in provetta .......................................................................... 11
3.1.3.2. Incubatore – metodo provetta + gel........................................................................................ 11
3.1.3.3. Centrifuga per cartine – metodo gel ....................................................................................... 11
3.2. Materiale metodo in PROVETTA.................................................................................................................... 11
3.2.1. Siero polispecifico di Coombs .............................................................................................................. 11
3.2.2. Coombs-Control ................................................................................................................................... 12
3.2.3. Soluzione salina ................................................................................................................................... 13
3.3. Materiale metodo in GEL ................................................................................................................................ 13
3.3.1. ID-Diluent 2 .......................................................................................................................................... 13
3.3.2. Cartina gel LISS/COOMBS .................................................................................................................. 13
3.4. Metodi ............................................................................................................................................................. 14
3.4.1. Principio dell’analisi del test di Coombs indiretto ................................................................................. 14
3.4.2. Principio dell’analisi della titolazione anticorpi ..................................................................................... 15
3.4.3. Titolazione anticorpi anti-eritrocitari in PROVETTA ............................................................................. 15
3.4.4. Titolazione anticorpi anti-eritrocitari in GEL ......................................................................................... 16
3.5. Possibili fattori influenti sui risultati d’analisi ................................................................................................... 18
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
RISULTATI ........................................................................................................................................... 19
DISCUSSIONE ..................................................................................................................................... 23
CONSLUSIONE ................................................................................................................................... 25
GLOSSARIO ........................................................................................................................................ 27
BIBLIOGRAFIA .................................................................................................................................... 28
RINGRAZIAMENTI .............................................................................................................................. 29
ALLEGATI ............................................................................................................................................ 30
1 1. RIASSUNTO/ABSTRACT
INTRODUZIONE
INTRODUCTION
Il Morbo emolitico del neonato (MEN) é una malattia
caratterizzata dalla distruzione di eritrociti del feto ad
opera di anticorpi specifici, che si sono formati nella
madre dopo un processo di alloimmunizzazione
(antigene assente dagli eritrociti materni), diretti contro
eritrociti fetali; questa situazione si può osservare durante
la gravidanza o subito dopo il parto. I test di screening
prenatali sono molto importanti al fine di prevenire e/o
monitorare l’insorgere di un MEN. Secondo le
Raccomandazioni dei Ginecologi, a tutte le donne Rh
negative (prive di alloanticorpi anti-D), alla 28° settimana
di gravidanza e nelle 72 ore seguenti il parto, viene
somministrata la profilassi anti-D (300 μg in 2 ml)
sufficiente per neutralizzare 24-30 ml di sangue fetale.
Per monitorare la concentrazione degli anticorpi nel corso
della gravidanza si esegue l’analisi della titolazione
anticorpi. Lo scopo del mio lavoro di diploma è quello di
fare un confronto tra il metodo ID-Gel (in uso presso ST
CRS SI) e il metodo in provetta (raccomandato da ISBT),
trovare i fattori influenzanti per quest’analisi e valutare
quale valore diagnostico ha al giorno d’oggi.
The hemolytic disease of the newborn is a disease
where the fetus erythrocytes are destroyed by specific
antibodies that are produced after the alloimmunization
in the mother (antigen absent in the mother’s
erythrocytes). These antibodies are directed against
fetus erythrocytes, and we can see this situation in
pregnancy or immediately after the birth. Antenatal
screening tests are very important for the prevention of
the onset of hemolytic disease of the newborn.
Gynecologists’ recommendations say that all Rh
negative woman (without alloantibody anti-D) in the 28°
week of pregnancy and in the 72 hours after the birth,
must receive prophylaxis anti-D (300 μg in 2 ml),
enough to neutralize 24-30 ml of fetal blood. For the
monitoring of the concentrations of antibody during
pregnancy, we must do an alloantibody titration. The
aim of my diploma study was to compare the method
ID-Gel, in use at ST CRI SI (Transfusion Service CRS
Italian Switzerland) and the tube method recommended
by ISBT (International society of blood transfusion), find
the interference factors for this analysis and evaluate
the current diagnostic value.
MATERIALE E METODI
L’analisi della titolazione anticorpi è stata eseguita su 95
campioni (sangue EDTA) di donne in gravidanza: 82 con
anti-D da profilassi, 10 anti-D immune e 3 altri
alloanticorpi. Per ogni campione l’analisi è stata
determinata con 2 metodi: metodo ID-Gel (Diamed) con
ID-Diluent 2 (LISS) per le diluizioni geometriche e metodo
in provetta (Biotest) con soluzione isotonica Immusol
(Medion Diagnostics); i tempi di incubazione sono diversi
(15 min metodo ID-Gel; 1 ora metodo in provetta); si è
constatato che i i risultati ottenuti con queste 2 metodiche
non sono riproducibili. Per questo motivo si è modificato il
metodo ID-Gel e come soluzione di diluizione si è deciso
di utilizzare la soluzione isotonica Immusol.
RISULTATI E CONCLUSIONI:
Con questo lavoro si è potuto dimostrare che il metodo
ID-Gel, con la soluzione isotonica Immusol, per la
titolazione anticorpi fornisce dei risultati paragonabili al
metodo in provetta raccomandato dalle normative
internazionali ISBT. I risultati ottenuti mostrano una
buona riproducibilità che al massimo evidenziano una
differenza di una diluizione tra i due metodi soprattutto
per i risultati con titolo basso (1 o 2). Utilizzando questa
nuova metodica ID-Gel con Immusol resta valido il
riferimento al valore limite definito per l’anticorpo immune
anti-D titolo ≥ 16. Questo metodica è già entrata in
applicazione presso ST CRS SI, rispettando così gli
standard internazionali.
MATERIALS AND METHODS
95 plasma (EDTA) samples were analyzed for the
alloantibody titration in pregnant woman: 82 with anti-D
from prophylaxis, 10 with immune anti-D and 3 with
other alloantibodies. All the samples were determined
with the following 2 methods: method ID-Gel (DiaMed)
with ID-Diluent 2 (LISS) for the geometric dilutions and
tube method (Biotest) with isotonic solution Immusol
(Medion Diagnostics); the incubation times were
different (15 min for the method ID-Gel and 1 hour for
the tube method). It was deduced that the 2 methods
are not reproducible. For this reason the method ID-Gel
was modified and the isotonic solution Immusol was
used as dilution solution.
RESULTS AND CONCLUSION
With this diploma study it was demonstrated that the
method ID-Gel, with isotonic solution Immusol, for
antibody titration gives the same results as the tube
method recommended by the international norms of
ISBT.
The results that we obtained have very good
reproducibility, which gives a maximum difference of
one dilution between the two methods for the results
with a low title (1 or 2). Using this new method, ID-Gel
with Immusol remains valid with reference to the
significant value for the antibody immune anti-D title ≥
16. This method is already in use at ST CRS SI, thus
respecting international standards.
2 2. INTRODUZIONE
2.1) Morbo emolitico del neonato (MEN)
Il Morbo emolitico del neonato (in seguito MEN) é una malattia caratterizzata dalla distruzione di
eritrociti del feto ad opera di anticorpi specifici, che si sono formati nella madre dopo un processo
di alloimmunizzazione (antigene assente dagli eritrociti materni), diretti contro eritrociti fetali;
questa situazione si può osservare durante la gravidanza o subito dopo il parto.
Questa malattia viene anche denominata eritroblastosi fetale in quanto l’accelerata distruzione
degli eritrociti stimola un’aumentata produzione da parte del midollo osseo, con la conseguenza
che molti di questi eritrociti entrano in circolazione ancora in uno stadio prematuro come cellule
nucleate.
2.1.1) Condizioni necessarie per lo sviluppo di un MEN
1) L’antigene responsabile deve essere immunogenico.
2) L’antigene deve essere ben sviluppato sia nel feto che nel neonato.
3) L’antigene deve trovarsi essenzialmente sulla superficie degli eritrociti.
4) Gli anticorpi prodotti dalla mamma devono poter passare la placenta (ricettore del
frammento Fc delle IgG sulla placenta).
5) La mamma si deve essere immunizzata in precedenza: risposta immunitaria secondaria o
anamnestica per gravidanze o trasfusioni precedenti o nel corso della stessa gravidanza.
• Gravidanze o trasfusioni precedenti: risposta immunitaria primaria per incompatibilità
antigenica degli eritrociti con cui la mamma è entrata in contatto.
• Nel corso della stessa gravidanza: l’immunizzazione fa seguito a trasfusioni
transplacentari.
• Al parto è il momento dove si verificano micro-trasferimenti feto-placentari di
maggiore importanza, durante il quale si stima che circa 30 ml di sangue fetale
passano nella circolazione materna.
2.1.2) Immunizzazione materna
Nel corso di una prima immunizzazione non si hanno problemi dell’insorgere di un MEN perché
essendo una risposta immunologica primaria vengono prodotti anticorpi della classe IgM che non
passano la placenta.
La malattia emolitica insorge invece in occasione di un secondo contatto della madre con
l’antigene in questione; questo causa una risposta immunologica secondaria di tipo anamnestico
con la produzione di anticorpi della classe IgG. Questi anticorpi IgG si fissano sulla membrana
degli eritrociti fetali (sensibilizzazione) e ne determinano la distruzione nella milza (recettore per il
frammento Fc sulla membrana dei macrofagi) provocando un’emolisi.
3 Come conseguenza all’emolisi fetale si ha un’aumentata formazione dei prodotti del catabolismo
dell’emoglobina (soprattutto bilirubina), ma fino a quando il feto si trova nell’utero non insorgono
gravi problemi, perché la bilirubina viene eliminata per via transplacentare.
Il problema è l’incremento dei valori della bilirubina subito dopo il parto, perché il neonato non ha
ancora la capacità di smaltire la bilirubina tramite il fegato (ancora immaturo).
Figura 1 : grafico della risposta
immunitaria. Per una risposta
primaria servono 0,1 ml di sangue
per stimolare il sistema immunitario
a produrre alloanticorpi anti-D; per la
produzione di altri alloanticorpi antieritrocitari è necessaria invece una
quantità maggiore di sangue. Per la
risposta
immunitaria
di
tipo
anamnestico sono invece sufficienti
solamente 0,03 ml di sangue per
stimolare il sistema immunitario a
produrre alloanticorpi immuni IgG.
[2]
Nella figura 1 si nota una distinzione tra anticorpi anti-D ed altri anticorpi. Il MEN, può essere
suddiviso infatti in 3 categorie:
1) MEN da anti-D;
2) MEN da altri anticorpi Rh o altri sistemi;
3) MEN da incompatibilità ABO.
2.1.3) Valutazione prenatale
I test di screening prenatali sono molto importanti nel monitoraggio di una gravidanza a rischio per
la prevenzione di un MEN.
Al più tardi al termine del 1° trimestre, a tutte le donne in gravidanza, deve essere eseguito uno
screening anticorpi e la determinazione completa del gruppo sanguigno.
Il titolo anticorpale determinato nel corso del 1° trimestre funge da paragone con le titolazioni
successive (determinate in doppio con plasma congelato in precedenza, stessa metodica e
eritrociti test con medesimo fenotipo).
Il titolo critico per un alloanticorpo anti-D è per definizione ≥ 16 (metodo in provetta).
Alla 28a settimana di gravidanza si deve eseguire un 2° screening anticorpi; se negativo, alle
donne Rh negative si procederà con la somministrazione della profilassi anti-D (vedi capitolo
2.2.1).
4 In caso di presenza di alloanticorpi si consiglia un monitoraggio mensile del titolo anticorpale,
questo non significa però che per forza si svilupperà un MEN. Per verificare la possibilità concreta
che si sviluppi realmente un MEN si potrebbero eseguire le seguenti indagini:
•
tipizzazione del feto tramite PCR di DNA ottenuto dal liquido amniotico/villi coriali (tecnica
invasiva);
•
amplificazione di DNA fetale presente nel plasma materno [18];
•
tipizzazione del papà.
A causa dei rischi e dei costi dovuti da questo tipo di indagini, il monitoraggio del titolo anticorpale
nel plasma resta l’analisi meno invasiva e più facile da praticare.
Resta però il fatto che il significato del titolo in gravidanza è controverso, in quanto esiste poca
correlazione tra il titolo e gli effetti sul feto o neonato; il titolo anticorpale deve essere interpretato
in relazione all’alloanticorpo identificato e sull’arco della gravidanza stessa:
•
un aumento del titolo fornisce l’indicazione di un’immunizzazione in corso.
•
una diminuzione del titolo anticorpale, in particolare degli anticorpi anti-D da profilassi,
indica un consumo di questi anticorpi e da l’indicazione alla ripetizione della profilassi antiD, per fare in modo che la madre risulti ancora protetta.
In caso di sospetto reale di MEN si deve obbligatoriamente informare il ginecologo per procedere
a una sorveglianza più stretta della gravidanza.
2.1.4) Sorveglianza neonatale
Nei neonati in cui si è sviluppato il MEN (in casi gravi si deve procedere con un’exanguino
trasfusione – allegato 15) o in cui il rischio di MEN è molto elevato è importante prelevare al parto
un campione di sangue dal cordone ombelicale per la determinazione di emoglobina, ematocrito,
reticolociti e eritroblasti.
Si consiglia di eseguire l’analisi su sangue del cordone, perché pochi minuti dopo la nascita, una
quantità di sangue variabile si trasferisce dalla placenta al bambino, rendendo difficile
l’interpretazione del valore dell’emoglobina (Figura 2).
Figura 2 : misurazione emoglobina
post-parto. I cambiamenti della
concentrazione di emoglobina in
seguito al trasferimento del sangue
placentare tendono a mascherare
anemie di media gravità nei neonati.
Nel caso illustrato, un neonato con
MEN ha un’emoglobina misurata su
sangue del cordone con una
concentrazione inferiore alla media, ma
dopo la nascita la concentrazione di
emoglobina si presenta come quella di
un neonato sano. [3]
5 Oltre ai parametri ematologici, sul campione di sangue dal cordone si eseguono anche le seguenti
analisi
•
determinazione del gruppo sanguigno (solo antigeni eritrocitari).
•
Coombs diretto: se positivo richiedere un campione di sangue capillare per confermare il
risultato (escludere i falsi positivi) e proseguire eventualmente con le indagini: eluizione
(allegato 10) con conseguente identificazione dell’anticorpo che provoca emolisi (non si
tratta di un auto-anticorpo ma di un alloanticorpo IgG di provenienza materna). In casi acuti
di MEN, il Coombs diretto del neonato può anche risultare negativo, in quanto gli eritrociti
sensibilizzati sono stati tutti distrutti (forte emolisi; emoglobina fortemente diminuita; rischio
vitale).
I risultati ottenuti con il sangue del neonato devono essere obbligatoriamente confermati nel
sangue materno.
2.2) La profilassi anti-D
L’antigene D è il più immunogenico e il più pericoloso in caso di MEN, per la severa emolisi che
alloanticorpi immuni anti-D materni possono provocare nel bambino.
La frequenza di un’alloimmunizzazione per una madre Rh negativa con un feto Rh positivo, senza
nessun trattamento profilattico, è del 16% di cui:
Tabella 1: percentuali di immunizzazione [1]
%
Alloimmunizzazione
1,5 – 2 %
Sensibilizzate durante la 1° gravidanza
7%
Nei 6 mesi successivi al parto
7%
Nel corso nella 2° gravidanza Rh incompatibile
Un metodo per evitare l’insorgere di questa grave patologia esiste ed è la profilassi anti-D.
La profilassi anti-D (Rhophylac300 ditta CSL Behring AG, Berna) consiste in immunoglobuline
umane IgG anti-D prodotte da persone volontarie (generalmente uomini) Rh negative alle quali
viene iniettata una dose di antigene D tale da stimolare il sistema immunitario a produrre
immunoglobuline.
Oltre agli anticorpi anti-D il medicamento Rhophylac 300 (Figura 3) può anche contenere altri
anticorpi Rh in piccole quantità come ad esempio anti-C.
La dose standard iniettata è 300 μg di immunoglobuline in 2 ml di soluzione. Esistono 2 vie per la
somministrazione:
•
Iniezione intravenosa: il 100% della dose si trova nel circolo sanguigno materno
immediatamente dopo la somministrazione.
•
Iniezione intramuscolare: il titolo delle immunoglobuline aumenta lentamente; il valore
massimo lo si raggiunge dopo 2-4 giorni dalla somministrazione.
6 La dose di 300 μg di IgG anti-D sono sufficienti per neutralizzare 10-15 ml di eritrociti fetali Rh
postivi che corrispondono a circa 24-30 ml di sangue fetale.
La presenza di anti-D da profilassi nel plasma della paziente è visibile fino a circa 6 mesi dopo il
parto.
Figura 3: Rhophylac 300 ditta Behring [10]
2.2.1) A chi e quando viene somministrata la profilassi anti-D
La profilassi anti-D prenatale è generalmente raccomandata alla 28a settimana di gravidanza a
tutte le donne in gravidanza Rh negative, con una ricerca anticorpi negativa (la paziente non deve
già possedere un alloanticorpo anti-D immune), compreso Dparziale e Dweak esclusi i tipi 1, 2 e 3.
La ricerca anticorpi anti-eritrocitari va eseguita al controllo del primo trimestre e alla 28a settimana
di gravidanza.
La profilassi è anche indicata post-parto in tutte le donne Rh negative che hanno partorito un
bambino Rh positivo. È per questo motivo che viene richiesta l’analisi del gruppo sanguigno del
neonato per questa categoria di mamme.
Le immunoglobuline anti-D devono essere somministrate nelle 72 ore che seguono il parto; in
caso di dimenticanza la profilassi post-natale può essere eseguita fino a 14 giorni dopo il parto.
2.2.2) Meccanismo d’azione della profilassi anti-D
Le IgG anti-D della profilassi si legano ad eventuali eritrociti Rh positivi del feto presenti nel circolo
sanguigno materno; così facendo si viene a formare un complesso antigene-anticorpo che viene
eliminato, al prossimo passaggio, dalla milza.
I macrofagi presenti nella milza, avendo sulla loro membrana dei recettori per il frammento Fc
delle immunoglobuline, riconoscono l’anticorpo legato all’eritrocita e lo sequestrano con il
processo della fagocitosi.
2.2.3) Causa di alloimmunizzazione
La principale causa del fallimento della profilassi anti-D post-parto è rappresentata
dall’alloimmunizzazione prima del parto che può verificarsi in circa lo 0,7-1,8% delle donne con
gravidanze a rischio; la combinazione di somministrazione di una profilassi anti-D prima del parto
alla 28° settimana di gravidanza e di una post-parto, riducono l’incidenza di contrarre un MEN fino
allo 0,2%.
7 2.3) La titolazione anticorpi
In gravidanza la titolazione anticorpi è eseguita per identificare donne con un significativo livello di
anticorpi che può portare a sviluppare un MEN.
La titolazione anticorpi è un’analisi eseguita con una tecnica non invasiva (prelievo di sangue) sul
plasma della madre. Mediante una serie di diluizioni geometriche si arriva a definire la quantità di
anticorpo presente nel plasma con un valore definito come titolo anticorpale.
Il titolo anticorpale è un valore di non semplice interpretazione perché non è direttamente
proporzionale a conseguenze che potrebbero manifestarsi nel feto: un valore alto del titolo non
significa per forza l’insorgere di un MEN, come un titolo di valore basso può invece causare un
MEN grave. Il valore del titolo acquisisce importanza in relazione all’alloanticorpo specifico
identificato nel plasma materno.
2.4) Scopo del lavoro di diploma
Il progetto mira a confrontare due metodi per la titolazione degli alloanticorpi:
•
Metodo in GEL: attualmente utilizzato presso il Servizio Trasfusionale CRS Svizzera
Italiana (in seguito ST CRS SI).
Il laboratorio di immunoematologia del ST CRS SI, utilizza come metodo di riferimento per
le analisi il sistema ID-Gel (Diamed). L’analisi della titolazione anticorpi è conseguente a
una ricerca anticorpi positiva in una gestante; siccome la ricerca anticorpi è eseguita con
metodo Gel, si è deciso di proseguire con questo metodo anche per la titolazione anticorpi
per mantenere la sensibilità del metodo. A supporto di questo metodo non normalizzato
applicato dal ST CRS SI, sta il fatto che il valore del titolo anticorpale acquisisce rilevanza
sull’arco della gravidanza e non come valore a sé stante; interessa la tendenza e non il
singolo valore.
•
Metodo in provetta: non in uso presso ST CRS SI ma raccomandato dalle normative
internazionali International Society Blood Transfusion (ISBT): società internazionale fondata
nel 1935 che coinvolge professionisti della medicina trasfusionale di 95 paesi. [19]
Le normative internazionali ISBT, definiscono come metodo di riferimento il metodo in
provetta con soluzione salina e fornisce come valore di riferimento per l’anticorpo anti-D
immune un titolo ≥ 16. Queste normative sconsigliano, per la pratica di questa analisi,
l’utilizzo del Gel e di soluzioni che potenziano e accelerano la reazione antigene anticorpo,
perché forniscono dei valori falsamente aumentati, rispetto alla reale situazione in vivo.
La tecnica GEL ha sostituito nell’ultimo decennio la tecnica in provetta, riducendo i tempi d’ analisi,
fornendo una tecnica di lavoro più semplice ed igienica, apportando una maggior sensibilità nelle
analisi di immunoematologia e permettendo di identificare anticorpi che in provetta sarebbero stati
di difficile individuazione, ma al tempo stesso ha portato con sé anche un numero maggiore di
reazioni non specifiche che interferiscono con i risultati stessi.
Si è a conoscenza che i due metodi di lavoro forniscono valori del titolo che non coincidono,
proprio per la differente sensibilità dei metodi.
8 A questo punto le domande sono: perché gli standard internazionali non modificano la metodica di
referenza per questa analisi? O per lo meno perché non danno indicazioni sul metodo di
esecuzione della titolazione anticorpi in Gel? Si può dimostrare che la metodica in GEL è
utilizzabile per questa analisi? Quali accorgimenti si possono adattare per ottenere la
riproducibilità dei risultati con entrambi i metodi?
Una volta concluso lo studio tra le due metodiche si dovrà scegliere quale metodo utilizzare in
futuro presso il ST CRS SI.
2.5) Obiettivi
Per raggiungere lo scopo di questo lavoro sono stati posti i seguenti obiettivi:
•
•
•
Valutare i risultati ottenuti con le due metodiche di lavoro proposte e decidere quale metodo
utilizzare presso il ST CRS SI. Da un lato tenendo presente le conseguenze che un
cambiamento può portare dell’interpretazione del risultato da parte dei ginecologi, dall’altro
se si decide di mantenere la medesima metodica Gel si avrà a supporto una serie di dati e
un’analisi accurata per descrivere perché non vengono seguite le normative internazionali
ISBT. Tutto ciò risulta importante per un laboratorio accreditato come quello del ST CRS SI
per poter dimostrare le motivazioni della messa in applicazione di un metodo non
normalizzato. In questo senso il lavoro di diploma funge anche da validazione del metodo di
analisi.
Valutare i possibili fattori che influenzano (tecnici ed umani) l’esecuzione di questa analisi e
riproducibilità dei risultati per metodica di lavoro.
Verificare quale significato viene attribuito dai ginecologi al valore del titolo anticorpale al
giorno d’oggi e quali altre misure vengono messe in atto al fine della prevenzione del MEN.
9 3. MATERIALE E METODI
3.1) Materiale generale
3.1.1) Plasma
Il materiale utilizzato per l’esecuzione di questo confronto tra metodi è plasma anticoagulato con
EDTA (acido etilendiamminotetracetico – Figura 4) di donne in gravidanza conosciute per la
presenza di anticorpi anti-D da profilassi o alloanticorpi immuni.
A
B
Figura 4: provette con anticoagulante EDTA: “A” centrifugata e “B” non centrifugata [12]
Per evitare una diluizione degli anticorpi sono sconsigliati i prelievi da accessi venosi con infusione
e l’utilizzo di citrato come anticoagulante.
3.1.1.1) Criteri per l’accettazione del prelievo
Sulla provetta e sulla richiesta d’analisi devono essere riportati: nome, cognome, data di
nascita completa, data/ora del prelievo e firma dell’esecutore/trice del prelievo.
L’identificazione corretta delle provette è un processo molto importante che deve essere
eseguito con molta attenzione al fine di evitare scambi di provetta/paziente.
Per poter iniziare con le analisi si deve centrifugare la provetta a 3000 rpm per 8 minuti per
permettere la separazione del plasma dalla parte corpuscolata del sangue (eritrociti,
trombociti e leucociti); il plasma viene poi separato in un’altra provetta pronto per essere
utilizzato.
3.1.2) Selezione eritrociti
La quantità di punti antigenici è un fattore variabile che può influenzare il risultato di un titolo
anticorpale, di conseguenza è fortemente raccomandato l’utilizzo di eritrociti con il medesimo
fenotipo nel corso del monitoraggio in gravidanza.
10 3.1.2.1) Titolo anti-D
Per la titolazione di alloanticorpi anti-D o da profilassi si utilizzano preferibilmente eritrociti
con fenotipo ccD.EE (R2R2), perché si ritiene sia quello con un numero più elevato di antigeni
D sulla superficie eritrocitaria (15'800 – 33'300). [2]
Gli eritrociti con questo particolare fenotipo (frequenza 2%) vengono scelti tra la popolazione
dei donatori di sangue completamente tipizzati.
3.1.2.2) Titolo altri alloanticorpi
Per la titolazione di altri alloanticorpi vengono selezionati eritrociti dove l’antigene
corrispondente all’alloanticorpo da titolare è presente in forma omozigote. Solitamente
vengono utilizzati eritrociti presenti nei pannelli della ditta DiaMed per la ricerca anticorpi;
come alternativa si possono utilizzare eritrociti da donatori tipizzati.
3.1.3) Materiale tecnico
3.1.3.1) Centrifuga lava globuli – metodo provetta
La centrifuga lava globuli (DAC III - ditta Medion Diagnostics GmbH, Düdingen) viene
utilizzata per il lavaggio degli eritrociti. Si utilizzano delle provette in vetro dove sono
contenuti gli eritrociti da lavare e la diluizione del plasma del paziente.
Gli eritrociti vengono lavati con dei processi di risciacquo, centrifugazione e risucchio.
3.1.3.2) Incubatore – metodo provetta + Gel
L’incubatore (ID-Incubator 37 SI – ditta DiaMed AG, Cressier) viene utilizzato per mantenere
provette e cartine ad una costante temperatura di 37°C (metodo in provetta 1 ora; metodo in
gel 15 minuti).
3.1.3.3) Centrifuga per cartine – metodo Gel
Questa centrifuga (ID-Centrifuge 12 S – ditta DiaMed AG, Cressier) è appositamente creata
per la centrifugazione delle cartine DiaMed (tempo centrifugazione 10 minuti; rpm variabili a
seconda del tipo di centrifuga).
3.2) Materiale metodo in provetta
3.2.1) Siero polispecifico di Coombs
Il siero polispecifico di Coombs (Anti-Human-Globulin Color – ditta Biotest AG, Rupperswil –
Figura 5) è un preparato composto da antiglobuline umane ottenute in seguito all’iniezione di
immunoglobuline umane a un coniglio, il quale produce degli anticorpi della classe IgG antiimmunoglobuline e frazioni del complemento.
Nel siero polispecifico di Coombs (Biotest) si trovano anticorpi IgG anti-IgG (di coniglio) e IgM antiC3d (di topo).
11 Il siero polispecifico di Coombs viene utilizzato per il test di Coombs diretto (DAT – allegato 13) e
indiretto (IAT).
Figura 5: siero polispecifico di Coombs ditta Biotest [16]
3.2.2) Coombs-Control (Coombscell-E ditta Biotest)
Il Coombs-Control (Coombscell-E – ditta Biotest AG, Rupperswil – Figura 8) è una sospensione di
eritrociti sensibilizzati con anticorpi IgG e viene utilizzata per il controllo tecnico del procedimento,
in caso di risultati negativi nel test di Coombs diretto o indiretto.
Figura 8: Coombscell-E ditta Biotest [16]
In caso di risultato negativo, si presuppone che gli anticorpi antiglobuline umane del siero
polispecifico di Coombs siano liberi nella sospensione; con l’aggiunta del Coombs-Control questi
anticorpi si legano agli eritrociti sensibilizzati della sospensione di controllo, provocando
agglutinazione.
12 3.2.3) Soluzione salina
La soluzione salina (Immusol - ditta Medion Diagnostics GmbH, Düdingen, CH) è una soluzione di
sodio azoturo allo 0,4% con un pH stabile a 7,3 ± 0,2 (raccomandazioni indicano un pH tra 7,0 e
7,5). [5]
È utilizzata per il lavaggio degli eritrociti, diluizioni geometriche del plasma e per la preparazione
delle sospensioni eritrocitarie.
3.3) Materiale metodo in gel
3.3.1) ID-Diluent 2
L’ID-Diluent 2 (ditta DiaMed AG, Cressier - Figura 9), chiamato LISS (Low Ionic Strength Solution),
é una soluzione a bassa forza ionica che aumenta il tasso di associazione degli eritrociti
accentuando così le reazioni antigene-anticorpo, permettendo di diminuire il tempo di incubazione.
Questa soluzione è stata studiata per la preparazione di sospensioni di eritrociti. In questo test
viene usata una sospensione allo 0,8%.
Figura 9: ID-Diluent 2 (LISS) [13]
3.3.2) Cartina gel LISS/COOMBS
La cartina LISS/Coombs (ditta DiaMed AG, Cressier - Figura 10) è formata da 6 microprovette
contenenti antiglobulina umana polispecifico (anti-IgG e anti-C3d) nella matrice del gel.
Figura 10: cartina Diamed GEL/Coombs [16]
13 In caso di risultato positivo gli eritrociti agglutinati formano una linea rossa sulla superficie del gel o
sono distribuiti nel gel; con un risultato negativo si ottiene un bottone compatto di eritrociti sul
fondo della microprovetta (Figura 11).
Figura 11: esempio positivo e negativo della reazione in gel [15]
3.4) Metodi
3.4.1) Principio dell’analisi del test di Coombs indiretto
Con questo test si ricerca la presenza di anticorpi liberi nel siero del paziente. Il test si basa sul
principio dell’emoagglutinazione. L’antiglobulina umana agisce come ponte di legame tra gli
anticorpi (Figura 6) o fattore C3d del complemento degli eritrociti vicini e ne provoca
l’agglutinazione (Figura 7). Gli eritrociti che non sono sensibilizzati non si agglutinano.
Figura 6: eritrociti sensibilizzati con IgG [15]
Figura
7:
siero polispecifico
(in verde) [15]
di
Coombs
L’analisi della titolazione anticorpi è basata sul principio del test di Coombs indiretto in gel e
provetta.
14 3.4.2) Principio dell’analisi della titolazione anticorpi
La titolazione anticorpi è un metodo semi-quantitativo per determinare la concentrazione di
anticorpi. Si preparano delle serie di diluizioni geometriche per testare la reattività degli anticorpi. Il
titolo corrisponde all’ultima diluizione che mostra una reazione di 1+ (Esempio: diluizione 1:16;
titolo 16).
Il valore limite del titolo anticorpale è stato stabilito solo per alloanticorpi immuni anti-D (metodo in
provetta): un titolo ≥ 16 è considerato significativo e necessita di successivi controlli.
3.4.3) Titolazione anticorpi anti-eritrocitari in PROVETTA
Dopo un periodo di incubazione a 37°C tra il plasma del paziente diluito (serie di diluizioni
geometriche) e la sospensione di eritrociti selezionati, si procede con una serie di lavaggi per
togliere tutto ciò che non si è legato: proteine del plasma, paraproteine, più eventuali anticorpi non
legati, per evitare risultati falsi positivi. Viene poi aggiunto il siero polispecifico di Coombs per
identificare l’eventuale presenza di eritrociti sensibilizzati. Nel caso di una reazione negativa, il
bottone di eritrociti formatosi sul fondo della provetta dopo centrifugazione, si scioglie facilmente
con delle leggere scosse alla provetta.
Il titolo anticorpale corrisponde all’ultima
microscopicamente con un ingrandimento 20x.
agglutinazione
del
plasma
diluito
visibile
In caso di risultato negativo si deve procedere con l’aggiunta del Coombs-Control.
Figura 12: test di Coombs indiretto [14]
15 Procedura: [11]
1. Preparare delle diluizioni geometriche del plasma con Immusol
Tabella 2: diluizioni geometriche del plasma
Diluizione
1:1
1:2
1:4
1:8
1:16
1:32
1:64
100 μl
100 μl
100 μl
100 μl
100 μl
100 μl
Immusol
-
Plasma
100 μl 100 μl
Trasferire
100μl
100μl
100μl
100μl
100μl
2. Preparare la sospensione eritrocitaria al 2% con eritrociti selezionati (1000 μl Immusol
+ 20 μl eritrociti)
3. Pipettare 100 μl di sospensione in ogni provetta
4. Incubare 1 ora a 37°C (ID-Incubator 37 SI)
5. Lavare gli eritrociti per 3 volte (DAC III)
6. Aggiungere 2 gocce di siero polispecifico di Coombs
7. Centrifugare 20 secondi a 3000 rpm
8. Esaminare il risultato macroscopicamente e microscopicamente (ingrandimento 20x)
9. Ad ogni reazione negativa aggiungere una goccia di Coombscell-E e centrifugare:
•
•
risultato positivo (agglutinazione) indica che il test con il siero polispecifico di
Coombs è realmente negativo.
risultato negativo (nessuna agglutinazione) significa che si è verificato un
errore tecnico nell’esecuzione del test (p.es. lavaggio insufficiente degli eritrociti).
3.4.4) Titolazione anticorpi anti-eritrocitari in GEL
Il seguente metodo è attualmente in uso presso il ST CRS SI. In una prima fase vengono messi a
contatto il plasma del paziente diluito (serie di diluizioni geometriche) con eritrociti test (selezionati
sulla base dell’anticorpo che si vuole titolare); dopo un periodo di incubazione a 37°C si centrifuga
la cartina Gel. Durante la fase di centrifugazione eventuali eritrociti sensibilizzati vengono a
contatto con il siero polispecifico di Coombs, il quale provoca la formazione di una
“macromolecola” che ha difficoltà a precipitare tra le maglie del GEL e da luogo ad una reazione
positiva.
16 Una reazione negativa significa che gli eritrociti test non sono stati sensibilizzati e quindi l’assenza
di alloanticorpi di importanza clinica (gli eritrociti precipitano sul fondo del micro-pozzetto).
Ultimo risultato positivo
visibile con 1+.
Figura 13: serie di diluizioni con ultimo risultato 1+ [16]
Procedura 1 Æ diluizione con ID-Diluent 2 (LISS):
1.
Preparare delle diluizioni geometriche del plasma con ID-Diluent 2 (LISS):
Tabella 3: diluizioni geometriche del plasma
Diluizione
1:2
1:4
1:8
1:16
1:32
1:64
IDDiluent2
100 μl
100 μl
100 μl
100 μl
100 μl
100 μl
Plasma
100 μl
Trasferire
100μl
100μl
100μl
100μl
100μl
2. Preparare la sospensione eritrocitaria allo 0,8% con ID-Diluent 2 (1000μl ID-Diluent 2 +
10μl eritrociti) utilizzando eritrociti selezionati
3. Pipettare 50 μl di sospensione eritrocitaria in ogni pozzetto (cartina LISS/Coombs)
4. Aggiungere 25 μl delle rispettive diluizioni
5. Incubare 15 minuti a 37°C (ID-Incubator 37 SI)
6. Centrifugare 10 minuti (ID-Centrifuge 12 S)
7. Leggere e protocollare i risultati
17 Procedura 2 Æ diluizione con Immusol:
La metodica è identica alla procedura 1 con un'unica modifica: le diluizioni geometriche e la
sospensione eritrocitaria allo 0,8% vengono eseguite con Immusol e non con ID-Diluent 2.
3.5) Possibili fattori influenti sui risultati d’analisi
I fattori che possono influenzare questa analisi possono essere dovuti a problemi tecnici e di
materiale:
Metodo gel:
•
Cartine che presentano bolle d’aria o gocce di gel nella parte superiore del micro pozzetto
devono essere centrifugate prima dell’uso.
•
Eventuali residui di fibrina possono aderire agli eritrociti non agglutinati e farli apparire come
una sottile linea rossa sulla superficie del gel (falso positivo).
Metodo provetta:
•
Il risultato del test deve essere letto immediatamente dopo la centrifugazione in quanto
l’eventuale legame antigene-anticorpo, formatosi in seguito all’aggiunta del siero di
Coombs, è un legame piuttosto debole e tende a dissociare rapidamente per effetto
osmotico: antigene/anticorpo
antigene+anticorpo.
Metodo gel + provetta:
•
Una sospensione di eritrociti troppo concentrata o troppo diluita può causare reazioni
anomale.
•
È importante utilizzare eritrociti con lo stesso fenotipo (per mantenere approssimativamente
il numero di punti antigenici) per un confronto corretto con il plasma analizzato
precedentemente.
•
Eritrociti “vecchi” sono da evitare per un problema di emolisi e di perdita di micro particole
della membrana, che portano alla perdita di numerosi punti antigenici.
Altri fattori influenzanti sono dovuti a fattori umani, non tutti/e i/le tecnici/che in analisi biomediche
lavorano nello stesso modo; ci possono essere delle piccole differenze a livello di:
•
Tecnica di diluizione
-
Diluizioni geometriche
-
Sostituzione puntale nella serie di diluizione
-
Preparazione della sospensione eritrocitaria
•
Lettura ed interpretazione del titolo anticorpale.
•
Risospensione non adeguata del plasma precedentemente congelato
18 4. RISULTATI
Per il confronto tra i due metodi sono stati analizzati 82 campioni di donne in gravidanza alle quali
è stata somministrata la profilassi anti-D, 10 campioni di donne in gravidanza con un anti-D
immune e 3 campioni di donne in gravidanza con altri alloanticorpi (anti-M e anti-E).
Le tabelle con i risultati completi delle tre casistiche sono riportate nell’allegato 1 e allegato 2.
I risultati sono stati rappresentati con degli istogrammi e non con delle linee di tendenza in quanto
sono dei risultati valutati per singolo paziente esaminato con i due metodi.
Nelle figure 14 e 15 sono rappresentati graficamente i risultati degli 82 campioni di pazienti con
anti-D da profilassi analizzati con il metodo in gel con la diluizione in LISS (procedura 1 capitolo
3.4.3) e il metodo in provetta.
Figura 14: grafico dei risultati dei campioni da 1 a 41
19 Figura 15: grafico dei risultati dei campioni da 42 a 82
Come risulta evidente si nota come i risultati ottenuti siano discordanti tra di loro, le analisi
effettuate con il metodo in provetta hanno un titolo di 2-3 diluizioni inferiore al metodo in gel con la
diluizione in LISS.
Nelle figure 16 e 17 sono rappresentati i risultati degli 82 campioni di pazienti con anti-D da
profilassi analizzati con il metodo in gel con Immusol (procedura 2 capitolo 3.4.3) e il metodo in
provetta.
Figura 16: grafico dei risultati dei campioni da 1 a 41
20 Figura 17: grafico dei risultati dei campioni da 42 a 82
A differenza dei grafici nelle figure 14 e 15 si può notare come i risultati ottenuti siano riproducibili
tra loro.
PARTO
22 SDG
25 SDG
20 SDG
Figura 18: decorso di un titolo in una paziente
con anti-D immune
Figura 19: decorso di un titolo in una paziente
con anti-D immune
Nelle figure 18 e 19 sono rappresentati i grafici delle uniche due pazienti con un anti-D immune in
gravidanza.
21 PARTO
20 SDG
17 SDG
25 SDG
Figura 20: decorso di un titolo in una paziente
con anti-D da profilassi
13 SDG
35 SDG
Figura 21: decorso di un titolo in una paziente
con anti-D da profilassi
Le figure 20 e 21 rappresentano i grafici di due pazienti con somministrazione della profilassi antiD che sono state monitorate durante la gravidanza.
22 5. DISCUSSIONE
Come si evidenzia dalle figure 14 e 15 i risultati ottenuti con il metodo gel/LISS e con il metodo in
provetta sono discordanti e non riproducibili proprio come enunciato nello scopo iniziale del lavoro
di diploma. Questo è dovuto sostanzialmente alla differente sensibilità dei metodi utilizzati ed alla
soluzione di diluizione utilizzata (LISS o Immusol): infatti come noto la soluzione LISS funge da
potenziatore ed acceleratore della reazione antigene-anticorpo.
La tecnica d’analisi con il metodo gel (matrice) deve la sua maggiore sensibilità al principio di
filtrazione su colonna, dove gli eventuali complessi antigene-anticorpo formatisi vengono filtrati in
fase di centrifugazione ed intrappolati tra le maglie del gel, dando luogo ad una reazione positiva.
Tutto questo non si verifica con il metodo in provetta, dove dopo l’ultima centrifugazione la lettura
del risultato consiste unicamente nella risospensione degli eritrociti.
È inoltre noto che il metodo in gel è più standardizzato, preciso e oggettivo mentre il metodo in
provetta é più soggetto alla tecnica individuale di lavoro del/della TAB: scuotimento provette
(risultato falsamente negativo) ed interpretazione visiva della reazione a livello macroscopico e
microscopico.
Attualmente non è raccomandato l’utilizzo della tecnica in gel per lo studio della titolazione
anticorpi prenatale, per la mancanza di dati che dimostrino una correlazione tra i titoli ottenuti con
la tecnica in gel e con la tecnica in provetta [1]. Per questo motivo il mio lavoro di diploma risulta
essere una novità in quanto non sono state trovate pubblicazioni riguardanti il paragone dei titoli
ottenuti con le tecniche enunciate.
Le figure 16 e 17 confermano in pratica quanto viene detto in teoria, cioè che soluzioni di
potenziamento della reazione possono aumentare in modo falso il valore del titolo anticorpale non
rispecchiando la situazione reale in vivo.
I risultati ottenuti con la procedura 2 con l’utilizzo dell’Immusol come mezzo di diluizione, ci hanno
permesso di verificare la riproducibilità dei risultati in rapporto al metodo in provetta, raccomandato
dalle normative internazionali ISBT, e di trovare quell’accorgimento necessario per dimostrare che
la metodica in gel è comunque utilizzabile per questo tipo di analisi.
La procedura 1 fornisce dei valori più elevati del titolo rispetto alle altre due procedure, come già
descritto precedentemente (Figure 18-19 e 20-21).
Sul piano strettamente medico, questo non cambia però di molto l’interpretazione del risultato, per
esempio la paziente 1 con la metodica Gel/LISS mostra un aumento del titolo da 4 a 16, mentre
con metodo GEL/NaCl e provetta mostra un aumento del titolo da 1 a 8. Con tutte le metodiche si
nota un aumento del titolo che a livello medico deve suonare come campanello di allarme e fare in
modo che la paziente sia monitorata mensilmente nel corso della gravidanza. In termini di valore
definito dalle normative ISBT il titolo di questa paziente è inferiore al valore limite ≥ 16.
Per quel che concerne la paziente 2 si vede come il titolo determinato con la procedura 1 al parto
mostra un aumento di una diluizione (da 64 a 128), mentre con la procedura 2 e metodo in
provetta si ha un valore stabile di 32 (comunque sopra il valore limite di ≥ 16): in questo caso per
la gravidanza in corso non sussistono particolari problemi in quanto la paziente si trova al parto,
ma ciò va considerato in un’eventuale futura gravidanza, dove, se il bambino dovesse essere Rh
positivo, si potrebbe avere una risposta immunitaria di tipo anamnestico (Figura 1), dove una
minima dose di antigeni fetali D (0,03 ml di sangue) potrebbero causare una rapida produzione di
anticorpi immuni anti-D.
23 Facendo un paragone tra le figure 18 e 19, dove sono riportati i titoli di due pazienti con anticorpi
anti-D immuni, e le figure 20 e 21, dove sono riportati i titoli di due pazienti con un anti-D da
profilassi, si può notare il diverso decorso del titolo anticorpale nel tempo.
Il titolo degli anticorpi anti-D immuni rimane costante o tende ad aumentare nel tempo, mentre il
titolo degli anticorpi anti-D da profilassi tende a diminuire (o per consumo o per degradazione degli
anticorpi).
Le normative internazionali ISBT raccomandano un monitoraggio mensile degli anticorpi nel corso
della gravidanza ma nel mio lavoro di diploma ho potuto verificare che ciò non è sempre rispettato.
Infatti solo i pazienti riportati nelle figure 18-19 e 20-21 sono stati regolarmente monitorati;
sicuramente i medici sono più sensibili alla presenza di alloanticorpi immuni (Figura 18-19) rispetto
alla presenza di anticorpi anti-D da profilassi (Figure 20 e 21) senza curarsi però delle possibili
implicazioni come ad esempio un consumo rapido della profilassi anti-D (passaggio di sangue
fetale > di 25-30 ml) che espone a rischio di immunizzazione la paziente a causa di una mancata
protezione.
Un altro dato che emerge dal mio lavoro di diploma è che i tempi di somministrazione della
profilassi (28a settimana di gravidanza), definiti dalle raccomandazioni dei ginecologi, non sono
sempre rispettati (allegato 1 e 2: settimana di gravidanza e data somministrazione profilassi).
24 6. CONCLUSIONE
L’obiettivo principale del lavoro era quello di confrontare il metodo in Gel (in uso presso ST CRS
SI) ed il metodo in provetta (raccomandato da ISBT) per verificare la riproducibilità dei risultati
ottenuti. Dopo aver modificato la soluzione di diluizione ed aver valutato accuratamente i risultati,
si è giunti alla conclusione che il metodo in Gel con l’utilizzo di soluzione salina Immusol fornisce
gli stessi risultati del metodo in provetta, con al massimo una differenza di una diluizione
riscontrata sui valori bassi del titolo (1 e 2) dovuto alla differente sensibilità del metodo.
Tutti i campioni sono stati analizzati con l’accorgimento adottato nella procedura 2 e sono
considerati come base della validazione del metodo non normalizzato della titolazione anticorpale.
La nuova metodica ed i risultati ottenuti sono già stati sottoposti agli accreditatori del Servizio di
Accreditamento Svizzero (SAS) ed è già stata iscritta nel registro ufficiale delle analisi in
applicazione presso il ST CRS SI.
Il personale del laboratorio di immunoematologia del ST CRS SI è stato informato e ha compreso
le motivazioni che hanno portato all’esecuzione di questo lavoro ed in ultima analisi hanno portato
alla modifica della metodica per la titolazione anticorpi. Per la TAB l’interpretazione dei risultati,
ottenuti con la nuova metodica, non porta dei cambiamenti rispetto a quanto praticato
precedentemente. Il valore del titolo viene sempre commentato sul referto di analisi, dando
indicazioni riguardo alla tendenza (se la paziente ha dei risultati precedenti), e dando
raccomandazioni specifiche ai ginecologi sulla tempistica del monitoraggio dell’anticorpo
identificato.
Per quanto concerne l’interpretazione dei risultati da parte dei ginecologi, si è giunti alla
conclusione, d’accordo anche con l’accreditatore, di non informarli direttamente tutti, ma di
scrivere una frase informativa (“risultato ottenuto secondo nuova metodica” – allegato 12)
direttamente sul referto d’analisi nel caso in cui il titolo attuale, determinato con la nuova
procedura, dovesse essere diverso dal precedente, determinato con la vecchia procedura. Questo
per chiarire degli aumenti o delle diminuzioni del valore del titolo nel corso della stessa
gravidanza. Si lascia libera scelta al medico sulla necessità di richiedere ulteriori informazioni in
merito.
La valutazione dei fattori che possono influenzare il risultato dell’analisi, già descritti nel capitolo
3.5, hanno fatto in modo di sensibilizzare ulteriormente il personale di laboratorio, soprattutto per
quello che riguarda il fattore umano. Tenendo presente l’insieme di questi fattori, all’interno del
laboratorio è stato deciso di accettare come valida al massimo una differenza di una diluizione tra
il controllo del titolo del campione precedente, eseguito in parallelo sul campione odierno e sul
campione congelato, ed il risultato precedentemente ottenuto.
Nel campo ginecologico (da colloquio avuto con la Dr.ssa Sophie Venturelli) gli anticorpi ai quali
viene attribuita un’importanza clinica nell’ambito di un MEN sono: anti-D, anti-C, anti-c, anti-E,
anti-e, anti-Kell e anti-Duffy.
Tra questi anticorpi non risulta l’anti-D da profilassi in quanto per i ginecologi non ha importanza
clinica: da un lato è risaputo che possono passare la placenta, essendo delle immunoglobuline
IgG, causando un’emolisi modesta, dall’altro si ritiene che un consumo rapido delle
immunoglobuline da profilassi iniettate può risultare solo dopo un evento traumatico.
Siccome nel mio lavoro di diploma ho notato che la profilassi anti-D non viene sempre
somministrata alla 28a settimana di gravidanza, ho chiesto al ginecologo il perché di questa
situazione: mi è stato risposto che ci sono alcuni casi particolari che richiedono una profilassi
25 anticipata, come ad esempio prelievo dei villi coriali, amniocentesi, incidenti con traumi…e tutti
quei casi dove ci potrebbe essere uno scambio di sangue fetale con sangue materno.
La regola vuole però che se la profilassi anti-D viene somministrata prima della 28a settimana di
gravidanza deve essere ripetuta ogni 12 settimane. È in questi casi che il ginecologo fa un
monitoraggio dell’anti-D da profilassi per essere a conoscenza se la paziente è ancora protetta
oppure se la profilassi è stata interamente consumata, in questo caso il ginecologo procede con la
somministrazione di una nuova dose.
Sempre secondo la fonte contattata, in Ticino in caso di sofferenza fetale per un MEN conclamato
esistono i seguenti metodi di sorveglianza (allegato 14):
•
Determinazione della bilirubina nel liquido amniotico (curva di Liley).
•
Sonografia doppler per monitorare il cuore che potrebbe essere ingrossato, verificare la
presenza di ascite e la velocità media del flusso dell’arteria cerebrale media (più veloce è il
flusso, più anemico è il bambino).
Nei casi gravi la mamma deve essere trasferita in un ospedale universitario per l’esecuzione di
trasfusioni intra-uterine.
In Ticino attualmente la determinazione del DNA fetale nel sangue materno non è ancora in
applicazione.
Dal colloquio e dalle risposte avute dal ginecologo, è nata un’ulteriore analisi della situazione
presso il laboratorio di immunoematologia del ST CRS SI, tra la capo settore UMTE (Unità di
Medicina Trasfusionale e Emovigilanza) e Dr.Scali (vice primario ST CRS SI), per quanto riguarda
le raccomandazioni riportate sul referto di analisi per le donne in gravidanza Rh negative che
hanno ricevuto la profilassi anti-D. Visto che questo tipo di anticorpi non è ritenuto di importanza
clinica, si è deciso che non verrà più fatta la raccomandazione di monitorare mensilmente il titolo
anticorpale, la decisone sarà prettamente di competenza medica.
Per quanto concerne la questione costi si è a conoscenza che la tecnica in provetta è più
economica della tecnica in gel. Per il ST CRS SI il tutto rimane invariato in quanto la tecnica gel
era già precedentemente utilizzata per quest’analisi.
Come conclusioni personali di questo lavoro posso dire di essere molto soddisfatta dei risultati
ottenuti, in quanto la metodica in Gel con la procedura 2 è già entrata in uso presso il ST CRS SI
ed è già stata sottoposta ed approvata dagli accreditatori del SAS.
È stato un lavoro molto interessante, dove all’inizio ci sono stati alcuni problemi dovuti ai risultati
non comparabili ottenuti con le prime analisi, ma che si è concluso nei migliore dei modi. Mi ha
dato la possibilità di capire il significato di un confronto tra metodi, organizzare il lavoro in modo
autonomo e trarne le dovute conclusioni.
26 7. GLOSSARIO
Alloanticorpo: è un anticorpo rivolto contro un antigene della stessa specie, ma che l’individuo in
esame non possiede. La sua produzione è chiamata alloimmunizzazione.
Alloanticorpo immune: in immunoematologia sono gli alloanticorpi prodotti dopo una
stimolazione del sistema immunitario da parte dell’antigene (che la persona stessa non possiede)
sugli eritrociti. Ciò si realizza unicamente in due modi: trasfusione di sangue e gravidanza/parto.
Antigene: sostanza capace di provocare una risposta immunitaria e poi di reagire
specificatamente con l’anticorpo prodotto.
Immunogenicità: capacità di un antigene a indurre una risposta immunitaria.
Agglutinazione: consiste nella formazione macroscopica di piccoli “grumi” di eritrociti che, nel
metodo in provetta, sembra sabbia fine che non si scioglie agitando delicatamente. Nel metodo in
gel l’agglutinazione va da una linea ben delimitata soprattutto verso l’alto ad una minima velatura
di varia estensione.
Eritrociti sensibilizzati: anticorpi incompleti IgG (non sono in grado di legare
contemporaneamente l’antigene corrispondente situato su due eritrociti diversi) o con
complemento (C3d) che si legano all’eritrocita ma non visibili al microscopio.
Risposta immunitaria primaria: produzione principalmente di IgM, dipendente dalla dose di
antigene, lenta e la produzione anticorpale è debole.
Risposta immunitaria anamnestica: produzione di IgG, indipendente dalla dose, produzione
rapida e abbondante.
Dweak: debole espressione dell’antigene D sulla membrana degli eritrociti dovuto ad una
produzione alterata della proteina RhD dal gene RHD.
Dparziale: difetto qualitativo dell’antigene D; non presenta tutti gli epitopi di un antigene D. in seguito
alla produzione alterata della proteina RhD dal gene RHD.
Eluizione: il legame antigene-anticorpo è reversibile in vitro, gli anticorpi (di solito IgG a caldo)
vengono staccati dai loro antigeni sulla superficie eritrocitaria (allegato 10).
TAB: Tecnico/a in analisi biomediche.
LISS: Low Ionic Strenght Solution (soluzione a bassa forza ionica).
27 8. BIBLIOGRAFIA
Bibliografia testi:
[1]. Mark E., Brecher MD., Techincal Manual – fifteenth edition – Advancing Transfusion and
Cellular Therapies Worldwide, 2005
[2]. Queloz P.-A., Siegenthaler M.A., Conne J., Schneider Ph., Tissot J.-D., Immuno-hématologie
– Bases de médicine transfusionnelle, quatrième édition, 2005
[3]. Harvey G. Klein, David J. Anstee, Mollison’s eleventh edition – Blood Transfusion in Clinical
Medicine, 2005
[4]. Scheda Rhophylac tratta da : Transfusion, volume 48, gennaio 2009, pagina 2
[5]. Raccomandazioni del ST CRS SI, Esami di immunoematologia trasfusionale applicata ai
pazienti, versione 1 a partire dall’01.11.2002
[6]. Scheda ID “LISS/Coombs” – test indiretto e diretto all’antiglobuolina, ditta DiaMed AG
[7]. Scheda “Coombscell-E” – ditta Biotest
[8]. Scheda “Anti-Human-Globulin Color” – ditta Biotest
[9]. Scheda “ID-Diluent 2” – ditta DiaMed AG
[10]. Scali G., Dispense di immunoematologia, Dispense scolastiche di immunoematologia, agosto
2007
Bibliografia immagini:
[11]. http://www.cslbehring-us.com
[12]. http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/c/c1/Blut-EDTA.jpg/120px-BlutEDTA.jpg
[13]. http://www.diamed.ch/product_detail.aspx?id=158&navvis
[14]. http://www.merck.com/media/mmpe/figures/Figure2sec11ch131_eps.gif
[15]. Köchli A. & Tschopp M., Immunobase – Lernsoftware für die Immunohämatologie auf CDROM, Copyright by DiaMed
[16]. Foto scattate da Regazzoni Cinzia presso ST CRS SI
Bibliografia articoli:
[17]. Prophylaxie anti-D de la sensibilisation Rhésus, Raccomandations actualisées de l’Académie
de médecine feto-maternelle du 24 juillet 2005 à Lugano, Forum Med Suisse
[18]. Minon J.-M., Gerard C., Senterre J.-M., Schaaps J.-P., Foidart J.-M., Routine fetal RHD
genotyping with maternal plasma : a four-year experience in Belgium, Transfusion, pag. 373
– 380, volume 48, febbraio 2008
Bibliografia internet:
[19] http://www.isbt-web.org
28 9. RINGRAZIAMENTI
I miei ringraziamenti vanno a tutte le persone che mi sono state vicine e che mi hanno aiutato
nello svolgimento di questo lavoro:
•
Belinda Ryser, che in questi mesi mi è stata di grande aiuto nello svolgimento della parte
pratica, nella stesura del lavoro e nel rispondere alle mie domande.
•
Il Direttore del ST CRS SI Dr. Damiano Castelli per avermi dato la possibilità di svolgere
questo lavoro.
•
La capo laboratorio Letizia Caramazza, Mauro Borri (responsabile qualità e informatica)
e tutto il team del ST CRS SI per l’aiuto fornitomi e il tempo messomi a disposizione.
•
La capoclinica di ginecologia ORBV Dr.ssa Sophie Venturelli per la sua disponibilità.
•
Il Direttore della SSMT di Locarno Andrea Boffini, i docenti Giovanni Togni, Sonja Marci,
Daniela Marcacci e Caludio Naiaretti per i consigli di metodologia, Susan Gilbert per
l’aiuto nella lingua inglese.
29 10. ALLEGATI
Allegato 1: Tabella completa risultati anti-D da profilassi
Allegato 2: Tabella risultati anti-D immuni e altri alloanticorpi
Allegato 3: Metodica originale Siero polispecifico di Coombs della ditta Biotest
Allegato 4: Metodica originale Coombs-control della ditta Biotest
Allegato 5: Metodica originale cartine LISS/Coombs della ditta DiaMed
Allegato 6: Metodica originale ID-Diluent 2 ditta DiaMed
Allegato 7: Immusol Compact – alcuni punti della scheda di sicurezza
Allegato 8: Scheda medicamento Rhophylac300 ditta Behring
Allegato 9: Lotto reagenti utilizzati
Allegato 10: Metodica eluizione acida in uso presso ST CRS SI
Allegato 11: Metodica titolazione anticorpi in uso presso ST CRS SI (nuovo metodo)
Allegato 12: Comunicato riunione interna laboratorio ST CRS SI del 09.04.2009
Allegato 13: Spiegazione analisi Coombs diretto
Allegato 14: Metodi di sorveglianza per gravidanze a rischio
Allegato 15: Exanguino trasfusione
30 ALLEGATO 1: tabella completa risultati anti-D da profilassi
NR.
1
Data
analisi
20.12.2008
Settimana di
gravidanza
data somministrazione
profilassi
Gel/LISS
Gel/NaCl
Provetta
36 1/7
18.11.2008
4
1
0
2
17.12.2008
38
16.10.2008
2
1
0
3
28.11.2008
32 5/7
11.2008
8
2
1
4
08.11.2008
27 6/7
10.10.2008
8
2
1
5
03.11.2008
parto
22.09.2008
8
2
1
6
03.12.2008
38
29.09.2008
2
1
0
7
02.10.2008
29 5/7
08.07.2008
1
1
0
8
29.11.2008
37 6/7
20.10.2008
4
2
1
9
27.11.2008
36 2/7
27.10.2008
4
2
1
10
23.01.2009
ND
11.2008
4
1
1
11
24.11.2008
17
17.11.2008
32
16
16
12
19.12.2008
20 3/7
17.11.2008
8
2
2
13
23.01.2009
25 3/7
17.11.2008
2
1
0
14
16.01.2009
31
19.12.2008
8
2
2
15
18.12.2008
ND
20.10.2008
2
1
0
16
14.01.2009
35
18.11.2008
2
1
0
17
28.11.2008
28 6/7
06.11.2008
16
4
4
18
26.11.2008
30
24.07.2008
4
2
2
19
21.11.2008
19
06.11.2008
8
4
4
20
19.11.2008
ND
16.06.2008
1
1
0
21
13.01.2009
36
11.2008
2
1
1
22
15.10.2008
37
28.08.2008
2
1
1
23
13.10.2008
ND
12.10.2008
8
2
2
24
17.12.2008
Aborto
12.10.2008
2
1
1
25
21.08.2008
35 5/7
21.07.2008
8
4
4
26
17.08.2008
Parto
6.2008
4
2
2
27
26.09.2008
33
29.08.2008
8
2
2
28
08.07.2008
38
05.05.2008
2
1
0
29
02.06.2008
13
26.05.2008
16
8
8
30
04.11.2008
35
07.08.2008
1
1
0
31
09.12.2008
Parto
11.2008
8
2
2
32
26.01.2008
27
06.11.2008
2
1
0
33
20.12.2008
32
02.12.2008
8
4
2
34
10.01.2009
Parto
22.12.2008
8
2
2
35
20.01.2009
Parto
17.11.2008
2
1
0
36
24.12.2008
36
15.12.2008
8
2
2
37
22.01.2009
Parto
15.12.2008
2
1
0
38
05.12.2008
26 5/7
24.11.2008
8
2
2
31 NR.
Data
analisi
Settimana di
gravidanza
data somministrazione
profilassi
Gel/LISS
Gel/NaCl
Provetta
39
27.11.2008
17
22.10.2008
8
2
2
40
24.10.2008
16
19.09.2008
8
2
2
41
11.01.2009
Parto
12.2008
4
1
0
42
15.12.2008
33
ND
4
1
0
43
13.10.2008
TC
11.09.2008
8
2
2
44
06.10.2008
TC
7.2008
2
1
0
45
16.09.2008
20 2/7
16.07.2008
2
1
0
46
13.08.2008
Parto
13.06.2008
4
2
2
47
12.08.2008
33
08.07.2008
4
1
1
48
04.08.2008
Parto
19.06.2008
4
1
1
49
05.02.2009
32
07.01.2009
8
2
2
50
09.01.2009
36
17.12.2008
4
2
2
51
04.02.2009
20 3/7
29.12.2008
4
2
2
52
31.07.2008
28 5/7
23.06.2008
4
1
0
53
16.09.2008
35 3/7
23.06.2008
1
1
0
54
24.07.2008
33
01.07.2008
8
4
4
55
14.07.2008
ND
02.07.2008
32
8
8
56
04.07.2008
32
03.06.2008
8
2
2
57
04.07.2008
35 3/7
21.05.2008
4
1
1
58
17.08.2008
37
21.05.2008
1
1
0
59
13.02.2009
37
11.12.2008
4
1
0
60
13.02.2009
25
13.11.2008
16
1
1
61
17.02.2009
36
ND
2
1
0
62
24.02.2009
12
19.01.2009
16
4
4
63
02.03.2009
ND
22.12.2008
2
1
1
64
03.03.2009
28
06.02.2009
16
4
4
65
04.03.2009
30 2/7
25.01.2009
4
2
2
66
04.03.2009
31
26.01.2009
8
2
1
67
04.03.2009
ND
11.02.2009
8
2
2
68
05.03.2009
35
20.02.2009
2
1
1
69
06.03.2009
24 3/7
21.01.2009
16
1
1
70
16.03.2009
36
19.01.2009
2
1
1
71
17.03.2009
Parto
16.01.2009
2
1
0
72
16.03.2009
28
aborto 08.08
2
1
1
73
17.03.2009
37
15.01.2009
2
1
1
74
18.03.2009
25 6/7
12.2008
2
1
0
75
22.03.2009
31 4/7
ND
8
2
2
76
01.04.2009
Parto
30° sett.
2
1
0
77
10.04.2009
36 6/7
18.02.2009
4
2
1
78
16.04.2009
18
09.04.2009
8
4
4
79
20.04.2009
33
31.03.2009
8
4
2
32 NR.
Data
analisi
Settimana di
gravidanza
data somministrazione
profilassi
Gel/LISS
Gel/NaCl
Provetta
80
06.04.2009
31
31.03.2009
16
4
4
81
21.04.2009
31 2/7
10.02.2009
8
4
2
82
22.04.2009
34
18.03.2009
4
1
1
ALLEGATO 2: tabella risultati anti-D immuni e altri alloanticorpi
Risultati campioni con anti-D immune
Settimane di
gravidanza
Gel/LISS
Gel/NaCl
Provetta
30.09.2008
ND
4
1
0
2
14.10.2008
ND
4
1
0
3
28.10.2008
20
4
1
0
4
14.11.2008
22
8
2
2
5
26.11.2008
25
8
2
2
6
10.12.2008
ND
8
2
2
7
29.12.2008
ND
16
8
8
8
05.09.2008
ND
64
32
32
9
14.09.2008
ND
64
32
32
10
11.09.2008
parto
128
32
32
Settimane di
gravidanza
Gel/LISS
Gel/NaCl
Provetta
NR.
1
Data
analisi
Risultati campioni con altri alloanticorpi
NR.
Data
analisi
1
01.04.2009
13 6/7
8
2
2
anti-M
2
02.03.2009
12
16
1
1
anti-E
3
03.04.2009
16 5/7
16
1
1
anti-E
33 ALLEGATO 3: Metodica originale Siero polispecifico di Coombs della ditta Biotest
34 ALLEGATO 4: Metodica originale Coombs-control della ditta Biotest
35 ALLEGATO 5: Metodica originale cartine LISS/Coombs della ditta DiaMed
36 37 ALLEGATO 6: Metodica originale ID-Diluent 2 ditta DiaMed
38 ALLEGATO 7: Immusol Compact – alcuni punti della scheda di sicurezza
39 ALLEGATO 8: Scheda medicamento Rhophylac300 ditta Behring
40 ALLEGATO 9: Lotto reagenti utilizzati
• Anti-Human-Globulin Color (siero plispecifico di Coombs)
1) LOTTO: 1735030
EXP: 18.12.2009
2) LOTTO: 1815140
EXP: 29.06.2010
• Coombscell-E (coombs-control)
1) LOTTO: 1902011
EXP: 24.02.2009
2) LOTTO: 1906011
EXP: 24.03.2009
3) LOTTO: 1910011
EXP: 21.04.2009
• Cartina DiaMed Liss/Coombs
1) LOTTO: 50531.48.01
EXP: 01.2010
2) LOTTO: 50531.51.01
EXP: 05.2010
3) LOTTO: 50531.51.07
EXP: 05.2010
• ID-Diluent 2 (LISS)
1) LOTTO: 05761.10.10
EXP: 09.2010
2) LOTTO: 05761.16.10
EXP: 11.2010
3) LOTTO: 05761.18.10
EXP: 12.2010
41 ALLEGATO 10: Metodica eluizione acida in uso presso ST CRS SI
42 ALLEGATO 11: Metodica titolazione anticorpi in uso presso ST CRS SI (nuovo metodo)
43 ALLEGATO 12: Comunicato riunione interna laboratorio ST CRS SI del 09.04.2009
“Titolazione anticorpi in gravidanza:
ci sono gravidanze in corso, per le quali ovviamente il titolo era stato eseguito con la diluizione in
LISS. Per poter paragonare correttamente i risultati, il titolo di paragone (vecchio siero) deve
essere eseguito con vecchia metodica in LISS. Se i risultati corrispondono OK. Nuovo titolo
(nuovo campione) da eseguire con nuova metodica con diluizione con Immusol. Se ci sono grandi
differenze di risultato, sul referto analisi scrivere valore titolo e tra parentesi (risultato ottenuto
secondo nuova metodica). Se il medico avrà delle domande in merito, sarà compito suo
contattarci per informazioni.”
ALLEGATO 13: Spiegazione analisi Coombs diretto
Il Coombs diretto è un test con il quale si ricerca la presenza di eritrociti sensibilizzati in vivo con
anticorpi (auto o allo) o frazioni del complemento. Gli anticorpi presenti nel siero di Coombs
reagiscono provocando agglutinazione quando trovano eritrociti sensibilizzati (ricoperti da anticorpi
o frazioni del complemento) in:
• Anemia emolitica autoimmune (AIHA): produzione anormale di autoanticorpi rivolti contro i
propri antigeni da parte del sistema immunitario.
• Reazione trasfusionale emolitica (effetto Booster): presenza di alloanticorpi non rilevati dai
test pre-trasfusionali, perché sotto il limite di detezione possibile (ca. 10 ng/ml). In caso di
trasfusione incompatibile, questi alloanticorpi si legano agli eritrociti trasfusi dando un risultato
positivo del test di Coombs diretto.
• Morbo Emolitico del Neonato: eritrociti del neonato sensibilizzati da alloanticorpi materni che
hanno passato la placenta.
ALLEGATO 14: Metodi di sorveglianza per gravidanze a rischio
• Determinazione della densità ottica del liquido amniotico: fornisce un ottimo indice di
emolisi intrauterina. Il liquido amniotico è ottenuto inserendo un lungo ago attraverso la parete
addominale della madre fino alla cavità uterina; il liquido aspirato viene scansionato con un
fotometro con una lunghezza d’onda da 350 a 700 nm: il picco di assorbanza della bilirubina
corrisponde a 450 nm.
• Punzione del cordone ombelicale (cordocentesi): per la determinazione di ematocrito ed
emoglobina. Questa tecnica è purtroppo invasiva ed è importante accertarsi che il campione
prelevato contenga esclusivamente sangue fetale.
• Sonografia doppler: per la determinazione della velocità del flusso sanguigno dell’arteria
cerebrale media (tecnica non invasiva).
44 ALLEGATO 15: Exanguino trasfusione
In un neonato con un MEN, nei casi più gravi, si deve procedere con l’exanguino-trasfusione che
consiste nel cambiare completamente il sangue del bambino per:
•
Rimuovere gli eritrociti sensibilizzati
•
Rimuovere gli anticorpi materni
•
Rimuovere la bilirubina
•
Rimpiazzare gli eritrociti del bambino (trattamento per l’anemia)
La scelta dei concentrati per la trasfusione è un passaggio molto importante in quanto si devono
rispettare alcune “regole”:
•
Gli eritrociti scelti per l’exanguino-trasfusione devono essere compatibili con l’anticorpo
all’origine del MEN
•
Si usano eritrociti di gruppo 0 e plasma AB
•
I concentrati eritrocitari devono essere deleucocitati, non più vecchi di 5 giorni (a causa del
rapido aumento del potassio nel concentrato eritrocitario) e possibilmente irradiati per evitare il
rischio di trasmissione di citomegalovirus
Alla nascita, una bilirubinemia si vede normalmente durante la prima settimana di vita (ittero
fisiologico). Quando la bilirubina non coniugata attraversa la barriera cerebrale e si deposita nei
gangli basali e nel cervello può causare un danno al sistema nervoso centrale: spasticità, letargia,
respirazione irregolare,…(ittero nucleare).
Un exanguino-trasfusione rimuove approssimativamente il 25% di bilirubina totale e il 70-90%
degli eritrociti circolanti.
45