Immunità Umorale
I linfociti B
La produzione dei linfociti B
avviene nel midollo osseo, ma
viene completata negli organi
linfoidi periferici (ad es. la milza).
Identificazione
Tramite marcatori di membrana (CD) che
oltre ad identificare le sottopopolazioni hanno
attività uniche
CR1 (CD 35)
CR2 (CD 21)
CD 19
BCR
CD 20
Ig-α
Ig-β
FcγRII
CD 32
HLA-DR
Repertorio Anticorpale
E’ dato da tutte le
specificità anticorpali
disponibili in un
individuo.
1011
Il numero di
anticorpi con
specificità
diversa per
ciascun individuo
dipende dal
numero di lif.B
che possiede e
dal numero di Ag
con cui è venuto
in contatto
Riarrangiamento genico
Ciascun tipo di
segmento genico è
presente in più
copie nel genoma
germinale.
Durante il
riarrangiamento
genico, la
selezione di un
segmento
caratterizzante
ogni variante
avviene
casualmente per
assicurare la
variabilità
Dopo che i
linfociti B
hanno
incontrato e
sono stati
attivati dall’Ag
avvene
l’ipermutazione
somatica.
Mutazioni
puntiformi
nella regioni V,
per un
ulteriore
variabilità
Sono presenti molti segmenti genici che insieme
codificano per la regione VARIABILE
Numero di segmenti genici funzionali nei loci delle Ig umane
Segmento
Catene
leggere
Catene
pesanti
κ
λ
H
Variabile (V)
40
30
65
Diversità (D)
0
0
27
Giunzione (J)
5
4
6
ORGANIZZAZIONE DEI LOCI
14q32.33 regione
del locus IGH
IgH
NELL’UOMO NELLA LINEA GERMINATIVA
Momento cruciale della differenziazione B-linfocitaria Agindipendente è il riarrangiamento dei geni VH delle Ig.
Inizia con la traslocazione di uno o più dei geni D (diversity)
accanto a uno dei geni JH (joining) e la delezione del DNA
compresa fra i due geni. La traslocazione DJ si verifica su
entrambi i cromatidi del cromosoma 14. Le fasi successive
avvengono in uno solo, dove uno dei 45 o più geni VH (variable)
viene traslocato accanto al DJ e forma un complesso
continuo VDJ che codifica per l'intera regione variabile
della catena pesante μ. Si forma così un trascritto VHDJH-Cμ
che viene prima elaborato con eliminazione delle zone
‘ridondanti’ (splicing dell’ mRNA) e poi tradotto in una catena
pesante μ.
Linf. pro-B: derivano dalla cellula
staminale, si distinguono dalle altre
cellule immature per l’espressione di
molecole di superficie ristrette allo
stipite B (CD19 e CD10). Nel
citoplasma esprimono il TdT
(deossinucleotidil transferasi
terminale), enzima tipico di tutti i
linfociti immaturi, B e T che è
importante per il processo di
rimaneggiamento dei geni delle Ig e
del TCR.
Nei linf. pro-B precoci si ha il
riarrangiamento del locus della
catena pesante che porta al
congiungimento dei segmenti D con
uno dei segmenti J, accompagnato
dalla delezione del tratto di DNA
interposto; successivamente nei
linfociti pro-B tardivi uno dei
segmenti genici VH si collega al
complesso DJH.
ORGANIZZAZIONE DEI LOCI
IgK
NELL’UOMO NELLA LINEA GERMINATIVA
regione del locus IGK
11.2
Si inizia dalla catena κ (in uno dei due cromosomi
2), con un riarrangiamento VJκ che segue le
stesse regole utilizzate dal cromosoma 14 per le
catene H (la differenza è l'assenza del segmento
D). Un riarrangiamento produttivo VJκ porta ad un
adeguato trascritto e alla successiva traduzione di
una catena leggera κ. In un terzo circa dei piccoli
linfociti pre-B, il riarrangiamento VJκ è improduttivo
sia sul primo che sul secondo cromosoma.
Il primo riarrangiamento (VDJ)
si verifica in cellule grandi e
attivamente proliferanti.
Il risultato finale del
riarrangiamento è testimoniato
dalla presenza dei linfociti
pre-B, che presentano nel
citoplasma catene pesanti μ non
accompagnate da alcuna catena
leggera. I grandi linfociti preB differenziano a piccoli
linfociti pre-B che smettono di
proliferare e si dedicano alla
differenziazione iniziando a
riarrangiare i geni che
codificano per le catene L
secondo una ben precisa
gerarchia.
Linf. pre-B: contengono nel loro
citoplasma catene pesanti μ libere.
Una piccola percentuale
delle catene
citoplasmatiche μ vengono
espresse sulla superficie
cellulare in associazione con
una catena leggera
sostitutiva non polimorfica,
diversa dalle catene L k e λ,
formando i recettori pre-B,
l’espressione dei quali è
necessaria per stimolare la
proliferazione e far
proseguire la maturazione
dei linfociti B.
ORGANIZZAZIONE DEI LOCI
11.22
regione del
locus IGH
IgL λ NELL’UOMO NELLA LINEA GERMINATIVA
Il processo prosegue con il riarrangiamento in uno dei due
cromosomi 22 (catene leggere λ). La catena leggera (κ o λ) è
immagazzinata in vescicole del reticolo endoplasmatico dove si
lega alla catena pesante μ. Le molecole di IgM complete
vengono portate nella regione del Golgi e successivamente
inserite nella membrana.
Il linfocita pre-B è così diventato un linfocita B vergine
sIgM+ che, attraverso il meccanismo di splicing dello RNA,
produce anche IgD con la stessa specificità antigenica delle
IgM che a queste si affiancano sulla superficie. I linfociti B
maturi pronti per essere esportati negli organi linfoidi
periferici sono quindi sIgM+, sIgD+.
Linf. B immaturi: producono una catena leggera k o λ, che si associa alla catena pesante μ
formando IgM monomeriche, espresse sulla membrana cellulare, dove svolgono la funzione di
recettore antigenico. Non possiedono più catene μ citoplasmatiche e perde la positività per la
TdT.
Questi stadi avvengono nel midollo osseo e sono antigene indipendenti.
I linf. B immaturi non proliferano né si differenziano in
risposta all’Ag. Ma l’incontro con un Ag le porta in
apoptosi o alla inattivazione funzionale.
Ciò è in relazione
alla selezione
negativa dei linf.
per la tolleranza al
self.
I linfociti immaturi
trattati con Ab antiIgM , non esprimono
IgM facilmente sulla
membrana, anche
con quantità basse
di Ab, la scomparsa
di esse non è seguita
da risintesi, come
avviene nei B maturi
La sequenza di DNA che codifica per la regione V si forma con la
ricombinazione somatica di frammenti genici fra loro separati
Meccanismi di riarrangiamento genico della regione variabile
La RICOMBINAZIONE V(D)J corretta è regolata da sequenze
conservate di DNA non codificante adiacenti al punto di ricombinazione
(sequenze-segnale di ricombinazione (RSSs): Eptamero -Spaziatotenonamero
L’organizzazione delle RSSs è tale che la ricombinazione unisce sempre un
segnale 12 a un segnale 23 (REGOLA 12/23, che assicura il riarrangiamento
nell’ordine corretto)
LA RICOMBINAZIONE V(D)J
Giunzione per delezione: i segmenti
genici da congiungere hanno lo stesso
orientamento trascrizionale. Questo
processo da origine a 2 prodotti una
riarrangiata VJ che è la giunzione
codificante
e
un
prodotto
di
delezione (RSS-giunzione segnale e
DNA interposto)
Giunzione per inversione: i segmenti
genici
hanno
orientamento
trascrizionale opposto. In questo
vengono mantenute le RSS-giunzione
segnale
e
DNA
interposto,
e
l’orientamento di uno dei 2 segmenti
congiunti viene invertito
La RICOMBINAZIONE V(D)J Coinvolge enzimi linfocitari
• Specifici
• Ubiquitari (DNA ligasi) e DNA Ku
V(D)J RICOMBINASI: RAG-1 e RAG-2 (Specifici per il sistema
linfoide)
Taglio endonucleotidico (RAG1 e
RAG2) : RAG1 riconosce il nonamero
I complessi proteici si legano fra loro
avvicinando i segmenti che si devono
ricongiungere
Il DNA viene tagliato in modo da formare
delle strutture a forcina nelle terminazioni
dei segmenti delle Ig
Alle strutture a forcina e alle terminazioni
aperte delle RSS si legano gli enzimi
riparativi (ligasi: Ku70:Ku80 etc)
Le forcine di DNA vengono tagliate
casualmente. Possono essere aggiunte delle
basi dalla TdT oppure eliminate da un’
endonucleasi per generare tagli imprecisi.
La DNA ligasi IV ricongiunge le
terminazioni si forma la GIUNZIONE
CODIFICANTE
AGGIUNTA DEI NUCLEOTIDI PER RIPARARE ROTTURE ASIMMETRICHE
O PER GENERARE NUOVE SEQUENZE
DOMINI DELLE PROTEINE Ig
Linfociti B maturi vergini (naive): caratterizzati dalla co-espressione di
IgM e IgD sulla superficie cellulare, oltre ai recettori C3 per il
complemento, Fc per le Ig, e di antigeni MHC di seconda classe. Su ogni
cellula entrambi gli isotipi espressi sono dotati di una medesima regione V ed
hanno pertanto un’identica specificità antigenica.
STADI DELLA MATURAZIONE DEI LINFOCITI
DIVERSIFICAZIONE DEI GENI PER IL RECETTORE PER L’ANTIGENE NELLE CELLULE B
(RICOMBINAZIONE SOMATICA)
Un’ulteriore diversità anticorpale che avviene nelle unità geniche riarrangiate delle
regioni V
• Mutazioni con sostituzioni nucletodiche e non per delezioni o inserzioni
• Avviene nei centri germinativi degli organi linfoidi secondari dopo
un’immunizzazione con un Ag per dotare i recettori dei linf. B di maggiore affinità
per l’Ag. Selezione di
cellule B con maggiore affinità MATURAZIONE DI
AFFINITA’
© 2005 Elsevier
GLI ANTICORPI
STRUTTURA E FUNZIONE
DELLE VARIE CLASSI DI
IMMUNOGLOBULINE
Paul Erlich
1894 “Ipotesi della catena laterale”
1950 “ Selezione clonale delle cellule B”
David Talmage and Sir Frank Macfarlane Burnet
1936 Karl
Landsteiner
“Il sistema
immunitario può
reagire con un
numero illimitato di
Ag”
1940 Linus Pauling
Teroria dell’”Istruzione”
“Ab molecole flessibili che si
modellano con l’Ag”
GLI ANTICORPI
(Effettori della risposta
adattativa umorale)
Siti di legame
per l’antigene
Gli Ab o immunoglobuline (Ig)
sono glicoproteine multimeriche,
appatenenti alla famiglia delle
GLOBULINE (proteine globulari
del siero).
Sono prodotte in risposta ad un
Ag e sono capaci di formare un
legame specifico con la sostanza
che li ha indotti.
Si trovano in forma solubile, o
sono espresse nelle mebrane dei
linf.B
Catena
leggera
C
C
Catena
pesante
Le Ig, sono costituite da due tipi
di catene legate da ponti S-S, e
da una quota di 4-18% di
carboidrati.
L'unità di base delle Ig ha un PM
di ~150 KD. Consta di due
catene leggere L (light) e di due
pesanti H (heavy). Le catene
sono unite tra loro soprattutto
da ponti S-S ed in minor misura
da forze non covalenti.
Ciascuna catena è costituita da una
parte costante (CH e CL) ed una
variabile (VH e VL). Nelle regioni V, equivalenti
al sito di legame per l'Ag la sequenza di Aa varia nei diversi anticorpi.
Le catene sono ripiegate tridimensionalmente in loops o domains (domini
globulari), determinati da legami S-S intracatena: le catene leggere hanno una
sola VL ed una CL. Le pesanti hanno invece VH, CH1, CH2, CH3.
FRAMMENTI PROTEOLITICI DI UNA IMMUNOGLOBULINA
Le molecole Ig sono
clivate dagli enzimi
papaina (A) e pepsina
(B).
La digestione con
papaina permette la
separazione di due
frammenti in grado di
legare l’antigene
(frammenti Fab), dalla
porzione dell’anticorpo
IgG che attiva il
complemento e che si
lega ai recettori Fc
(frammento Fc).
La digestione con
pepsina genera un
singolo frammento
bivalente in grado di
legare l’antigene F(ab’)2
CLASSI E SOTTOCLASSI
DELLE Ig
Nell’uomo esistono 5 classi principali
ed
alcune
proprietà
sottoclassi
carica…),
(opsonizzazione)
dipendono
Ig
chimico-fisiche
molecolare,
(reazione
di
con
e
l’Ag)
con
(peso
biologiche
sierologiche
diverse
che
dalla struttura primaria
delle catene pesanti.
Si distinguono 5 tipi di catene pesanti
che determinano la classe dell’Ab
Catene δ
Catene ε
Catene α
Catene μ
Catene γ
Caratteristiche delle IgM
Possono trovarsi sia in forma:
• MONOMERICA (presenti
sulla membrana del linfocita B
maturo)
• PENTAMERICA (circolanti
nel siero).
•Sono le prime Ig ad essere
prodotte durante la risposta
immunitaria.
•Sono presenti in
concentrazioni piuttosto basse
(5-10%).
•Hanno un’elevata capacità di
attivazione del complemento.
Basta che una sola
molecola di IgM si leghi ad
un antigene per attivare la
prima cellula del
complemento, questo
innesca una cascata di
reazioni che provoca la
perforazione delle cellule
nemiche e la loro morte.
STRUTTURA DI UNA IgM DI MEMBRANA
Le IgM hanno un
dominio in più nella
catena pesante rispetto
alle IgG ed ha porzioni
citoplasmatiche che
ancorano la molecola
alla membrana.
Caratteristiche delle IgG
• Sono le più abbondanti nel siero (~80%). Sono le uniche
Ig veramente efficace conto i batteri, le loro tossine, i
virus e gli altri agenti infettivi più diffusi.
• Sono in grado di legarsi ad un gran numero di
polimorfonucleati (granulociti, macrofagi e cellule NK).
• Sono in grado di attivare il complemento (Attraverso
la via classica; tranne il sottotipo IgG4)
• Sono in grado di attraversare la placenta
• Si presentano come MONOMERI
STRUTTURA DELLE IgG
I siti che legano l’Ag sono formati
dalla giunzione di domini variabili di
catene leggere (VL) e catene pesanti
(VH).
Catene pesanti in blu e rosso.
Catene leggere in verde e i
carboidrati sono mostrati in grigio
Si possono distinguere 4 sottoclassi: IgG1,
IgG2, IgG3, IgG4. Le sottoclassi 1 e 3
stimolano la reazione del complemento e
intervengono nella risposta immunitaria
secondaria
STRUTTURA DELLA CATENA LEGGERA DI UN ANTICORPO
VL
CL
VL
CL
Le regioni varabili (V) e costanti (C) si ripiegano
indipendentemente in due domini IG. Ogni dominio è
composto da due serie antiparallele di foglietti b (le
frecce rosse e gialle). I tratti blu si riferiscono a due
ponti disolfuro.
LEGAME DI UN ANTIGENE ALL’ANTICORPO
Caratteristiche delle IgA
Rappresentano la II classe di Ig circolanti con ~ il 10-15%.
Si trovano in % molto alta nelle secrezioni:Latte, saliva, lacrime,
secrezioni nasali)
e a livello delle mucose del tratto bronchiale e
digerente dove impediscono l’aderenza dei microrganismi all’epitelio
impedendone la proliferazione
Esistono sottoclassi IgA1 e 2, le IgA1 prevalgono nel siero, le IgA2 nelle
secrezioni, anch’esse dipendono da differenze antigeniche nella CH. Le IgA
secretorie si trovano esclusivamente nelle secrezioni esterne, (lacrime, saliva,
secrezioni intestinali, colostro), in cui il rapporto IgG/IgA è <1
In quelle non in contatto con l'esterno (sinovia, liquido amniotico, pleurico
e peritoneale) il rapporto IgG/IgA è di 5:1, simile a quello del siero.
Le IgA che vengono immagazzinate
nelle secrezioni mucose sono prodotte
in forma dimerica, mentre quelle
presenti nel siero sono in forma
monomerica;
Le IgA assorbite dal circolo sanguigno
sono molto poche e infatti
rappresentano soltanto il 25% delle Ig
sieriche totali.
IgA e IgG e Immunità neonatale
Nel latte materno sono presenti grandi quantità di IgA e di IgG,
che vengono ingerite dal neonato e vanno a sterilizzarne l'apparato
digerente proteggendolo dalle intrusioni di eventuali microbi. Le IgA
sono molto importanti per la trasmissione di una prima forma di
difesa dalla madre al lattante, che nei primi sei mesi di vita è
incapace di produrre anticorpi suoi.
Le IgG, inoltre, vengono anche assorbite nel circolo neonatale
IgE
Sono presenti nel siero alla concentrazione
di 0.003%
•Una volta prodotte, si legano ai recettori
per il frammento Fc espresso dai mastociti,
si aggregano e danno inizio ad un processo
detto di DEGRANULAZIONE mediante il
quale si liberano i mediatori chimici
•Negli individui non allergici, un’elevata concentrazione di
IgE indica una infestazione di tipo parassitario.
Caratteristiche delle
IgD
•Si presentano come monomeri.
•Costituiscono circa l’1% delle Ig circolanti.
•La loro funzione
non è chiara: sembra che
funzione di recettore per l’antigene.
abbiano
LINFOCITI B: COESPRESSIONE DI IgM E IgD
Le IgD si ritrovano soltanto sulla superficie dei linfociti B immaturi,
assieme alle IgM, ed hanno come unica funzione quella di attivare i
linfociti B e di promuovere la loro maturazione verso lo stadio di
plasmacellule quando vengono a contatto con l‘Ag per il quale sono
specifiche.
ISOTIPI DEGLI ANTICORPI UMANI
Isotipo dell’
anticorpo
Sottotipo
IgA
IgA1, 2
IgD
IgE
IgG
IgM
Nessuno
Nessuno
IgG1-4
Nessuno
Catena H
Concentr.
nel siero
(mg/ml)
Emivita
Plasmatica
(giorni)
Funzioni
a (1 o 2)
3.5
6
Immunità delle
mucose
3
Recettore per l’ag
dei linfociti B
naive
2
Ipersensibilità
immediata, difesa
contro gli elminti
23
Opsonizzazione,
attivazione del
complemento,
citotossicità Abdipendente e
cellulare,
immunità
neonatale,
feedback inibitorio
delle cellule B
5
Recettore per l’Ag
dei linfociti B
naive, attivazione
del complemento
d
e
g (1,2,3 o 4)
m
Tracce
0.05
13.5
1.5
PROCESSI DI SELEZIONE NELLA MATURAZIONE LINFOCITARIA
Il linfocita pre-B è così diventato un linfocita B vergine sIgM+ che, attraverso il
meccanismo di splicing dello RNA, produce anche IgD con la stessa specificità
antigenica delle IgM che a queste si affiancano sulla superficie. I linfociti B maturi
pronti per essere esportati negli organi linfoidi periferici sono quindi sIgM+, sIgD+.
FLESSIBILITA’ DELLE MOLECOLE ANTICORPALI
I due siti anticorpali che legano l’Ag si possono legare contemporaneamente a due
determinanti separati da distanze diverse.
(A) la molecola di Ig si lega a due epitopi espressi su una membrana cellulari ben
distanziati fra loro.
(B) lo stesso anticorpo si lega a due determinanti situati in posizione ravvicinata.
Tale flessibilità è dovuta alla regione cerniera localizzata tra il primo e il secondo
dominio costante della catena pesante (CH1 e CH2) che consente il movimento dei siti
combinatori in maniera indipendente dal resto della molecola.
Gli Ab promuovono l’eliminazione dell’Ag
Il legame Ab - Ag
attraverso vari
meccanismi
inattiva
gli antigeni tramite
Neutralizzazione
Virus
Agglutinazion
e
di cellule
Precipitazione di Ag
in soluzione
Attivazione del
complemento
Batteri
Molecole del
complemento
Molecole di Ag
Batterio
Cellula estranea
Favoriscono la
Fagocitosi
Macrofago
Porta alla
Lisi della cellula
sistema immunitario
54