L’analisi delle sequenze in
virologia
La variabilità dei virus
• Basi genetiche
– Elevato tasso di replicazione
– Errori delle polimerasi virali
• RNA polimerasi
• Trascrittasi inversa
La variabilità di HIV
In un individuo con infezione da HIV
• 1010 virioni/giorno
• RT: 1 errore /2000-5000 nts
• Solo alcuni mutanti sono vitali
• Una mutazione adattativa in env ogni 2,5
mesi
•
•
•
•
Mutazioni
Delezioni/dupplicazioni
Ricombinazioni
Riassortimento
• Selezione da parte del substrato
(adattamento)
• Pressione selettiva da parte dell’immunità
• ……………………
• Selezione di varianti resistenti in presenza
del farmaco
Il genoma virale
• regioni altamente variabili
• regioni conservate
Virus dell’epatite C: funzioni del genoma
% nucleotide homology
92
81
55
65
57
70
Structural region
5’
UTR
C
Capsid/core
66
26
Non srtructural region
E2/
E1
NS2
NS1
Envelope
glycoproteins
65
NS3
helicase/
protease
5’UTR conservata. Specifici polimorfismi
E2 possiede regioni variabili e ipervariabili (aa 1-27)
NS4
NS5
3’
UTR
RNA-dep RNA-Pol
6 genotipi, diversi sottotipi
In env (gp120) regioni ipervariabili
V1-V5 alternate a regioni relativamente costanti C1-C5
Sottopopolazioni eterogenee e mutevoli
all’interno dello stesso individuo
Dominio immunodominante altamente conservato in gp41
Identificazione e tipizzazione
• Subtipizzazione (intratipica): polio
selvaggio da vaccinale, influenza ...
• genotipizzazione: HCV, HIV, HPV …
Genotipi
Sottotipi
Varianti
quasispecie
Interesse epidemioloico
Applicazioni diagnostiche:
•associazione genotipo/patogenicità
genotipo/resistenza
Rivelazione e identificazione di virus polio mediante
RT-PCR e tipizzazione mediante RFLP.
3
HaeIII
5 6 7 8
DdeI
HaeIII
DdeI
HaeIII
1 2 3 4
2
DdeI
1
M
1380
pb
480 pb
517 pb
459 pb
397 pb
300 pb
200 pb
247 pb
1: Sabin 1
2: Sabin 2
3: Sabin 3
4: “0” RNA
5: virus polio 1 di isolamento clinico
6: virus polio 2 di isolamento clinico
7: virus polio 3 di isolamento clinico
8: 20-100 pb ladder
100 pb
1: Sabin 1
2: Sabin 2
3: Sabin 3
M: 20-100 bp ladder
C.Medici, 2003
HCV genotipi e sottotipi
HCV: genotipizzazione
• Heteroduplex mobility analysis using
temperature gradient capillary
electrophoresis (HMA-TGCE)
Eterogeneità dei ceppi di HIV
•
•
•
•
•
•
Tropismo cellulare
Cinetica di replicazione
Citopaticità
Capacità di formare sincizi
Latenza e inducibilità
Sensibilità ad Ab neutralizzanti o
enhancing
• Antigene
Variabilità HIV
• Variabilità delle popolazioni di HIV in un
individuo infetto
6-10%
• All’interno di una stessa clade
15-30%
• Variabilità interclade
30-40%
% variabilità diversa a seconda del gene analizzato
Alto tasso di ricombinazione genetica: numerosi ricombinanti interclade
applicazioni
• Molecular epidemiology of HIV
transmission in a dental practice
• Ou et al 1992
Applicazioni
• Analysis of a rape case by direct
sequencing of the human
immunodeficiency virus type 1 pol and gag
genes.
Albert et al.1994
applicazioni
Genetic and phylogenetic analyses of HIV-1
corroborate the transmission link
hypothesis
Pistello et al 2004
• Amplificazione della sequenza target dai
campioni in oggetto
• Amplificazione della stessa sequenza da
controlli positivi da campioni di soggetti
non collegati al caso, nella stessa\area
geografica
• Sequenze di riferimento da banca dati
Confronto
Organizzazione del genoma di
HPV
Long control region,LCR, regione più variabile
E6
LCR
L
trasformazione (p53-pRb)
E7
P97
L2
proteine
capsidiche
proteina tardiva,
legame citocheratine
L1, E6 E7
genotipi (>80)
differenze >10%
Sottotipi
E1
Differenze 2-10%
replicazione
episomica
Varianti
Differenze < 2%
E4
L1
E5
trasformazione
E2
regolazione
della trascrizione e
replicazione DNA
HPV: applicazioni diagnostiche
• PCR tipo-specifiche (variazioni E6,E7)
• Una PCR “universale” con primers di
consenso (regione conservata L1)
Primers esterni MY09-MY11
Primers interni GP5-GP6
• Tipizzazione dell’amplicone
– sonde tipo-specifiche
– RFLP
– Sequenziamento
– Line blot assay Amplificazione con SPF10 segmento 65 pb L1
ibridazione)
• Hybrid capture (Digene)
HPV: applicazioni diagnostiche
• Correlation of cervical carcinoma and
precancerous lesions with human
papillomavirus (HPV) genotypes detected
with the HPV DNA microarray method
An et al. Cancer, 2003.
Consensus amplification e probes (30 nts) in grado
di individuare e discriminare 22 tipi HPV
Marcatori di patogenicità
• JCV PML
Delezioni e duplicazioni della regione di controllo della
trascrizione di JCV e
(Ciappi et al 1999)
Leucoencefalopatia
PML* Multifocale
Progressiva
Resistenza
Individuazione di mutazioni associate alla
resistenza ad un farmaco antivirale
• HIV
• HBV
• CMV
• ………………...
CMV-ganciclovir (GCV)
Basi resistenza
UL97 kinasi
UL54 DNA pol
dopo terapia a breve +dopo terapia
termine
prolungata
• Mutanti resistenti UL97: sostituzioni aa
460, 520, 594, 595
delezioni591-594,
590-603
• Mutanti resistenti UL54: regione exo-II e C
resistenza crociata verso cidofovir e
foscarnet
Resistenza a Lamivudina in
HBV
• Mutazione predominante: Met550
Val/Ile
Sito YMDD – DNA pol/ minor efficienza replicazione
• Mutazioni accessorie:Leu526
Met ,
Val553
Ile, Ala 546
Val, ………
 possibili effetti anche su HBsAg
Epidemiologia molecolare
Confronto isolati “flu” B 1998-2001
Sud-Africa
Isolamento
Amplificazione HA
Sequenziamento
Sequenze banche dati
Allineamento sequenze
BLAST 2*
Allineamenti multipli e
costruzione albero filogenetico
CLUSTAL X
Basic alignement search tool
PHILIP*
Phylogeny inference
package
Epidemiologia molecolare
• Molecular epidemiology of measles
viruses in the United States, 1997-2001
Rota et al,2002
– Endemia
– Casi di importazione
– Ceppi vaccinali e selvaggi (oltre 20 genotipi)
Analisi sequenze parte NP e HA
Un nuovo coronavirus possibile
causa di SARS
• Fine marzo 2003
Segnalazioni
di individuazione del virus in casi di SARS
in laboratori diversi :
– Cina (Singapore e Hong Kong)
– USA
– Germania
– Canada
– Francia
RT-PCR per coronavirus
• Ricerca di sequenze conservate nel gene
della polimerasi, ORF1b, tramite GenBank
e allineamento dei genomi dei coronavirus
noti
• Sintesi dei primers e amplificazione
• Sequenziamento e confronto con
sequenze in banca dati
Nuovo coronavirus
• Sequenziamento intero genoma (29.727
nts)
• Deduzione delle sequenze proteiche
• Confronto con genomi coronavirus in
banche dati
Da analisi ORF1b
replicasi
Subgroup 2a ?
2b ?
Virus respiratori: applicazioni
diagnsotiche
• Microarray-based detection and gentyping
of viral pathogens.
Wang et al. PNAS, 2002
•Microarray “spotted” con oligonucleotidi (70 nts) rappresentativi
di sequenze conservate di virus di interesse. Ogni chip contiene 1600 sonde
•Amplificazione con random primers
•Ibridazione su microarray
Identificazione di virus respiratori tra enterovirus, rhinovirus, paramyxovirus,
adenovirus e herpesvirus