Microchips nella diagnostica
virologica
Dott.ssa Francesca Torricelli
Dott.ssa Sara Bernabini
SOD Diagnostica Genetica
Azienda Ospedaliera Universitaria Careggi, Firenze
19 Novembre 2004
Progetto Genoma Umano
È cresciuta l’attenzione nei confronti delle
varianti genetiche
Identificazione di
nuovi geni malattia
Sviluppo della Microbiologia
Farmacogenetica
Individuazione delle basi genetiche che
regolano la predisposizione e la
resistenza alle malattie
Studi su larga scala
Tecnologie rapide, economiche, automatizzabili
Variazioni nel genoma umano
Ogni cambiamento nella sequenza del DNA
Possono essere coinvolti uno o più
nucleotidi
Substitutions
Non tutte le variazioni hanno un
effetto
Se esiste un effetto, può essere di
diverso genere
Dipende dalla localizzazione e dalla
natura della variazione
MUTAZIONE: se la sua frequenza
nella popolazione generale è 1%
POLIMORFISMO: se la sua
frequenza nella popolazione
generale è  1%
Variazioni nel genoma umano
Confrontando il
DNA genomico di
due differenti
individui il 99.9%
risulta identico
Le variazioni
risiedono nel
rimanente 0.1%
Single Nucleotide Polymorphism
(SNP)
È il più comune tipo di variazione genetica
Cambiamento a livello di una singola base nella sequenza del DNA che
si verifica nella popolazione con una frequenza superiore all’1%
1 SNP ogni 1.000 basi
Il numero di SNPs associati ad un incremento del rischio per
determinate patologie è in continuo aumento
Microarray
Insieme ordinato di centinaia o migliaia di “informazioni
genetiche” immobilizzate su un supporto che fornisce un
substrato per l’ibridazione di campioni (appaiamento di due
diversi filamenti di DNA secondo le regole della
complementarietà)
Tecnologia Nanogen
Metodica microarray che utilizza campi elettrici
per il trasporto rapido e accurato delle molecole biologiche
cariche ai siti testo del chip
per incrementare l’efficienza delle reazioni di ibridazione
(“ibridazione attiva”)
Può essere utilizzata in molteplici campi applicativi
diagnostica
ricerca biomedica
farmacogenetica
microbiologia
NanoChip electtronico
Each
test
site
is
electronically
connected to the NanoChip system by a
platinum wire.
Array 10x10
100 siti testo (pad)
localizzati nell’area centrale
NanoChip electtronico
Pad
(elettrodi)
Connessioni
elettroniche
Ciascun pad presenta una connessione
elettronica individuale con il sistema
(Nanogen NanoChipTM Molecular Biology Workstation)
Campo elettrico
L’array è costruito in modo tale che i diversi pad sulla sua
superficie possano essere selettivamente caricati
positivamente
Ogni elemento del chip è indipendente dagli altri
DNA
+++
DNA
+++
Il trasporto selettivo degli oligonucleotidi e dei prodotti di
PCR viene effettuato applicando una carica positiva ai pad
selezionati
Trasporto selettivo
Nucleic
Acids
-
-
-
+
-
-
-
Trasporto selettivo
Ogni pad rappresenta un elemento
indipendente del chip
+
Trasporto selettivo
La tecnologia Nanogen è estremamente
accurata grazie al trasporto selettivo delle
molecole biologiche in posizione specifiche
dell’array e altamente versatile
+
Permeation layer
Sovrasta gli elettrodi
Funziona da matrice per l’attacco dei prodotti di
PCR o degli oligonucleotidi biotinilati in quanto
contiene streptoavidina
Streptoavidina
PCR o oligo
Biotina
Permeation
layer
Elettrodo di platino
Approcci possibili per lo studio di
mutazioni/SNPs noti mediante
tecnologia Nanogen
Amplicon down
Capture down
Amplicon down
Prodotti PCR
biotinilati
Cy5
PCR target
Biotina
Deposizione
elettronica dei
prodotti PCR
biotinilati e
denaturazione
Stringenze
termica e
chimica
Cy3
Cy5 Ibridazione
dei due
reporter
Cy3
Cy3 Cy5
Cy5
Oligonucleotidi
reporter
Disegno dei reporter
Reporter wild-type
Reporter mutato
5’
3’
5’
SNP
3’
• Un reporter è specifico per l’allele wild-type, l’altro
per l’allele mutato
• Disegnati in modo da avere la marcatura in 5’ e la
mutazione/SNP in in posizione centrale
• Lunghezza 9-12 nts
• Temperatura di melting  30-35°C
Rappresentazione grafica dei segnali
fluorescenti rilevati nei 100 pad
Pad nei quali è
stato trasportato
il buffer istidina
50 Mm in assenza
del prodotto di
PCR
Omozigote wt
Omozigote mutato
Sottrazione del
background
Eterozigote
Identificazione genotipica
H17(Control) H61
600
H3
H49
Wild-type
(allele 1)
450
Mutant
(Allele 2)
300
150
0
Sample Red Green Pads Ratio (R:G) Genotype
300.72 300.79 2 1 : 1.0002327 mut/wt
H17
H61
25
589
2
1 : 23.56
wt/wt
H3
595
19
2
31.31 : 1
mut/mut
H49
291 323.24
2
1 : 1.1107
mut/wt
Homozygote Homozygote
Heterozygote
Allele 2
Allele 1
Protocollo di studio
Cartuccia vuota
Micropiastra con
campioni da analizzare
Rivelazione & Analisi
L
o
a
d
e
r
Indirizzo degli
amplificati
Cartuccia riempita:
ibridazione
Reader
Potenzialita’approccio
Amplicon down
1 SOLO PAD
Potenzialita’approccio
amplicon down
1 SOLO PAD
SEGNALI FLUORESCENTI
DERIVANTI DALLO STUDIO DI
14 SNPs/MUTAZIONI IN
CAMPIONI DIVERSI
EFFETTUATO
SULLO STESSO CHIP
1372 CARATTERIZZAZIONI
Nonostante i numerosi step di
ibridazione/stripping non è stato
rilevato un incremento del background
Ottimizzazione del protocollo
Permette una riduzione dei tempi
analitici:
8h complessive per il trasporto di 1 solo prodotto
PCR, 1 ibridazione e 98 caratterizzazioni
15h complessive per il trasporto di 7 prodotti
PCR,14 ibridazioni/stripping e 1.372
caratterizzazioni
Consente un abbattimento dei costi: da 9 Euro
a 2-3 Euro per ciascun SNP/mutazione
Rende la tecnologia ancora più indicata per
studi su larga scala
Approcci possibili per lo studio di
mutazioni/SNPs noti mediante
tecnologia Nanogen
Amplicon down
Capture down
Capture down
Deposizione
elettronica
di capture
probes
biotinilate
Ibridazione
elettronica
Ibridazione
del prodotto Cy3
Cy5 passiva dei due
di PCR
reporter
denaturato
Cy3
PCR target
Oligonucleotide capture
Biotina
Cy3
Cy5
Stringenze
termica e chimica
Cy3 Cy5
Oligonucleotidi reporter
MICROBIOLOGIA
Fino ad oggi la distinzione di generi e specie è stata effettuata
in base a caratteri fenotipici
Questi test sono caratterizzati da limiti:
Non sono applicabili indifferentemente a qualunque specie
batterica
Vanno selezionati di volta in volta in base all’orientamento
diagnostico
Alcuni gruppi batterici esprimono pochi dei caratteri fenotipici
normalmente utilizzati a scopo identificativo e sono quindi
difficili da differenziare
Non è possibile studiare il fenotipo di batteri non coltivabili
MICROBIOLOGIA
I progressi nel campo della biologia molecolare hanno
messo a disposizione una serie di tecniche (clonaggio,
PCR, sonde di DNA etc.) che prescindono dalla
coltivabilità del batterio
Queste tecniche si sono rivelate capaci di genotipizzare le
diverse specie batteriche, mediante l’utilizzo dell’RNA
ribosomiale (rRNA) e dei suoi geni (rDNA)
L’rDNA contiene regioni altamente conservate
(funzionalmente importanti) ma anche sequenze variabili
Genotipizzazione di S. aureus
Cy5TM
Red
Cy3TM
Green
Pol92
T
C
Pol302
T
C
Pol371
T
C
Pol389
C
T
Pol629
G
C
Pol644
A
G
Pol737
G
A
Pol809
A
T
Pol842
T
G
Gyr61
A
T
Gyr301
T
C
Gyr484
G
A
Gyr541
A
T
Gyr547
C
T
Gyr661
T
C
Gyr744
G
A
Gyr802
C
T
Gyr875
A
G
18 SNPs esaminati e
caratterizzati attraverso
l’uso di 36 sonde (reporter)
marcate con Cy3TM or Cy5TM
Approccio Amplicon down
Rivelazione degli agenti patogeni
responsabili della meningite
Sonde specifiche per
l’identificazione dei batteri
Sonde specifiche per
l’identificazione dei virus
(marcate con Cy3)
(marcate con Cy5)
Neisseria meningitidis
Streptococcus pneumoniae
Haemophilus influenzae
HSV1
HSV2
VZV
Approccio Amplicon down
Rivelazione degli agenti patogeni
responsabili della meningite
Gruppo 1
Neisseria
Streptococcus
Haemophilus
Ibridazione
contemporanea con
miscela di sonde
gruppo 1 + gruppo 2
Gruppo 2
HSV1
HSV2
VZV
• solo segnale verde  infezione batterica  ibridazione
sequenziale con singole sonde batterio-specifiche
• solo segnale rosso  infezione virale  ibridazione
sequenziale con singole sonde virus-specifiche
• segnale verde + rosso  ibridazione sequenziale con coppie
di sonde batterio-specifiche/virus-specifiche
Identificazione dei micobatteri
Il genere Mycobacterium comprende oltre 100 specie ed il loro
numero è in continuo aumento: in media tre nuove specie all’anno
sono state descritte nell’ultimo decennio
Tre sono indiscutibilmente patogene:
Mycobacterium tuberculosis  responsabile della tubercolosi
Mycobacterium leprae  agente eziologico della lebbra
Mycobacterium ulcerans  responsabile di gravi ulcerazioni
cutanee in molti paesi africani ed in Australia
Le altre specie sono in larga misura opportuniste, capaci cioè di
determinare patologie in concomitanza con abbassamenti delle
difese dell’ospite
Identificazione dei micobatteri
per seguire terapie appropriate
Specie diverse sono caratterizzate da diversa sensibilità ai farmaci
Amplicon down
Deposizione elettronica
dei prodotti PCR
(16S rDNA: tratti comuni al genere
biotinilati e
Mycobacterium e tratti speciedenaturazione
specifici)
Prodotti PCR biotinilati
Caso 1
Ibridazione
passiva dei
due reporter
Cy3
Cy5
M. Tuberculosis
Caso 2
Microrganismo che non
è un micobatterio
Applicazione delle
stringenze termica e
chimica
Caso 3
PCR
Biotina
Micobatterio diverso dal
M. Tuberculosis
Cy3 Reporter specifico per il
genere Mycobacterium
Cy5
Reporter specifico per la
specie M. Tuberculosis
Capture down
Capture probe biotinilate
per l’identificazione del
genere Mycobacterium e
della specie M. Tuberculosis
pad n°1
pad n°1
Deposizione elettronica delle
diverse capture probe su
differenti pad
pad n°2
Ibridazione
elettronica del
prodotto di PCR
denaturato
Ibridazione passiva di una
mix di reporter
pad n°1
Applicazione delle
stringenze termica e
chimica
pad n°2
Stesso prodotto di PCR
denaturato
Cy3
Reporter specifico per il
genere Mycobacterium
Cy5
pad n°2
Reporter specifico per la
specie M. Tuberculosis
Mycobacterium tuberculosis
Comparsa e diffusione di ceppi resistenti
ad uno o più farmaci
Isoniazide:
l’attivazione da
profarmaco a
principio attivo è
mediata dall’enzima
catalasi-perossidasi; il
60% dei ceppi
resistenti presentano
mutazioni nel gene
katG codificante per
la catalasi-perossidasi
Isoniazide
Rifampicina
Etambutanolo
Streptomicina
Pirazinamide
Rifampicina:
interferisce con i
meccanismi di
trascrizione
dell’rRNA legandosi
alla RNA polimerasi;
la resistenza nel
97% dei casi è legata
a mutazioni nel gene
rpoB codificante per
la subonitá 
dell’RNA polimerasi
Mycobacterium tuberculosis
Valutazione della resistenza alla Rifampicina
Le due piu’ frequenti mutazioni genetiche, responsabili di
circa il 92% dei casi di resistenza, sono sostituzioni
nucleotidiche che coinvolgono i codoni 526 e 531 e provocano
una sostituzione aminoacidica nella proteina risultante
Cambio nucleotidico
Cambio aminoacidico
nella subunita’  della
RNA polimerasi
La maggior parte delle mutazioni sono missense
Pochi casi di inserzioni e delezioni
Metodica SNPmine
Altro possibile utilizzo della tecnologia microarray elettronico
Per la ricerca di tutte le possibili
mutazioni/SNPs del target
Mutazioni/SNPs note
Mutazioni/SNPs non descritte in letteratura
Screening di mutazioni geniche associate alla
resistenza ai principali antibiotici utilizzati nella
terapia antitubercolare
Metodica SNPmine
Amplificazione delle sequenze wild-type (“campione reference”)
relative ai geni di interesse: un primer biotinilato, un primer
fluorocromato Cy3
Cy3
Trasporto elettronico del
campione reference
Biotina
+
Scansione del canale del verde per
verificare l’addressing
background
1 pad/98
Denaturazione (NaOH)
per rimuovere l’elica non
biotinilata
Metodica SNPmine
Amplificazione dei campioni in esame (“campioni test”) :
entrambi i primer fluorocromati Cy3
Trasporto elettronico del
campione test denaturato
(“ibridazione elettronica”)
+
Step di controllo: scansione del canale del verde
Digestione del DNA a
singola elica mediante
esonucleasi Mung
Metodica SNPmine
Caso 1: match
Caso 2: mismatch
Trattamento con la proteina
MutS (mismatch binding protein)
marcata con Cy5
Lavaggi e scansione
Test wild type
Test mutato
Metodica SNPmine
L’applicazione della metodica SNPmine allo studio della
resistenza ai farmaci da parte di M. tuberculosis
permetterebbe di individuare rapidamente i ceppi
eventualmente resistenti
Permetterebbe di individuare il
farmaco da non somministrare al
paziente in esame poiché inefficace
Farmacogenetica
E’ quella branca della ricerca genetica
e della pratica clinica che si occupa
delle differenze individuali nella
risposta ai farmaci che sono dovute a
variazioni genetiche
Efficacia
Risposta ai farmaci
Tollerabilità
Oggi di un farmaco si conoscono efficacia e tollerabilità nella media
delle persone, ma non nel singolo individuo
Risposta ai farmaci
Efficacia: raramente un farmaco ammesso in
commercio, e quindi valutato come efficace in
termini medi, lo e’ in piu’ del 60% dei pazienti
Tollerabilita’: le reazioni avverse a farmaci sono la
sesta causa di morte negli Stati Uniti; 2 milioni di
ospedalizzazioni/anno e 100.000 decessi/anno in seguito
ad effetti collaterali di farmaci correttamente
prescritti
Farmacogenetica
Nasce per l’esigenza di individuare, prima della
somministrazione del farmaco, quali soggetti avranno
una reazione favorevole e quali invece sono a rischio
di effetti collaterali piu’ o meno gravi
Obiettivo finale: mettere a
disposizione test farmacogenetici
capaci di predire a livello individuale
se un paziente rispondera’ al
farmaco e se questo gli potra’
causare un effetto collaterale,
realizzando cosi’ la
personalizzazione dell’approccio
terapeutico
Risposta ai farmaci
Soggetti diversi rispondono in modo
diverso allo stesso farmaco
Differenze di assorbimento
Differenze di metabolismo
Differenze di legame del
farmaco con il bersaglio
Differenze di eliminazione
Tali differenze sono
legate al grande numero
di enzimi che
intervengono nella
risposta al farmaco:
ogni enzima e’ prodotto
da uno specifico gene

la maggior parte di
questi geni sono
polimorfici nella
popolazione
Studio dei polimorfismi
Pazienti senza efficacia
nei trial clinici
Pazienti con efficacia
nei trial clinici
Predittivo di NON
efficacia
Predittivo di efficacia
DNA wild-type=ATCTGGATC
Polimorfismo= ATGTGGATC
Test farmacogenetici:
test predittivi
Non saremo comunque in grado di fare una predizione
assoluta, cioe’ dire con una sicurezza del 100% se il
paziente rispondera’ (o non rispondera’) al farmaco, se
avra’ (o non avra’) effetti collaterali
E’ molto piu’ probabile che il risultato di un buon test
farmacogenetico sara’ del tipo:
il paziente ha una probabilita’ molto alta (ad esempio
superiore all’80%) di rispondere bene al farmaco ed
ha una probabilita’ molto bassa (ad esempio inferiore
all’1%) di avere un effetto collaterale
Farmacogenetica e microchips
Analisi su larga scala di mutazioni/SNPs
Tecnologia
Accuratezza
Nanogen
Versatilità
Adatta a studi di
farmacogenetica
Costi comparabili o
minori a quelli
delle tecniche
“gold standard”
Microchips nella diagnostica
virologica
Dott.ssa Francesca Torricelli
Dott.ssa Sara Bernabini
SOD Diagnostica Genetica
Azienda Ospedaliera Universitaria Careggi, Firenze
19 Novembre 2004