AZIENDA
OSPEDALIERO-UNIVERSITARIA
POLICLINICO “GASPARE RODOLICO”
CATANIA
UNIVERSITA’ DEGLI STUDI
DI CATANIA
CARCINOMA DEL COLLO DELL’UTERO E
VACCINAZIONE ANTI HPV
ASPETTI VIROLOGICI
Guido Scalia
Dip. di Sc. Microbiologiche e Sc. Ginecologiche
Laboratorio Centralizzato di Analisi
Policlinico di Catania
U.O. Virologia Clinica
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e-mails
[email protected]
I VIRUS
MOLTI VIRUS SONO PRESENTI,
ANCHE IN FORMA ASINTOMATICA, A
LIVELLO GENITALE ED URINARIO
PIU’ RILEVANTI PER
SINTOMATOLOGIA E/O PROGNOSI:
HSV E PAPILLOMAVIRUS
CLASSIFICAZIONE
Un tempo classificati come
Papovaviridae
successivamente
in famiglie
Polyomaviridae
genere
Polyomavirus
(virus SV40, JC, BK)
Papillomaviridae
genere
Papillomavirus
PAPILLOMAVIRUS (HPV)
• Dal latino “papilla” (pustola)
più il suffisso greco “-oma”
(tumore)
• Spiccato tropismo per le cellule
della cute e delle mucose
• Assenza di envelope
• DNA a doppio filamento
anulare di circa 8000 pb
• Circa 100 diversi genotipi
SENSIBILITA’ AD AGENTI
CHIMICO-FISICI
•
•
•
•
Alte temperature
Basse temperature
Antimetaboliti (S-fluorouracile)
Alfa-TNF e podofillina
• Trasmissione sessuale: per mezzo di frammenti di
tessuto infetto che penetrano attraverso
microabrasioni
• Trasmissione
inanimati
indiretta:
attraverso
oggetti
• Trasmissione peri-partum: infezione congiuntivale
nel neonato da parte di donne portatrici di
infezione genitale
• Incubazione: da poche settimane a qualche anno
ORGANIZZAZIONE GENOMICA
10 ORF
Regione L: late (tardive)
L1
espresse solo in cellule infettate in modo
40% DNA virale
produttivo durante l’assemblaggio di virioni
maturi. Sotto il controllo di promotori tardivi L2
E1
E2
E3
espresse sia in cellule infettate in modo non E4
produttivo che in cellule trasformate. Sotto il E5 45% DNA virale
E6
controllo di promotori precoci
E7
E8
Regione E: early (precoci)
LCR: long control region
15% DNA virale
ORF
FUNZIONI
LCR
Promotore
E1
Necessario per gli eventi replicativi precoci
E2
Regolazione della trascrizione e replicazione DNA
E3
Funzione sconosciuta
E4
Proteina NS tardiva. Disregola il citoscheletro
E5
Proteina trasformante. Interagisce con i recettori dei
fattori di crescita. Es.: PDGF
E6
E7
Proteina trasformante legata a P53
Proteina trasformante legata a pRb
E8
Regolatore della replicazione e della trascrizione
L1
Proteina più grande del capside
L2
Proteina più piccola del capside
CICLO DI REPLICAZIONE VIRALE
•
•
•
•
•
•
Attacco del virus alla superficie della cellula ospite
Penetrazione
Esposizione dell’acido nucleico
Sintesi dei componenti virali
Assemblaggio dei componenti virali neoformati
Fuoriuscita del virus dalla cellula infetta dopo lisi
cellulare.
tropismo per l’epitelio
squamoso pluristratificato,
replicandosi solo nelle cellule
epiteliali in differenziamento
della cute e delle mucose
fase non produttiva o precoce
in cui l’espressione è limitata a
geni precoci che inducono la
cellula a proliferare ed il
genoma è in forma episomale
fase produttiva o tardiva con
espressione di geni tardivi e
formazione di virioni maturi
Tipo di HPV
Lesione clinica
Potenziale oncogenico
1,4
Verruche plantari
benigno
2,4,26,27
Verruche comuni
benigno
3,10,21,28
Verruche piane
Raram. maligno
5,8
Displasie verruciformi in
immunocompromessi
Spesso maligno
6,11
Condilomi ano-genitali; basso
papillomi laringei
7
Verruche delle mani
benigno
9,12,14,15,17,1925,36,40,47
Epidermodisplaia verruciforme
HPV17 e 20 evolvono in
carcinoma
16,18,30,31,33,
35,39,45,51,52,56
34,40,42-44,5355,58,59,61,62,
64,66-69
Carcinomi della mucosa maligno
genitale e laringeo
Neoplasie intraepiteliali Alcune danno
(genitali e altre mucose) carcinomi
75,77
Verruche nei trapiantati
Spesso carcinomi
• The normal distribution is that the bottom layer is
made of round young cells. As the cells mature they
rise to the surface and flatten out, so that on the
surface the cells are flat.
• In cervical dysplasia there is a lack of this organized
growth process. In mild dysplasia (CIN I) only a few
cells are abnormal, while in moderate dysplasia (CIN
II) the abnormal cells involve about one-half of the
thickness of the surface lining of the cervix.
• In severe dysplasia or carcinoma-in-situ (CIN III) the
entire thickness of cells is disordered, but the
abnormal cells have not yet spread below the
surface. Carcinoma-in-situ means "cancer in place".
If this condition is not treated, it often will grow into
an invasive cervical cancer.
• In dysplasia and carcinoma-in-situ all of the
abnormalities are confined to the surface lining (or
"skin") of the cervix. In invasive cancer the cells are
not only disordered throughout the entire thickness
of the lining, but they invade the tissue underlying
the surface. Invasive cancer is treated entirely
differently than dysplasia.
• The most important concept is that dysplasia is
limited to the "skin" of the cervix, and has not
invaded into the underlying tissue.
• Even "carcinoma-in-situ" is not invasive cancer.
• In the past, there was a tendency to treat
"carcinoma-in-situ" as a much more serious problem
than severe dysplasia, when in fact they are
essentially the same.
• Because of this confusion a new classification
system for cervical dysplasia was developed.
Remember that "plasia" means "growth."
"Neoplasia" means "new growth." The surface layer
of cells ("skin") is called "epithelium." Putting this
together, a new growth within the epithelium is
called "intraepithelial neoplasia." If we are
describing the cervix, then the term used is "cervical
intraepithelial neoplasia," or "CIN."
The Atypical Pap (ASCUS)
• This is the category that drives women crazy! This
means some cells that are slightly funny looking, but
not abnormal enough to call dysplasia. (ASCUS
stands for "atypical cells of undetermined
significance.) This category could also be called
"probably normal, but I want to keep a close eye on
things." There is a tremendous variation between
labs on how many pap smears come back with this
reading, which corresponds to the old "Class 2"
classification. Some labs will be very liberal in
calling normal variations "atypical," which causes
women to worry needlessly. Other labs have stricter
criteria for this classification.
HPV danneggia il
DNA cellulare
Il danno attiva
Geni E6 ed E7
p53
Quando p53 è attivata
Arresto del ciclo
cellulare
Se il danno è riparato,
il ciclo riprende
Apoptosi
Morte cellulare
inattivano
Se E6 ed E7 riescono ad inattivare
l’oncosoppressore p53,
la cellula danneggiata sopravvive
e può dare origine a
cloni cellulari suscettibili di ulteriori
danni del DNA
fino alla comparsa
di cloni cellulari maligni
HPV
• L’ANALISI DELLE MUTAZIONI
DELLE REGIONI ALTAMENTE
CONSERVATE DEL GENE DELLA p53,
IN PRESENZA DI HPV, SPECIE SE
HIGH RISK, POTRA’ DARCI
INDICAZIONI PIU’ VALIDE
RIGUARDO ALL’EVOLUZIONE DELLA
PATOLOGIA “DA HPV”?
METODI PER
L’IDENTIFICAZIONE
DELL’INFEZIONE DA HPV
HPV DIAGNOSI
• PCR+HYBR
• PCR + REVERSE HYBR PER
DIFFERENZIAZIONE DI APPARTENENZA
AD UNO DEI
RISK GRADE
• E’ POSSIBILE IMPIEGARE CAMPIONI NON
BIOPTICI, QUALI STRISCIO O TAMPONE
BIOLOGIA MOLECOLARE
• Estrazione del DNA di HPV da sospensioni
cellulari (prelievi con spatola) e/o da materiale
bioptico
• PCR Qualitativa: reazione di amplificazione
specifica per la regione genomica L1
• Rivelazione mediante elettroforesi su gel di
agarosio: controllo positivo è la beta-globina
• Esame Quantitativo: ibridazione del prodotto di
PCR ottenuto con una sonda marcata con biotina;
reazione in micropiastra.
L’assorbanza della reazione viene letta allo
spettrofotometro
• Genotipizzazione: consente di tipizzare i ceppi
mediante l’uso di sonde biotinilate altamente
specifiche per i ceppi che devono essere identificati
e che differiscono per pochi nucleotidi
GENOTIPIZZAZIONE
Importante per poter discriminare tra HPV ad alto o basso
rischio oncongeno e per poter o meno correlare al virus lo
sviluppo della neoplasia
Linea di controllo
Reverse dot-blot.
Nested-PCR della regione L1,
marcatura con biotina, aggiunta del
coniugato streptavina-fosfatasi
alcalina e rivelazione con i
cromogeni NBT/BCIP
Specificità del 99,9%
Sensibilità di 50 copie per campione
Controllo di colorazione
Sonda universale
6
11
34
40
42
43
53
54
61
69
70
16
18
31
33
35
39
45
51
52
56
58
59
66
BASSO/MEDIO RISCHIO
ALTO RISCHIO
• Lo sviluppo del tumore e i primi stadi della sua
evoluzione si basano sulla produzione di mRNA
anomalo seguita dalla produzione di proteine
oncogeniche nelle cellule della cervice.
• Durante questo processo la cellula umana contiene
alcune sequenze geniche provenienti da un
numero limitato di virus HPV ad alto rischio che
sono in grado di produrre queste sequenze di
mRNA anomalo e quindi proteine altamente
cancerogene.
SIEROLOGIA
Non è ancora un metodo utilizzabile per la
ricerca di HPV
Impossibilità di ottenere la replicazione del virus
in colture cellulari e quindi di antigeni nativi
• Numerosi genotipi diversi di HPV
Studio 1
Risposta anticorpale sierica e locale (cervicale)
diretta contro un peptide sintetizzato da E2
di HPV16
• Scopo: valutare la relazione tra IgA e IgG
sieriche e locali
• Metodo: ELISA
Studio 1
IgA
IgG
siero
secrezioni
siero
secrezioni
Controlli (n.20)
4 (20%)
3 (15%)
4 (20%)
3 (15%)
Low grade (n.16)
9 (56%)
7 (43%)
3 (18%)
8 (50%)
High grade (n.21)
15
(71%)
11 (52%)
10 (47%) 9 (42%)
Lesioni
2
microinvasive (n.2)
Lesioni vulvari
0
(n.2)
2
1
0
0
1
0
Casi patologici
tot.41
20
(48.8%)
15
(36.6%)
19
(46.3%)
26
(63.4%)
Studio 1
Discussione:
• IgA sieriche si trovano più frequentemente
in pazienti con lesioni cervicali
• Aumento delle IgA nei tumori (in misura
minore le IgG)
• IgA locali si trovano in concentrazione
minore rispetto alle sieriche
Studio 2
Anticorpi contro la proteina maggiore del
capside dei virus HPV 16, 18, 58 e 6b
• Scopo: valutare la relazione tra presenza di
anticorpi IgG contro L1 con il cancro
cervicale
• Metodo: ELISA
Studio 2
sieropositivi
Diagnosi n.
età
anti
HPV16
anti
HPV18
anti
HPV58
anti
HPV6
anti
HPV1618-58
CIN
22
43.9 4(18%)
5(23%)
3(13%)
5(27%)
10(45%)
Sane
98
43.2 2 (2%)
1(1%)
10(10%)
24(24%)
12(12%)
Cancro 67 53.5 23(34%) 9(13%) 19(28%)
cervic.
102 53.7 4(4%)
1(1%)
11(11%)
Sane
24(36%)
33(49%)
19(19%)
14(14%)
Condiloma
Sane
38
27.0 6(5%)
4(11%)
6(16%)
21(55%)
13(34%)
48
25.4 5(10%)
1(2%)
6(13%)
12(25%)
12(25%)
Studio 2
Discussione:
• Trovati anticorpi diretti contro genotipi
specifici di HPV
• Relazione tra HPV 16, 18, 58 e neoplasia
cervicale intraepiteliale o cancro cervicale
• Relazione tra HPV6 e condiloma acuminato
• In pazienti con positività per DNA-HPV,
negatività o scarsa positività per gli anticorpi
• Presenza di anticorpi diretti contro più
genotipi di HPV
EPIDEMIOLOGIA
• I più frequenti genotipi nei carcinomi anogenitali sono HPV 16 e 18 (nel 50% dei casi)
• HPV si riscontra nell’assoluta maggioranza
dei casi di cancro della cervice (HPV 16 nel
50% dei casi seguito da HPV 18,45,31,33)
• Nei neonati i genotipi più diffusi sono HPV
16 e 18
• Nei bambini i genotipi più diffusi sono HPV
6 e 11
EPIDEMIOLOGIA
• Donne giovani e attive sessualmente hanno
una più alta incidenza di infezione clinica da
HPV con un elevato rischio di progressione
verso il carcinoma
• Gli uomini più frequentemente hanno
infezioni latenti da HPV e più raramente
evolvono in carcinoma
E’ OPPORTUNO FARE “SCREENING”
BIOMOLECOLARE PER HPV?
LA PAZIENTE CHE DOVESSE ESSERE
POSITIVA PER UN HIGH RISK, COME
REAGIREBBE?