Motilità e Citoscheletro
• MOVIMENTI INTRACELLULARI E MOTILITA’ DELLE
CELLULE STESSE
– Indispensabili per la sopravvivenza di molti organismi
• Spermatozoo, globuli bianchi, neuroni
• CITOSCHELETRO
– Impalcatura interna delle cellule
– Supporto alle proteine motrici
– Assemblaggio e disassemblaggio delle proteine del CS producono
movimento
Adesione e Matrice Extracellulare
• MOLECOLE DI ADESIONE:
– Cell-cell; cell-strutture circostanti
– Integrità e comunicazione tissutale
• MATRICE:
– Supporto, protezione, riserve energetiche, ancoraggio per
cell e tessuti
CITOSCHELETRO:
Sistema di filamenti che svolge funzioni sapaziali e meccaniche nella cellula
• organizzazione spaziale delle
cellule
• forma e movimento
• riarrangiamento dei componenti
interni durante la crescita e la
divisione cellulare
• mitosi
• traffico intracellulare di organelli
e molecole
• sostegno alla membrana
plasmatica
• guida la crescita della parete
cellulare vegetale
FILAMENTI DEL CITOSCHELETRO
1.
Filamenti di actina (microfilamenti):
determinano la forma della superficie
cellulare e sono necessari per la
locomozione dell’intera cellula
(lamellipodi, filipodi)
2. Microtubuli: determinano le posizioni
degli organelli e dirigono il trasporto
intracellulare (formazione del fuso
mitotico, cilgia e flagelli)
3. Filamenti intermedi: forniscono forza
meccanica e resistenza agli stress
(involucro nucleare, assoni)
Proteine accessorie sono essenziali per
l’assemblaggio controllato dei
filamenti del citoscheletro,
comprendono i motori proteici che
muovono gli organelli o i filamenti
stessi.
• Strutture dinamiche e adattabili
• Cambiano o persistono per
archi di tempo variabili
• Composte da diverse subunità
macromolecolari
- Le caratteristiche di tali
componenti unitarie
conferiscono le proprietà del
filamento finale
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Filamenti di Actina
• Polimeri elicoidali a 2 filamenti della
proteina ACTINA
• Strutture flessibili
• 5-9nM
• Fasci lineari
• Reti bidimensionali
• Gel tridimensionaliconcentrati
soprattutto nella corteccia
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Microtubuli
•
•
•
•
•
Cilindri cavi
Unità: tubulina (alfa e beta)
25nM
Rigidi
MTOC: centrosoma
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Filamenti Intermedi
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• Unità: famiglia eterogenea di
proteine
• 10nM
• Lamina nucleare, assoni, tessuti
epiteliali
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PROTOFILAMENTI
•
I polimeri del citoscheletro sono
costituiti lunghe file di subunità unite
per le estremità, che si associano fra
loro lateralmente.
•
Tenute insieme da interazioni
idrofobiche e legami non covalenti
deboli
•
Le posizioni e i tipi di contatti sono
diversi per i diversi filamenti.
NUCLEAZIONE
Assemblaggio di subunitàin un aggregato iniziale (o nucleo)
Stabilizzazione dei contatti subunità-subunità
Allungamento del polimero per aggiunta di altre subunità
NUCLEAZIONE
• la polimerizzazione dipende dalla concentrazione di subunità non
polimeriche
• Concentrazione critica: quando il tasso di associazione e dissociazione
si equivalgono
• Punto stazionario
• proteine speciali per catalizzare la nucleazione dei filamenti in siti
specifici, determinando la posizione in cui si assemblano nuuovi
filamenti del citoscheletro
POLARITA’ DEI FILAMENTI DEL
CITOSCHELETRO:
• il terminale con il tasso di polimerizzazione maggiore è detto terminale
(+) (“plus end”);
• il terminale con il tasso di polimerizzazione minore è detto terminale () (“minus end”); MT: subunità alfa; Actina= estremità ATP
I filamenti del citoscheletro possono organizzarsi in strutture di ordine superiore:
• I filamenti intermedi formano legami crociati e si associano in fasci molto forti; associazione
mediata anche da proteine come la filaggrina (forma fasci di filamenti di cheratina), la plectina (forma
fasci di vimentina)…
• i filamenti di actina possono organizzarsi con proteine che formano fasci (legami crociatitra filamenti di
actina)e proteine che formano gel (tengono insieme due filamenti di actina angolati tra loro)
Regolazione della dinamicità del citoscheletro
(formazione di fasci, allungamento o accorciamento…)
•
ATTIVAZIONE DELLE PIASTRINE:
–
–
–
–
Cellule anucleate
Circolano nel sangue
Formano coaguli nei siti di ferite
Contatto con vaso danneggiato o segnale chimico esterno (ex, trombina) = attivazione
• Cascata segnale
• Rapido influsso intracell di Ca2+
• Attivazione delle proteine che regolano l’actina (inattivazione delle prot che bloccanono
l’allungamento)
• Rapido allungamento dei filamenti di actina
• Formazione di fasci e reti di actina: lamellipodi e filipodi (inserimento nel sito del coagulo)
• Cessazione del segnale di attivazione (- Ca2+): stabilizzazione vs depolarizzazione e
allungamento= piastrina bloccata nella nuova forma appiattita
• Miosina II: contrazione dei filamenti di actina = avvicinamenti dei bordi della ferita cui la
piastrina è adesa
Attivazione delle piastrine
CONTATT
I FOCALI: Tipo altamente specializzato di
attacchi tra i filamenti di actina e
matrice
extracellulare
che
permette alle cellule di esercitare
una trazione sul substrato a cui
sono attaccate
FIBRE DA
STRESS: A livello dei contatti focali,
consistono di fasci contrattili di
filamenti di actina e di
miosinaII che terminano in
corrispondenza della membrana
plasmaticadove si localizzano
gruppi di proteine di adesione
transmembrana (integrine).
Organizzazione dell’actina nella cellula
PROTEINE MOTRICI
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Motori molecolari
Si associano alle fibre polarizzate del citoscheletro
Usano l’energia derivata dall’idrolisi dell’ATP per muoversi lungo di esse
Si differenziano per il filamento a cui si attaccano, per la direzione in cui si
muovono e per il cargo che portano
Trasporto di componenti subcellulare (organelli, cromosomi…)
Conferiscono forza alla rete dei polimeri: determinano la forma della cell
dopo aver svolto l’azione motoria possono staccarsi dal filamento.
DUE REGIONI:
– Testa: dominio motore (idrolisi dell’ATP)
– Coda: autoassemblaggio delle prot motrici; associazione al “cargo”
• Dà specificità ai diversi tipi di motore
Spostamento del motore sul filamento (quando il filamento è ancorato) o del
filamento stesso per mezzo dei motori (quando i motori soni ancorati).
Tipi principali di proteine motrici:
• Miosina
• Chinesina
• Dineina
Miosina (actina)
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• Miosine: uniche proteine motrici che si
muovono su binari di actina
• Diversi tipi di miosina: struttura e
localizzazione
• Tutti i tipi di miosina si muovono verso
l’estremità + di un filamento (differenti
velocità)
– eccezione: miosina VI
• Miosina II:
– generazione della forza necessaria alla
contrazione muscolare
– Prima proteina motrice identificata
Miosina II
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•
•
•
•
•
•
•
Proteina allungata formata da 2 catene pesanti (rosso) e 2 copie di 2 tipi di catene
leggere (blu).
Catena pesante: dominio di testa globulare all’N-terminale (motore) e una lunga
sequenza amminoacidica che forma un coiled-coil -alfa eliche superavvolte(media la dimerizzazione attrverso).
Catene leggere: si legano vicino alle teste
Sempre associata ad attività contrattile sia in cellule muscolari che non
Citochinesi
Divisione cellulare
Migrazione cellulare
Filamenti spessi
• Le code possono formare un fascio con altre molecole di miosina
(interazioni coda-coda= filamenti spessi bipolari)
Generazione della forza motrice
Idrolisi ATP= cambio conformazionale
•
Configurazione rigor
–
–
–
–
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•
•
•
•
No ATP
La testa di Miosina lega saldamente il
filamento di actina
Durata breve (nel muscolo)
Termina con l’attacco di un nucleotide
trifosfato
Legame ATP
Cambio conformazionale lievedei domini che
compongono il sito di attacco con l’actina
Ridotta affinità actina-miosina
Distacco: il movimento è consentito
Generazione della forza motrice
Idrolisi ATP= cambio conformazionale
• Idrolisi=cambio
conformazionale notevole
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– Spostamento della testa sul
filamento di 5nM
– ATP e Pi legano sempre la
miosina
• Nuovo legame actina- miosina
– Rilascio del Pi
– Colpo di potenza
Generazione della forza motrice
Colpo di potenza
• La testa di miosina
riguadagne la conformazione
iniziale sul filamento di actina
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– No nucleotide
• La miosina lega l’actina in
una nuova posizione
• Inizio di un nuovo ciclo
FIBRE MUSCOLARI
• cellule multinucleate
•Miofibrilla
•Sarcomero
•Filamenti sottili: actina
•Estremità + = disco Z (estremità del sarcomero)
•Estremità - = filamenti spessi
•Filamenti spessi: miosina II
•Accorciamento del sarcomereo (contrazione): scivolamento delle
fibre (non accorciamento delle stesse)
•Processo dipendente dalla [Ca2+]
Disco Z: all’estremità del sarcomero, sito di attacco per le estremità+ dei filamenti
sottili.
Linea M: è la posizione di proteine che collegano filamenti adiacenti di miosina fra
loro.
Banda chiara: filamenti sottili
Chinesina (microtubuli)
•
•
•
•
•
proteina motrice identificata nell’assone
gigante di seppia
composta da 2 catene pesanti e 2
leggere (2 domini motori globulari e un
coiled-coil allungato responsabile della
dimerizzazione)
Motore N-terminale; movimento in
direzione +
KRP
coinvolta nel trasporto anterogrado
(trasporto assonale veloce) di molecole
(RE), dal corpo cellulare, verso la
terminazione dell’assone
Ciclo della Chinesina
•
•
•
•
Chinesina: 50% lega; 50 % non lega il MT durante il ciclo di H-lisi dell’ATP
Attacco dell’ATP alla testa della chinesina che lega il MT spinge in avanti la
seconda testa (legata all’ADP)
La seconda testa lega il MT
L’H-lisi dell’ATP su una testa e il distacco del’ADP sull’altra riporta alla
conformazione iniziale ma con le teste invertite e con uno spostamento spaziale
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Miosina vs chinesina
• Miosina:
– passo singolo ma lungo
– Ciclo rapido
– Opera come un fascio
• Chinesina:
– Passi multipli, ma brevi
– Ciclo più lento
– Opera come unità singola
Dineine (microtubuli)
• composte da 2 o 3 catene pesanti (comprendono il dominio motore) e un numero
grande e variabile di catene leggere associate
• si muovono verso l’estremità (-) dei microtubuli
• coinvolte nel trsaporto retrogrado di molecole (Golgi) o organelli racchiusi in vescicole
dalla terminazione, verso il corpo cellulare del neurone
•DINEINE CITOPLASMATICHE: omodimeri di catene pesanti con 2 grandi
domini motori come teste
•DINEINE ASSONEMALI: eterodimeri ed eterotrimeri con 2 o 3 domini di testa;
coinvolte nello spostamento veloce di microtubuli nelle ciglia
MODELLO PER L’ATTACCO DI DINEINA AD UN ORGANELLO
La dineina richiede l’associazione con dinactina
(complesso proteicoche comprende un filamento
simile all’actina che interagisce con complessi proteici
presenti sulle membrane degli organelli) per svolgere la
sua funzione
REGOLAZIONE:
fosforilazione, cAMP….
CIGLIA E FLAGELLI:
• Sono strutture mobili costituite da microtubuli e dineine
• strutture mobili altamente specializzate ed efficienti
• appendici cellulari con un fascio di microtubuli centrale
FLAGELLI: • Su spermatozoi e in molti protozoi
• movimento ondulatorio permette alle cellule di nuotare in mezzi liquidi
CIGLIA: • più corte dei flagelli ma organizzate in modo simile
• movimento a frusta
• cicli di ciglia adiacenti sono sincronizzati ma non esattamente
(movimento ad onda)
• muovono singole cellule in un fluido o muovono un fluido sulla
superficie di un gruppo di cellule in un tessuto (vd. Apparato respiratorio)
Movimento di ciglia e flagelli:
Forza perpendicolare all’asse dell’assonema
Disposizione dei MT a “9+2”
nell’assonema di ciglia e
flagelli
CORPI BASALI: strutture che radicano ciglia e flagelli alla
Superficie cellulare. Composti da 9 gruppi di triplette di
Microtubuli fusi
FLAGELLI BATTERICI:
•Flagellina
•Rotazione ad elica
MOVIMENTO CELLULARE:
POLARIZZAZIONE DI CELLULE DI
LIEVITO: coinvolge l’ACTINA durante la
gemmazione e i MICROTUBULI nella
polarizzazione morfologica (risposta a fattori di
accoppiamento)
CELLULE CHE STRISCIANO SU UN SUBSTRATO SOLIDO : processo integrato e
complesso che dipende dalla corteccia cellulare ricca di actina; coinvolte 3 attività.
PROTRUSIONE
Filipodi: 1D
Lemellipodi: 2D
Pseudopodi: 3D
ATTACCO:
TRAZIONE:
•Sviluppo, embriogenesi, neuroni
•Animale adulto, risp immunitaria, osteoblasti, fibroblast (connettivo)
•Patologie, tumori
Lamellipodi e increspature
Fibroblasti in coltura su un foglio di
gomma al silicone
Organizzazione dei microtubuli in fibroblasti e
neuroni
Cono di crescita dei neuroni
MATRICE EXTRACELLULARE
• insieme di proteine e polisaccaridi, secrete
da diversi tipi di cellule, che costituiscono
strutture extracellulari in grado di svolgere
diverse funzioni
• diversa concentrazione delle diverse
componenti della matrice dà origine a
strutture molto diverse tra loro (es, tendini,
cartilagini dell’osso…)
• funzione principale di sostegno
• altre funzioni di regolazione della
divisione cellulare, adesione, motilità e
migrazione cellulare (distruzione
controllata della matrice ad opera di
proteasi), differenziamento durante
l’embriogenesi
• le funzioni diverse dipendono dalle
sostanze che la compongono e dalla loro
particolare disposizione
Le cellule che producono le molecole della matrice sono essenzialmente fibroblasti ;
In certi tipi specializzati di tessuti connettivi (cartilagine e osso) tali molecole sono secrete da cellule
della famiglia dei fibroblasti più specializzate (es, condroblasti e osteoblasti)
Due classi principali di macromolecole extracellulari compongono la matrice extracellulare: catene polisaccaridiche della classe chiamata glicosamminoglicani (GAG), che si trovano di solito uniti
covalentemente a proteine sotto forma di proteoglicani
- proteine fibrose, fra cui collagene, elastina, fibronectina e laminina che hanno funzioni
sia strutturali che adesive.
Le molecole di proteoglicano nel
tessuto connettivo formano una
“sostanza basale” simile a gel altamente
idratata in cui le proteine fibrose sono
immerse. Le fibre di collagene
rafforzano e aiutano ad organizzare la
matrice e fibre di elastina simili a
gomma le danno elasticità.
GLICOSAMMINOGLICANI:Sono catene polisaccaridiche non ramificate composte da
unità ripetute di disaccaridi. Uno degli zuccheri è sempre uno
zucchero amminico (nella maggior parte dei casi è solfato). Il
secondo zucchero è di solito un acido uronico (glucuronico o
iduronico)
PROTEOGLICANI: Sono prodotti dalla maggior parte delle cellule animali. La catena
polipeptidica, o nucleo proteico, è prodotta dai ribosomi del RER e introdotta
nel lume. Le catene polisaccaridiche sono assemblate su questo nucleo
principalmente nell’apparato del Golgi. Qui vengono anche aggiunti gli
zuccheri.
COLLAGENI: Famiglia di proteine fibrose secrete da cellule del tessuto connettivo e da una
varietà di altri tipi cellulari. Sono le proteine più abbondanti nei mammiferi
(costituiscono pelle ed osso). Danno origine a fibre semicristalline che
tengono in posizione le cellule, conferiscono resistenza alla tensione ed
elasticità alla matrice; svolgono funzioni importanti nell’ambito della mobilità
e dello sviluppo delle cellule. Glicoproteine per lo più insolubili, caratterizzate
da un contenuto elevato di Gly e di 2 aa modificati: idrossi-Lys e idrossi-Pro.
Singole molecole di collagene sono strutture lineari costituite da 3 catene polipeptidiche. Le singole
catene, dette catene a, si avvolgono a formare un’elica sinistrorsa a passo lungo. I residui di Pro, a
spaziatura regolare, sono importanti per la stabilizzazione di questa struttura elicoidale.
3 catene a si associano tra loro a formare una tripla elica destrorsa,
relativamente rigida; tale struttura è possibile grazie all spaziatura
regolare dei residui di Gly (stanno nell’asse centrale). La tripla elica
è responsabile della natura fibrosa .
A seconda del tipo di collagene, la tripla elica può essere continua,
o può contenere regioni che danno origine a strutture a
conformazione meno ordinata. Questi elementi fungono da
regioni cardine e danno maggiore flessibilità.
FIBRE ELASTICHE: Rete nella matrice, possono tenere insieme fibre
di collagene. Componente principale è
l’ELASTINA (proteina altamente idrofobica,
ricca di Pro e Gly, non glicosilata). L’elastina è
prodotta a partire da un precursore
(TROPOELASTINA) solubile secreto nello
spazio extracellulare ed è assemblata in fibre
vicino alla membrana plasmatica. Segue la
formazione di legami crociati che permette la
formazione di una rete.
FIBRONETTINA:
Grossa glicoproteina, dimero composto da 2
subunità molto grandi unite da legami
disolfuro ad una estremità. Ciascuna subunità
è ripiegata in una serie di domini funzionali
distinti separati da regioni di catena
polipeptidica flessibile. Può dare fibrille.
LAMINE
BASALI: Sottili tappeti flessibili di matrice specializzata,
sottostanti ai fogli e tubi di cellule epiteliali.
Funzione di separazione e filtro (glomerulo);
determinano la polarità cellulare , influenzano il
metabolismo. Sintetizzata in gran parte dalle cellule
che si trovano su di essa; fibrille di ancoraggio
composte soprattutto da collagene di tipo IV.
Ruolo ISTRUTTIVO nella rigenerazione
(giunzione neuromuscolare).
GIUNZIONI CELLULARI:
TESSUTO CONNETTIVO: Matrice extracellulare abbondante e cellule distribuite in modo
sparso al suo interno; è la matrice che sopporta lo stress
meccanico. Gli attacchi diretti tra una cellula e l’altra sono rari.
TESSUTO EPITELIALE: Cellule unite strettamente in foglietti chiamati epiteli: matrice
extracellulare scarsa, consiste di un tappeto sottile (lamina
basale) che sta sotto l’epitelio. L’adesione cellula-cellula
sopporta la maggior parte degli stress meccanici. (IMP:
contatto tra citoscheletro di cellule adiacenti)
GIUNZIONI
CELLULARI:
Giunzioni specializzate, si trovano nei punti di contatto cellulacellula e cellula-matrice.
Classificate in 3 gruppi funzionali:
1) g. occludenti: saldano insieme le cellule di un epitelio impedendo il filtraggio di molecole
da una parte all’altra dell’epitelio.
2) g. di ancoraggio: attaccano meccanicamente le cellule alle loro vicine o alla matrice.
3) g. comunicanti: mediano il passaggio di segnali chimici o elettrici da una cellula all’altra.
classificazione funzionale delle giunzioni
g. occludenti
g. strette
g. Settate (invertebrati)
g. di ancoraggio
g. cellula-cellula
g. cellula-matrice
g. comunicanti
g. gap
sinapsi chimiche
plasmodesmosomi
g. occludenti:
g. strette: • Permettono agli epiteli di
servire da superficie di
separazione, non permettono il
passaggio di molecole.
• rete ramificata di filamenti
sigillanti che contornano
l’estremità apicale di ciascuna
cellula del foglietto epiteliale
• ciascun filamento è composto
da una lunga fila di proteine di
adesione transmembrana
immerse in entrambe le
membrane; i domini
extracellulari si uniscono tra
loro per occludere
Proteine principali: CLAUDINE (di
diverso tipo, presenti diversamente
nelle giunzioni strette) e
OCCLUDINE (funzione incerta, si
associano con proteine periferiche
intracellulari di membrana chiamate
PROTEINE ZO -zona occludens- che
ancorano i filamenti al citoscheletro
di actina)
g. di ancoraggio:
Forte struttura che attraversa la membrana ed è attaccata al citoscheletro. Composte da 2 classi
principali di proteine:
• proteinedi ancoraggio intracellulare
(formano una placca sulla superficie
citoplasmatica della membrana e connettono
il complesso giunzionale o ai filamenti di
actina o a filamenti intermedi)
• proteine di adesione transmembrana (coda
citoplasmatica che si attacca a una o +
proteine di ancoraggio intracellulari e a un
dominio extracellulare che interagisce con
domini extracellulari di proteine di adesione
transmembrana specifiche su un’altra cellula).
Molte giunzioni contengono proteine di segnalazione intracellulare che rendono le giunzioni capaci
di segnalare all’interno della cellula.
Le giunzioni aderenti esistono in 2 forme funzionalmente diverse:
g. aderenti: caderine + catenine
• Esistono in varie forme e sono presenti in
molti tessuti non epiteliali
• punti di attacco tondeggianti o a striscia che
connettono ndirettamente i filamenti di actina
corticali di 2 cellule interagenti
• formano una “cintura di adesione” sotto le
giunzioni strette
•morfogenesi
• un fascio contrattile di filamenti di actina si
trova adiacente alla cintura orientato in senso
parallelo alla membrana (legame actinamembrana tramite proteine come CATENINE,
VINCULINA, a-ACTININA)
desmosomi:
• punti di contatto intracellulare a forma di
bottone che ancorano le cellule le une alle altre.
•Siti di ancoraggio per filamenti intermedi che
formano una impalcatura strutturale resistente
alla tensione
•Placca citoplasmatica composta da
PLAKOGLOBINA e DESMOPLAKINA,
DESMOGLEINA e DESMOCOLLINA.
Adesioni focali:
• giunzioni cellula-matrice basate su INTEGRINE.
• rendono le cellule in grado di fare presa sulla matrice (integrine si legano all’interno della
cellula a filamenti di actina)
emidesmosomi:
• si connettono a filamenti intermedi
• connettono la cellula a una lamina basale
(LAMININA)
• domini extracellulari legano la lamina basale,
quelli intracellulari legano i filamenti di cheratina
tramite la PLECTINA.
g. comunicanti:
g. gap: costituite da proteine che formano canali
(CONNESSINE); i canali formati
(CONNESSONI) permettono il passaggio
di ioni inorganici e altre piccole molecole
solubili in acqua di passare da una cellula
all’altra.
Le giunzioni gap di tessuti diversi possono
aver diverse proprietà (esistono connessine
diverse).
•Sincronizzazione segnali elettrici
(contrazione muscolare)
•Liberazione glucosio (segnale da
epatociti innervati a epatociti non
innervati)
Possono essere regolate (pH, Ca2+)
•protezione del passaggio di segnali
nocivi da una cellula a quelle adiacenti
•Ex: danno alla membrana, passaggio
di ioni all’interno, gli ioni non devono
diffondere alle cell vicine, chiusura
delle giunzioni gap
ADESIONI CELLULA-CELLULA:
La motilità cellulare e l’adesione si combinano per far
avvenire diversi processi morfogenetici; questi processi
possono richiedere un meccanismo che diriga le cellule
alla loro destinazione finale (CHEMOTASSI,
CHEMOREPULSIONE, o GUIDA DELLA VIA).
Una volta che la cellula migrante ha raggiunto la sua
destinazione, deve riconoscere altre cellule del tipo
appropriato e unirsi a loro per assemblarsi in un
tessuto.
Le cellule aderiscono tra loro e alla matrice
extracellulare tramite proteine di superficie cellulare
chiamate MOLECOLE DI ADESIONE
CELLULARE (CAM), che possono o meno essere
dipendenti dal calcio.
caderine:
• CAM principale, calcio dipendente.
• superfamiglia di proteine che comprende caderine classiche e non
• la maggior parte sono proteine transmembrana a singolo passaggio,
possono formare dimeri e oligomeri, a livello extracellulare 5 o 6
ripiegamenti Ig simili
• mediano legame
OMOFILICO
• sono unite al citoscheletro
di actina da CATENINE
(proteine di ancoraggio
intracellulari)
•Fondamentali
nel direzionare la
morfogenesi,
comparsa e
scomparsa di
alcuni tipi
mediano lo
sviluppo
dell’embrione
selettine:
• proteine di superficie che legano carboidrati (LETTINE) che mediano
una varietà di interazioni transitorie di adesione nel torrente
circolatorio, che dipendono dal calcio
• 3 tipi: L-, P-, E-selettina (linfociti, piastrine, endotelio)
• proteine transmembrana con dominio di lettina altamente conservato
• ruolo importante nell’attaccodei globuli bianchi alle cellule endoteliali
che rivestono i vasi sanguigni
• mediano un’adesone debole (rotolamento)
•Espressione: richiamo vs zone di infiammazione
Super famiglia delle
Immunoglobuline:
•Adesione Ca2+ indipendente
•N-CAM
•Derivano da splicing
alternativo di un singolo gene
•Segnali intracell (vd. Src e
fosforilazione)
•Legano lunghe catene di acido
sialico
•Forte carica –
•Adesione debole
•Ruolo nella segregazione
cellulare
integrine:
Ca2+/Mg2+
dip
• recettori transmembrana principali sulle
cellule animali per il legame con la maggior
parte delle proteine della matrice extracellulare
• eterodimeri transmembrana (a e b)
• fanno da collegamento tra matrice e
citoscheletro
• connesse a fasci di filamenti di actina tramite
subunità b e reclutamento di TALINA, aACTININA, FILAMINA
• attività può essere modulata e può attivare vie
del segnale
TECNICHE PER LO STUDIO DI ADESIONE E MIGRAZIONE:
Test di aggregazione:
Cellule in aggregato in coltura + cellule libere: si valuta
l’aggregazione (cellule di retina VS cellule di fegato)
CAMPENOT CHAMBER: Test per valutare l’adesione e il differenziamento cellulare.
PROTOCOLLO: • Una petri viene coattata con collagene
• si scavano dei solchi con un pin-rake
• si posiziona una goccia di medium sui solchi
• si silicona la campenot e la si fa aderire sulla pertri
(con le fessure perpendicolari ai solchi)
• si mette un po’ di medium nelle fessure laterali della
campenot e si lascia in incubatore per 1 ora
• si piastrano le cellule e si mettono a contatto con i
fattori stimolanti.
MATRIGEL MATRIX: Il matrigel è una membrana basale solubile derivante da estratti di
sarcoma, indotto in topi EHS,tumore che produce tipicamente molte
proteine della matrice extracellulare.
Contiene principalmente: LAMININA, COLLAGENE IV,
PROTEOGLICANI SOLFORATI, FATTORI DI CRESCITA.
PROTOCOLLO: • preperazione di aggregati cellulari
• utilizzando una pipetta prerafreddata si posizionano gocce di matrigel su
una piastra e si incubano a 37gradi (il matrigel gelifica)
• si seminano sul matrigel gelificato gli aggregati cellulari che vengono
coperti con un’altra goccia di matrigel (incubazione a 37gradi)
• aggiunta di medium con diversi trattamenti e fattori chemiotattici.
Analogamente si procede in test di aggregazione su collagene
SOFT AGAR ASSAY:
Base Agar collagene
1. Melt 1% Agar in microwave. Warm 2X
DMEM/F12 + additives.
2. Mix equal volumes of the two solutions.
3. Add 1.5ml/ Petri dish, allow to set.
Top Agar
1. Melt 0.7% Agar in microwave. Also warm
2X DMEM/F12 + additives to the same
temperature.
2. Trypsinize cells and count.
3. Add 0.1ml of cell suspension to 10ml
centrifuge tubes.
5. Label 35mm Petri dishes with base agar
appropriately
6. For plating add 3ml 2X DMEM/F12
+Additives and 3ml 0.7% Agar to a tube, mix
gently and add 1.5ml to each replicate plate
7. Incubate assay at 37°C in humidified
incubator for 10 - 14 days.
8. Stain plates with 0.5ml of 0.005% Crystal
Violet for >1 hour, count colonies using a
dissecting microscope.
camera di migrazione di BOYDEN
tests di microchemiotassi e camera di migrazione di BOYDEN
colture cellulari
dispersione
semina
membrana
sospensione
unicellulare
pozzetti contenenti il fattore
chemiotattico
semina
migrazione
analisi dei risultati
colorazione