Principi della centrifugazione
Materiali differenti per forma, densità e dimensioni, sedimentano a diverse
velocità se posti in un campo di forza centrifuga
Campo gravitazionale indotto
con la centrifugazione
Sopranatante
Precipitato (pellet)
Sospensione
Separazione
completata
Principi della centrifugazione
Le particelle in soluzione se lasciate in condizioni di quiete tenderanno a
sedimentare per effetto della gravità
Una centrifuga è uno strumento progettato per produrre una forza
centrifuga superiore alla forza di gravità terrestre
Obiettivo: esercitare una forza maggiore del campo gravitazionale
terrestre aumentando la velocità di sedimentazione delle macromolecole,
col fine di separare macromolecole che differiscono per densità, forma e
dimensioni
In una centrifuga su una particella di massa m ruotante ad una velocità
angolare ω a distanza r dall’asse di rotazione agisce una forza verso l’esterno
e perpendicolare all’asse di rotazione:
Fc= m ω2 r
Fc= forza centrifuga
ω2 r= velocità angolare che definisce il campo centrifugo G= ω2 r
Solitamente, però, la velocità angolare del rotore viene espressa in rpm
(rivoluzioni per min), dove una rivoluzione del rotore è pari a 2 p radianti, e,
la forza centrifuga come forza centrifuga relativa RCF, cioè multiplo della
forza di gravità agente sulla particella
Considerando la forza di gravità Fg , pari al prodotto della massa m per
l’accelerazione di gravità g , cioè:
Fg = mg
si può esprimere la forza centrifuga come RCF (forza centrifuga relativa) pari
ad un multiplo della forza di gravità, cioè :
RCF = Fc /Fg = m w2r / mg = w2r/ g
La forza centrifuga relativa è il rapporto tra il peso di una massa nel campo
centrifugo ed il peso della stessa massa sottoposta alla sola azione del
campo gravitazionale
Esprimendo la velocità angolare w come rpm (w = 2p RPM/60) ed
inglobando i termini noti in un’unica costante avremo alla fine la seguente
equazione
RCF = 1.119 x 10-5 (rpm)2 r
Quindi risulta che la RCF agente su una qualsiasi particella è funzione solo
della velocità di rotazione e della distanza della particella dall’asse di
rotazione.
Pertanto particelle sottopose alla stessa RCF sedimenteranno con una
velocità che dipenderà essenzialmente dalla loro densità
Centrifughe
• Centrifuga da banco
• Ultracentrifuga
Centrifughe
Da banco
Micro
Super
Ultra
RPM
g
4000-6000
max. 16000
~ 25000
~ 80000
3000-7000
max. 22000
~ 60000
~ 600000
Rotori ad angolo
fisso - hanno gli
alloggiamenti per i
tubi disposti
circolarmente
attorno all’asse di
rotazione ad un
certo angolo
prefissato che varia
in genere tra 20° e
40°. Quando le
particelle sono
proiettate contro le
pareti, scivolano
verso il fondo con la
formazione del
pellet.

Coperchio del rotore
(a tenuta d’aria)
Coperchio del tubo
da centrifuga
Asse di rotazione
Rotori oscillanti o ad angolo mobile - A riposo, i tubi rimangono in
posizione orizzontale, ma quando il rotore inizia a girare, per effetto della
accelerazione
centrifuga,
i
tubi
ruotano
sui
perni
verso
l’esterno,
disponendosi orizzontalmente. I rotori oscillanti consentono una formazione
di bande di sedimento ben differenziate e di pellets più uniformi ma hanno
una maggiore delicatezza rispetto ai rotori ad angolo fisso.
Le tecniche centrifugative si possono suddividere in
generale in preparative e analitiche.
Preparativa: permette di separare e purificare cellule
intere, organuli subcellulari e macromolecole biologiche,
come acidi nucleici o proteine.
Analitica: permette invece di studiare le caratteristiche
di sedimentazione del campione e di determinarne il
grado di purezza o la massa molecolare.
Centrifugazione differenziale
La centrifugazione differenziale è la tecnica più usata per il
frazionamento cellulare, cioè per l’ottenimento di preparazioni di
organelli da sottoporre poi a studio. Ad esempio, centrifugando un
omogenato cellulare per tempi relativamente brevi ed a velocità
modeste sarà possibile ottenere la sedimentazione dei nuclei ma non
degli altri organelli, che hanno densità e/o dimensioni minori e che
rimarranno
nel
sovranatante.
Il
sovranatante
può
essere
ulteriormente processato per ottenere altri tipi di particelle. Mediante
l’applicazione ripetuta di questo procedimento, con l’aumento della
velocità e del tempo di centrifugazione, si può ottenere la successiva
sedimentazione di particelle sempre più piccole.
Separazione su gradiente di densita’
Il campione viene fatto stratificare su un gradiente pre-formato in una
provetta mediante il mescolamento in proporzioni diverse di soluzioni a
diversa densità. La densita’ massima non deve superare quella delle
particelle piu’ dense da separare
campione
Campo
centrifugo
G
R
A
D
I
E
T
E
Particelle a bassa densita’
Particelle ad alta densita’
Elettroforesi
Tecnica
analitica
e
separativa
basata
sul
movimento
di
particelle
elettricamente cariche immerse in un fluido per effetto di un campo elettrico
applicato mediante una coppia di elettrodi al fluido stesso
verso il catodo (particelle cariche positive= cationi)
verso l’anodo (particelle cariche negative= anioni)
-
+
- +
+ +
-
+
Mobilità elettroforetica
I fattori che influenzano la mobilità di una molecola in un campo
elettrico comprendono la carica della molecola (q), il gradiente di
voltaggio del campo elettrico (E), la resistenza di attrito del mezzo
di supporto (f)
La velocità (v) di una molecola carica che si sposta in un
elettrico è data dunque dalla seguente equazione:
v
= Eq
f
campo
 Comunemente è adoperato il termine mobilità elettroforetica (μ)
dello ione, che equivale alla velocità dello ione diviso l’intensità
del campo elettrico (v/E)
 Quando si applica una differenza
di
potenziale,
molecole
con
carica elettrica totale differente inizieranno a separarsi in funzione
della loro mobilità elettroforetica
 Anche
molecole
con
carica
elettrica
uguale,
ma
con
dimensioni molecolari differenti, si separeranno per effetto di
forze frizionali diverse
Apparecchiatura per elettroforesi
•Alimentatore elettrico
•Cella elettroforetica
•supporto
Materiali di supporto
Per la maggior parte delle tecniche elettroforetiche si adoperano gel di
poliacrilammide o di agarosio
Acrilammide
I gel di poliacrilammide sono preparati facendo copolimerizzare monomeri
di
acrilammide
in
presenza
di
piccole
quantità di N,N’-metilene
bisacrilammide (bis-acrilamide).
La bis-acrilammide, composta da due molecole di acrilammide legate da
un gruppo metilene, è utilizzata come agente in
grado di formare legami
crociati (cross-linking agent).
Acrilammide
Bis-acrilammide
Il processo di polimerizzazione dell’acrilammide è un tipico esempio di
catalisi radicalica ed inizia con l’aggiunta di ammonio persolfato e della
base N,N,N’,N’-tetrametilendiammina (TEMED).
Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la
produzione del corrispondente radicale libero (cioè una molecola con
un elettrone spaiato), nel modo seguente:
L’ammonio persolfato
è l’estere disolfato
dell’acqua ossigenata e
omolisa rapidamente a
radicali instabili
(radicali solforici).
Il TEMED è un’ammina
terziaria che reagisce
con questi radicali a
formare radicali liberi
TEMED, che a loro volta
reagiscono con
l’acrilammide inducendone
la polimerizzazione.
TEMED (iniziatore)
Se rappresentiamo il radicale libero con R· ed il monomero di
acrilammide con M, possiamo schematizzare la polimerizzazione nel modo
seguente:
R· + M → RM·
RM· + M → RMM·
RMM· + M → RMMM· ecc.
In questo modo si formano lunghe catene di acrilammide tenute insieme
tra
loro
da
legami
crociati
derivanti
dall’inserzione occasionale
all’interno della catena di molecole di bis-acrilammide.
(catalizzatore)
Acrilammide
TEMED (iniziatore)
bis-acrilammide
GEL DI POLIACRILAMMIDE
(molto idrofilico =>
trattiene grosse quantità di acqua)
Elettroforesi
Denaturante
nativa
Elettroforesi denaturante o SDS PAGE
Per semplificare l’analisi di miscele di proteine è possibile fare in modo
che la separazione elettroforetica si basi solo sulle dimensioni delle
catene polipeptidiche.
Ciò si ottiene denaturando le proteine con il detergente Sodio Dodecil
Solfato (SDS). Tale detergente si lega con forza alle proteine, le quali si
ripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDS.
La separazione delle catene polipeptidiche denaturate e rivestite di
detergente si baserà quasi esclusivamente sulle dimensioni delle molecole
proteiche per cui proteine più piccole si muovono più rapidamente
attraverso il gel, mentre quelle con dimensioni maggiori sono più rallentate
e migrano più lentamente.
Sodio Dodecil Solfato
CH3(CH2)10CH2OSO3- Na+
proteina
Elettroforesi
Elettroforesi in condizioni native
Separazione di proteine, preservando la loro attività biologica
Le proteine conservano la loro carica nativa, si separano mediante
le loro differenti mobilità elettroforetiche e gli effetti setaccio del gel
Esempio: separazione dei complessi della catena respiratoria in un
gradiente lineare o esponenziale
Elettroforesi in condizioni native
SDS PAGE
I
V
III
IV
II
I V III
IV
Isoelettrofocalizzazione
Separazione delle proteine in base al loro punto isoelettrico.
In un gel viene creato un gradiente di pH mediante l’aggiunta di
appropriati anfoliti
La miscela di proteine viene posta in un pozzetto sul gel e viene
applicato un campo elettrico. Le proteine entrano nel gel e
migrano fino a che non raggiungono un pH equivalente al punto
isoelettrico
Le proteine con punti isoelettrici diversi si distribuiscono in punti
diversi nel gel
Applicazioni dell’SDS-PAGE
 Analisi quantitativa delle
campione di interesse
proteine
presenti
nel
 Determinazione del peso molecolare di proteine
sconosciute
 Analisi qualitativa delle proteine presenti nel
campione di interesse (colorazione con Coomassie
o nitrato d’argento, o western-blotting)
Tecniche di rivelazione
Coomassie Brilliant Blue
Il
gel
è immerso in una
soluzione
che
contiene
Coomassie Brilliant Blue R-250
sciolto in acido acetico diluito e
metanolo. Rivela 0,1 mg di
proteina
Silver
Il gel si colora con una
miscela di sali d’argento e
formaldeide.Gli ioni d’argento
reagiscono con i gruppi basici
e tiolici delle proteine. 100
volte più sensibile
 Al termine della corsa elettroforetica le proteine sono trasferita su un
filtro di nitrocellulosa mediante una procedura definita elettroblotting
 Il gel e
forma
la
nitrocellulosa
sono
posti
in
un
apposito
cestello
a
di sandwich immerso in un tampone nel quale ci sono due
elettrodi paralleli
 La corrente, in direzione perpendicolare al gel, trasferisce le proteine
sul foglio di nitrocellulosa
St
C1
C2
C3
C4
C5
C6
Elettroforesi delle sieroproteine
Cromatografia
Il termine cromatografia indica un insieme di tecniche che hanno lo
scopo di separare una miscela nei suoi componenti, per permetterne il
riconoscimento qualitativo e quantitativo.
Queste tecniche sono basate sulla distribuzione differenziale dei vari
componenti fra due fasi, una chiamata fase fissa o fase stazionaria e
l’altra chiamata fase mobile o eluente, che fluisce in continuo attraverso
la fase fissa.
Le fasi essenziali di un processo cromatografico sono 3:
Caricamento del campione o della miscela da analizzare in una zona
ristretta della fase stazionaria
Eluizione della miscela dalla fase stazionaria per effettuare la
separazione nei singoli componenti
Rivelazione dei composti separati
In base alla forma del letto cromatografico
–Cromatografia su colonna (impaccata, opentubular)
–Cromatografia planare (su carta, su strato sottile)
 In base allo stato fisico della fase mobile
–Cromatografia Liquida (LC)
–Gascromatografia (GC)
 In base al meccanismo di separazione
–Scambio ionico
–Esclusione
–Affinità
Forma del letto cromatografico
Cromatografia su colonna: la fase
stazionaria è contenuta all’interno
di una colonna cilindrica, che può
riempire completamente (colonna
impaccata)
oppure
superficie
rivestirne
interna
la
(colonna
tubulare)
Cromatografia
stazionaria
è
planare:
la
fase
distribuita
su
una
superficie piana, che può essere un
supporto cartaceo (cromatografia su
carta, PC) o una lastrina in vetro o
altri
materiali
(cromatografia
strato sottile, TLC)
su
Gel filtrazione o esclusione molecolare
Separa le proteine in base alle dimensioni: la matrice presente
nella colonna è un polimero con molti legami crociati che
generano pori con un diametro specifico. Le proteine più grandi
potranno migrare nella colonna più velocemente in quanto non
possono entrare nei pori dei granuli della matrice; il loro
percorso sarà quindi diretto verso il fondo della colonna. Le
proteine più piccole potranno invece entrare nei pori allungando
il percorso che devono compiere per arrivare al fondo della
colonna
Scambio ionico
La matrice solida della colonna è un polimero sintetico contenente
gruppi carichi (quelli con gruppi anionici sono detti scambiatori di
cationi mentre quelli con gruppi cationici sono detti scambiatori di
anioni)
L’ affinità delle singole proteine del campione per i gruppi carichi
sulla colonna dipende dal pH della soluzione (che determina lo
stato di ionizzazione delle proteine) e dalla concentrazione di sali
(in grado di competere con le cariche delle proteine)
La separazione può essere ottimizzata variando gradualmente il
pH o la concentrazione salina in modo da creare un gradiente di
pH o un gradiente salino
Cromatografia per affinità
Separa le proteine in base alla loro specificità di legame
Le proteine sono trattenute sulla colonna solo se sono in
grado di legarsi a uno specifico ligando ancorato alla matrice
solida.
Dopo aver allontanato dalla colonna le proteine che non si
possono legare, la proteina viene eluita usando una soluzione
contenente ligando libero