PURIFICAZIONI PRELIMINARI:
bulk methods
Dott. Maria Elena Laguardia
DIATHEVA S.r.l
“AVITECH” Antigen Production Unit
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I Bulk methods si basano sulla precipitazione proteica
o di altre macromolecole presenti in soluzione.
I principali trattamenti preliminari sono:
Variazione del valore del pH
Riscaldamento della soluzione
Precipitazione con Sali inorganici
Trattamento con solventi organici
Precipitazione con PEG e altri polimeri miscibili con acqua
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Variazione del valore del pH
In soluzione acquosa la catena polipeptidica di un enzima
mantiene una propria struttura tridimensionale, con domini
idrofobici più interni e una superficie esterna più idrofila e
differentemente ionizzata a seconda del pH della soluzione, dove
avvengono le innumerevoli interazioni tra gli aminoacidi, gli ioni
presenti in soluzione e naturalmente le molecole d’acqua.
La diminuzione del valore del pH o il suo innalzamento possono
portare rispettivamente ad una protonazione o una dissociazione
dei protoni nei gruppi di aminoacidi delle proteine, provocando
perturbazioni nelle interazioni tali da alterare anche la quantità di
acqua di solvatazione e di conseguenza anche la solubilità.
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L’effetto massimo viene ottenuto quando la variazione
di pH porta a raggiungere il punto isoelettrico
dell’enzima, dove la proteina non presenta una carica
netta.
Mancando la repulsione di carica è favorita la
formazione di aggregati con altre molecole di enzima e
la conseguente precipitazione.
N.B. E’ indispensabile conoscere il punto
isoelettrico dell’enzima che si vuole precipitare, in
modo da raggiungere con cautela il valore di pH
corretto, evitando effetti denaturanti con tentativi
approssimativi.
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La precipitazione al pH può comunque essere eseguita
indipendentemente dal punto isoelettrico, noto
l’intervallo di stabilità ai vari pH dell’enzima.
Anche se esistono situazioni estreme, con enzimi attivi
a pH 1-2 o 12, nella maggior parte dei casi le
modifiche di valore di pH oscillano in un intervallo di
circa 4-11. Valori di pH estremi consigliano
temperature relativamente basse, di 5-10°C, ma se la
termostabilità dell’enzima rimane elevata anche al
variare del pH risulta vantaggioso l’utilizzo di
temperature più alte associando così due variabili
come pH e temperatura con conseguenti migliori
risultati di purificazione.
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Riscaldamento della soluzione
Ogni enzima ha le sue intrinseche proprietà di
termostabilità ma essa è influenzata dalle condizioni
sperimentali in cui la proteina si trova.
L’innalzamento di temperatura e il conseguente
riscaldamento
della
soluzione
causa
una
denaturazione di diverse macromolecole termolabili.
Il trattamento al calore può essere direttamente
eseguito sui lisati.
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Precipitazione con Sali inorganici
Perturbazioni delle interazioni molecolari in soluzione
possono essere causate anche dall’aggiunta di Sali
inorganici. In genere la solubilità delle proteine è
facilitata dalla presenza di Sali in concentrazione
moderata (effetto salting in). Al contrario, un’alta
concentrazione di Sali causa la precipitazione della
maggioranza delle proteine.
Le perturbazioni generate dal sale neutralizzano le
cariche della superficie proteica e sottraggono acqua di
solvatazione. Questo effetto, detto di salting out, causa
la precipitazione delle proteine senza alterare l’attività
degli enzimi.
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Diversi sono i parametri che possono essere modificati
durante la precipitazione, quali temperatura, pH e
concentrazione proteica.
Temperature di 0-10°C o anche valori maggiori di 2025°C possono essere utilizzate grazie alla ridotta
esotermicità di solubilizzazione del sale.
Anche il pH può essere mantenuto a valori prefissati
con l’aggiunta di acido o base. Valori di pH prossimi al
punto isoelettrico dell’enzima agevolano sicuramente
la sua precipitazione, permettendo anche il non
trascurabile vantaggio di consumi ridotti di sale.
Anche la concentrazione proteica ottimale viene
determinata sperimentalmente, ma in generale è
estremamente ampia.
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E’ però vantaggioso evitare soluzioni proteiche diluite
per due motivi:
1. L’enzima, se troppo diluito, può essere difficilmente
precipitabile, proprio grazie alla dispersione delle
molecole nella soluzione;
2. Soluzioni diluite comportano un consumo maggiore
di ammonio solfato, a parità di percentuale di
saturazione, rispetto alla medesima soluzione più
concentrata.
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Svantaggi della precipitazione con ammonio solfato:
1.
Industrialmente il suo uso comporta l’utilizzo di
grandi quantità di sale, specialmente se i volumi in
gioco sono cospicui;
I. Impiantisticamente,
soluzioni
saline
concentrate possono dare problemi di
incrostazioni e corrosione;
II. Le alte concentrazioni di ammonio solfato
possono determinare problemi nel trattamento
delle acque reflue, non potendo essere
scaricate prima di avere concentrazioni in
accordo con i parametri di legge vigenti.
2.
Il recupero di un precipitato, la sua risospensione, la
probabile dialisi rendono inoltre il processo
operativamente più complesso di altri bulk methods.
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Trattamento con solventi organici
I solventi organici rappresentano un ulteriore mezzo
per la precipitazione di proteine, causando un
effetto denaturante incrementato da innalzamento
della temperatura.
Il solvente organico diminuisce il valore della costante
dielettrica dell’acqua, causando una diminuzione
della solubilità proteica; considerando qualsiasi
polipeptide come un macroione, la forza di
attrazione che permette l’aggregazione e la
precipitazione risulta direttamente proporzionale al
prodotto delle cariche dei macroioni e inversamente
proporzionale alla costante dielettrica del mezzo
disperdente e al quadrato della distanza.
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Sperimentalmente si hanno risultati di precipitazione
migliore quando il trattamento viene eseguito in pH
della soluzione acquosa vicina al punto isoelettrico;
di solito, tuttavia, un pH ottimale si aggira intorno
al valore neutro di 7.
Più critica la definizione della temperatura operativa,
nella maggior parte dei casi mantenuta bassa a
circa 0-5°C.
Essendo il solvente organico un agente denaturante, la
bassa temperatura permette di contenere tale
effetto, per evitare che anche l’enzima di interesse
si denaturi. La temperatura rappresenta un
parametro critico in quanto la termostatazione
durante il processo deve tener conto della
esotermicità causata dall’aggiunta e la miscelazione
del solvente.
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Precipitazione con PEG e altri polimeri miscibili con acqua
Il PEG e altri polimeri vengono utilizzati sia per la
chiarificazione ed eliminazione di frammenti
cellulari che per la precipitazione di una parte delle
proteine in soluzione.
Il PEG non ha un effetto denaturante marcato e la sua
aggiunta alle soluzioni permette una rapida
formazione di precipitato con una dipendenza meno
stretta da pH e temperatura.
SVANTAGGIO: considerare la presenza del PEG o altro
polimero nella soluzione dell’enzima, e delle
possibili interferenze nel prodotto finale o in un
successivo passaggio di purificazione (avviene ad
esempio con ultrafiltrazione).
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PURIFICAZIONI ENZIMATICHE:
cromatografie
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La cromatografia è essenziale per la produzione di
molecole
ad
alto
valore
per
applicazioni
terapeutiche
come
antitumorali,
anticorpi
monoclonali e proteine ricombinanti.
E’ la tecnica di separazione di una miscela dove i
composti da separare si distribuiscono tra due fasi
immiscibili.
Sulla base di interazioni chimiche e chimico-fisiche, i
composti hanno diversa affinità nei confronti delle
due differenti fasi con una diversa ripartizione tra
le stesse.
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Una delle fasi cromatografiche, definita stazionaria, è
costituita da un letto statico attraverso il quale si
muove la seconda fase detta mobile.
La prima costituisce il cosiddetto letto stazionario,
solitamente un componente solido. La fase mobile
determina invece una differenziazione delle
tecniche in relazione al suo stato fisico: se è un gas
si parla di gascromatografia, mentre se è un
liquido di cromatografia in fase liquida.
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Una cromatografia può essere descritta da una
sequenza di tre fasi:
•
•
•
Eluizione della miscela mediante la fase mobile
attraverso la fase stazionaria;
Separazione dei vari componenti in seguito
all’eluizione;
Rivelazione dei diversi composti separati.
Il processo cromatografico può essere descritto come il
risultato di una serie di equilibramenti, durante il
movimento dei vari componenti della miscela
attraverso il letto di fase stazionaria.
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La separazione conseguente è proporzionale alla
differenza dei coefficienti di distribuzione o
ripartizione dei vari componenti del campione tra
le due fasi mobile e stazionaria.
Il coefficiente di ripartizione è dato da:
CR=
Un
Concentrazione del campione nella fase stazionaria
Concentrazione del campione nella fase mobile
parametro per la definizione del potere di
discriminare i componenti in una cromatografia è il
numero dei piatti teorici, che sono una
rappresentazione teorica degli equilibramenti ai
quali vanno incontro le molecole che attraversano il
sistema cromatografico.
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I
piatti
teorici
possono
essere
determinati
sperimentalmente e maggiore sarà il loro numero,
ossia maggiore il numero di equilibramenti di
ripartizione del soluto tra le due fasi, più elevata
sarà l’efficienza della colonna cromatografica.
N= 5.54 (V/W1/2)2
V= volume di ritenzione
W1/2 = ampiezza a metà del picco
Se l’efficienza è definita dal numero di piatti teorici,
anche
altri
parametri
caratterizzano
il
comportamento del soluto nella colonna.
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Tempo di ritenzione: tempo che intercorre tra
l’applicazione del campione e il rilevamento
dell’uscita di un dato componente dalla colonna
(tempo di ritenzione assoluto; si definisce relativo
quando è riferito a un altro componente di
riferimento, o anche il fronte solvente).
Risoluzione: distanza tra il centro di due picchi di
eluizione ottenuto come rapporto tra la differenza
dei due tempi di ritenzione (o anche dei due volumi
di eluizione relativi) e la media dell’ampiezza dei
picchi:
R=
V2-V1
(W2-W1)/2
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Capacità: questo fattore è relativo ai tempi di
ritenzione (T) e dipende da quanto un componente
permane nella fase stazionaria, in relazione a un
componente di riferimento che non viene trattenuto
dalla fase stazionaria (V0):
Capacità= T1- T0 x V1 – V0
T0
V0
Selettività: è data come il rapporto tra i fattori di
capacità di due componenti.
Capacità
di
legame:
misura
quantitativa
dell’adsorbimento delle molecole proteiche da parte
della fase stazionaria.
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Cromatografia in fase liquida
A. Cromatografia su strato sottile (TLC)
B. Cromatografia su carta
C. Cromatografia su colonna
A. La fase stazionaria è costituita da uno strato sottile,
in genere silice, fissata su un supporto, generalmente
una lastrina di vetro.
B. Utilizza la carta come supporto della fase stazionaria,
che può essere liquida o anche solida con particelle
adsorbite sulla carta.
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C. La cromatografia su colonna è senz’altro la
tecnica elettiva per l’analisi e la preparazione di
materiale di origine biologica.
Il sistema cromatografico è composto da:
 La colonna che funge da contenitore della fase
stazionaria, è costituita da materiali diversi: vetro,
plastica e, in HPLC e in grosse colonne industriali,
acciaio inossidabile.
 La fase stazionaria, il cuore del sistema: è la
matrice su cui avvengono le diverse interazioni con
le
molecole
biologiche
del
campione.
Le
caratteristiche fondamentali della matrice da
valutare sono:
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Composizione chimica: oltre ai materiali di natura
organica, quali gel di silice, idrossil apatite, ecc. si
hanno polimeri, sia sintetici sia naturali. La
modificazione di diversi composti naturali ha
permesso di ottenere una serie di polimeri
utilizzabili per la preparazione delle fasi stazionarie
cromatografiche.
Polisariccaridi: cellulosa, destrano, agarosio e
chitosano.
La cellulosa è una delle matrici più usate, facilmente
reperibile, con una resistenza chimica e con
possibilità di modificare alcuni residui funzionali.
Il destrano è stato isolato dagli sciroppi zuccherini
dalle barbabietole, in breve tempo è divenuto il
polimero capostipite per una vasta serie di matrici
come le resine cromatografiche della società
Amersham Pharmacia Biotech.
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Chitosano: disponibile nell’esoscheletro degli artropodi. In
forma di scaglie e fibre ha avuto limitato uso, ma in
commercio sono disponibili alcune matrici su base
chitina-chitosano sotto forma di particelle sferiche.
Supporti sintetici: resine ottenute con la tecnica della
polimerizzazione e le più importanti sono quelle con
composizione stirenica, acrilica e formofenolica.
Gruppi funzionali: la struttura tridimensionale della
matrice assume una importanza predominante in
tecniche quali la gel filtration, ma spesso è la presenza
di gruppi funzionali sulla matrice stessa che determina
il tipo di cromatografia.
Porosità: la trama più o meno fitta della rete del polimero
ha influenza sia sulla stabilità meccanica che sulla
capacità di permeazione delle molecole attraverso la
struttura tridimensionale della matrice.
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Granulometria: dimensioni delle particelle della
matrice. Le migliori performance generate da
piccole dimensioni delle particelle sono dovute al
sensibile
aumento
dell’area
superficiale
disponibile, ovvero alla superficie totale della
matrice che è a disposizione delle interazioni con le
proteine,
ossia
aumenta
il
rapporto
superficie/volume.
Rigonfiamento: le matrici hanno idrofobicità variabile
a seconda dei polimeri costitutivi e del tipo di
gruppi funzionali presenti. Si deve quindi tener
conto anche del rigonfiamento della matrice o
swelling che una resina può avere una volta
risospesa in soluzione.
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 La pompa permette di trasferire il campione e le
varie soluzioni in colonna, di farle fluire attraverso
la fase stazionaria e mantenere per tutto il corso
della cromatografia i flussi di portata idonei.
 I tubi, necessari per tutte
dell’apparato cromatografico.
le
connessioni
 Strumenti di controllo e raccoglitori. Quando la fase
mobile esce dalla colonna occorre poter monitorare
la separazione e purificazione del campione
caricato. Poiché dalla colonna si ha un flusso
continuo di soluzione, è necessario raccogliere
l’eluato in frazioni distinte per non avere
miscelazione dei picchi proteici.
 Il Campione da caricare in colonna.
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TIPI DI CROMATOGRAFIE E FASI OPERATIVE
Una prima suddivisione è quella che prende in
considerazione il tipo di interazione tra matrice e
soluto.
- dimensione della molecola: gel filtrazione o
cromatografia di esclusione;
- carica: cromatografia a scambio ionico;
- interazione biochimica specifica: cromatografia
di affinità;
- punto isoelettrico: chromatofocusing;
- idrofobicità:
idrofobica.
cromatografia
di
interazione
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Cromatografia a scambio ionico
Permette di purificare non solo proteine ed enzimi ma
anche biomolecole come acidi nucleici, piccoli
peptidi, polinucleotidi, zuccheri modificati e altre
molecole che presentino una carica.
Si basa sull’adsorbmento reversibile di molecole su
gruppi ionici con carica opposta alla propria.
In base al gruppo funzionale posseduto si distinguono:
1. Scambiatori anionici
2. Scambiatori cationici
che poi a loro volta si suddividono in:
i.
scambiatori
deboli
(la
percentuale
di
dissociazione varia molto intensamente con il pH)
ii. scambiatori forti (ionizzati in un ampio intervallo
di pH)
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Vantaggi della cromatografia a scambio ionico
•
•
•
•
•
•
Il processo è relativamente semplice, basandosi
sull’interazione elettrostatica di gruppi con carica
opposta;
Gli scambiatori ionici hanno buone capacità ed è
possibile caricare quantità considerevoli di proteine;
La tecnica di scambio ionico permette spesso di
utilizzare velocità di flusso elevate e la qualità della
separazione non è modificata sensibilmente dal volume
del campione caricato;
Può essere applicata nei primi passaggi di purificazione;
Vi sono a disposizione parecchi tipi di scambiatori
anionici e cationici, con matrici di disparata natura;
Il passaggio di scala non comporta particolari problemi.
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Gel filtrazione o cromatografia di esclusione
La gel filtrazione separa le molecole di soluto della fase
mobile in base alle loro dimensioni, attraverso il
letto di resina che funge da setaccio molecolare. La
struttura della matrice sta alla base del principio
funzionale della tecnica, anche se possono esistere
delle interazioni secondarie.
Durante l’eluizione del letto della resina, l’esclusione
dipende dalle dimensioni dei pori. Le molecole di
maggiori dimensioni potranno attraversare il letto
di resina transitando solo tra gli spazi interstiziali
tra le particelle di resina. Le molecole di soluto più
piccole passeranno sia nello spazio interstiziale che
nella trama tridimensionale dei pori della resina
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35
Tra le varie applicazioni possibili della gel filtrazione
sono da ricordare la risoluzione di monomeri
proteici quando questi, per le condizioni del mezzo,
sono organizzati in dimeri o aggregati, e la
determinazione del peso molecolare delle proteine.
Viene anche impiegata per la dissalazione: in una
colonna con una matrice con un basso limite di
esclusione, le proteine si muoveranno tutte o quasi
attraverso il volume vuoto.
Limitazioni della tecnica: volume del campione; flussi
molto bassi e altezze delle colonne che al disotto di
certi valori determinano un abbassamento sensibile
dell’efficienza della colonna.
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Cromatografia di interazione idrofobica
La complessità delle proteine fa si che spesso nella
loro struttura vi siano porzioni idrofile con altre più
idrofobe: queste ultime sono in genere almeno
parzialmente
protette
dalla
disposizione
tridimensionale della molecola, presente in
ambiente acquoso.
Questo tipo di cromatografia sfrutta la presenza di
parti idrofobiche nella struttura terziaria delle
proteine, suscettibili di interazioni con altri gruppi
idrofobici disposti su una matrice utilizzata come
fase stazionaria cromatografica.
Per avere successo, l’interazione idrofobica necessita
di concentrazioni saline medio-alte nella fase
mobile.
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Vantaggi nell’uso della cromatografia ad interazione
idrofobica.
Le matrici per interazione idrofobica hanno buone
capacità ed è possibile caricare quantità
considerevoli di proteine.
La tecnica di HIC non è modificata sensibilmente dal
volume del campione caricato.
Le colonne possono essere applicate nei primi passaggi
di purificazione.
La cromatografia può essere eseguita subito dopo altri
passaggi
di
purificazione
senza
dialisi
o
concentrazioni.
Vi sono a disposizione matrici con gruppi funzionali
con diversa idrofobicità.
Il passaggio di scala non comporta particolari
problemi.
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Cromatografia di affinità
Il principio base della cromatografia di affinità è relativo
a interazioni altamente specifiche delle biomolecole:
- anticorpo-antigene
- Enzima-inibitore reversibile
- Enzima-substrato
- Acido
nucleico-frammento
acido
nucleico
complementare
- Enzima-coenzima
- Lectina-glicoproteina
La
molecola da purificare interagisce in maniera
reversibile con un ligando covalentemente fissato
sulla matrice insolubile della fase stazionaria. Si
forma così un complesso tra molecola da purificare e
ligando.
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Tale tecnica permette di legare selettivamente la
molecola da purificare in campioni grezzi e, in linea
teorica, di purificare all’omogeneità un enzima in un
singolo passaggio da un grezzo.
Accanto a quella tradizionale di cromatografia per
affinità esistono altre matrici in cui sono stati
immobilizzati chelati metallici (IMAC-Immobilized
metal ion Adsorption Chromatography) o MCAC
(Metal Chelate Affinity Chromatography). Interazione
della biomolecola con ioni metallici complessati con
un chelante: la separazione con metalli chelati è
influenzata, oltre che dalla natura del metallo, dal pH
in quanto condiziona sia il legame metallo-resina che
quello proteina-metallo.
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La fase stazionaria deve rispondere a dei requisiti:
-
la matrice deve possedere un basso potere adsorbente, in
modo da limitare le interazioni aspecifiche con le altre
molecole presenti non desiderate.
-
La presenza di gruppi chimici, facilmente attivabili con
composti bifunzionali, sono indispensabili per l’attacco
covalente dei ligandi sulla matrice, senza che questa venga
danneggiata in alcun modo.
-
La stabilità chimica della resina deve essere buona con i vari
reagenti e con le variazioni dei parametri fisici impiegati nella
fase di eluizione.
-
Le caratteristiche di porosità e rigidità della matrice devono
essere tali da permettere l’uso di flussi lineari adeguati e il
passaggio delle molecole nella struttura tridimensionale della
fase stazionaria.
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Tra i ligandi disponibili su matrici vi sono:
Proteina A: ha la capacità di interagire con la parte Fc delle
immunoglobuline G (IgG)
Proteina G: lega anch’essa la parte Fc delle immunoglobuline G
ma permette di ampliare lo spettro applicativo con ulteriori
specie di IgG.
Lectine: proteine in grado di interagire reversibilmente con
zuccheri specifici. Permettono di separare glicoproteine,
glicolipidi, polisaccaridi etc
Eparina: è un glicosaminoglicano solfato in grado di interagire
con un gran numero di molecole quali enzimi, fattori di
crescita, recettori di ormoni e proteine strutturali.
Poli (U): acido poliuridilico permette la separazione veloce e
selettiva di RNA messaggero e altri acidi nucleici.
Coloranti: coloranti sintetici come il Cibacron Blue, Procion Red,
presentano delle somiglianze strutturali con cofattori di
enzimi quali il NAD+ e NADP+: questa caratteristica permette
di legare per affinità diverse classi di proteine.
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Vantaggi
L’interazione tra matrice e proteina è estremamente selettiva e
specifica.
La tecnica non è strettamente dipendente dal volume del
campione.
La selettività del legame permette di utilizzare la cromatografia di
affinità fin dai primi passaggi di purificazione.
Nel caso di enzimi, se la selezione è basata sull’uso di ligandi che
interagiscono a livello del sito attivo, la cromatografia è in
grado di selezionare le molecole cataliticamente attive.
Rispetto ad altre tecniche cromatografiche, quella di affinità
raggiunge i più alti indici di purificazione.
Svantaggi
La necessità di reazioni di attivazione delle matrici, qualora sia
necessario preparare un gruppo selettivo non disponibile
commercialmente.
Il costo di molte matrici attivate o con ligando pronto all’uso è
elevato.
Se si utilizza una eluizione specifica, potrebbero essere poi
necessarie filtrazioni per eliminare i ligandi.
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Chromatofocusing
E’ una cromatografia utilizzata per la separazione di
proteine che si basa su differenze di punto isoelettrico
delle stesse. Le proteine si fermano nel letto
cromatografico là dove il gradiente di pH preparato
precedentemente corrisponde al punto isoelettrico
delle varie molecole.
Industrialmente non viene spesso utilizzata per:
Costo elevato delle matrici
Necessità di allestire un gradiente di pH prima della
corsa cromatografica con i tamponi adatti
Relativa complessità della tecnica rispetto ad altri tipi di
cromatografie.
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Cromatografia in fase inversa
Il meccanismo di separazione si basa sull’interazione
idrofobica tra il soluto nella fase mobile e un ligando
immobilizzato sulla fase stazionaria. La matrice è
idrofobica e il solvente variamente polare.
Nella fase inversa non si hanno decrementi della forza ionica mediante
diluizioni di soluzioni saline, ma si varia gradualmente la polarità
della fase di eluizione con solventi organici, determinando così il
deadsorbimento delle molecole. La matrice è essenzialmente
insolubile con gruppi funzionali idrofobici legati covalentemente.
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