Principi e basi della
diagnostica virologica
A.Azzi, Firenze 19.11.2004
L’importanza della diagnosi

Esclusione di altre cause
 Impiego di terapie antivirali
 Nella prevenzione
Diagnosi precoce
Diagnosi rapida
Approcci diagnostici
Manifestazioni cliniche

Diagnosi indiretta
(sierologica)
– Sieroconversione

Diagnosi diretta
Ricerca del virus (o di
sue componenti)
– Aumento del titolo
– Presenza di IgM
specifiche
– Avidità delle IgG
Il rischio infettivo in ambito trasfusionale
Diagnosi sierologica

Risultato ricerca di anticorpi anti HIV nel cs
(03/03/03) del Sig ZZ: positivo
Il sig ZZ ha una
infezione da HIV
Diagnosi sierologica
Il sig XY gode di
 Risultato ricerca di anticorpi
anti !!!
HIV nel cs
ottima salute
(04/04/04) del Sig XY: negativo
 Risultato ricerca di anticorpi anti-HBsAg
nel cs (04/04/04) del Sig XY: negativo
 Risultato ricerca di anticorpi anti HCV nel
cs (04/04/04) del Sig XY: IgM neg, IgG pos
Diagnosi indiretta: limiti

Malattie causate da:
– riattivazione di virus latenti o infezioni
persistenti
In:
– pazienti immunodepressi

Disponibilità dei campioni
La ricerca del virus
Il microscopio elettronico
La ricerca del virus

L’isolamento
– Nell’aminale
– Nelle uova embrionate
– Nelle colture cellulari
Isolamento nelle colture cellulari

Effetti dello sviluppo del virus
– ECP (+/- specifico)
– Emoadsorbimento
– …………………
Necessità di test identificazione del virus:
neutralizzazione, IEA, IF …………..
Effetti citopatici da virus
Morte cellulare
–
–
–
–
Arrotondamento
Degenerazione
Aggregazione
Perdita di adesione al substrato
Cambiamenti istologici caratteristici: inclusioni nucleari o
citoplasmatiche
Formazione di sincizi
Cambiamenti della superficie cellulare:
espressione di antigeni virali
emoadsorbimento
Cytopathic Effect (2)
Syncytium formation in cell
culture caused by RSV (top), and
measles virus (bottom).
(courtesy of Linda Stannard, University of Cape
Town, S.A.)
Problemi nell’impiego delle
colture cellulari

Tempi lunghi per comparsa ECP

Determinanti le condizioni di conservazione del
campione.

Possibii contaminazioni batteriche e fungine.

Sostanza tossiche presenti nel campione.

Molti virus non crescono nelle colture cellulari e.g.
Hepatitis
B,
Diarrhoeal
viruses,
parvovirus,
papillomavirus.
Rapid Culture Techniques
Posibilità di individuare antigeni virali nelle colture
dopo 24- 48 ore. Es CMV
Nuovi sviluppi
Test rapidi

Ricerca di Ag dei virus influenzali A e B
 Test immunoenzimatico (ELISA)
 Supporto: membrana di nitrocellulosa
 Ab monoclonali specifici per la NP virale
 Campioni: lavaggi e aspirati nasofaringei, TF
 Tempo: 15 minuti
 Distinzione dei tipi (A-B)
Immunofluorescense
Positive immunofluorescence test for
rabies virus antigen. (Source: CDC)
(Virology Laboratory, Yale-New
Haven Hospital)
CMV pp65 antigenaemia test
(Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital)
La ricerca di componenti del virus nel
campione clinico

Antigeni virali
– Nel siero: antigeni

Acido nucleico virale
– Tecniche di
solubili HBsAg, HBeAg
amplificazione
Tecniche
p24
– …. ma non solo
di immunoprecipitazione
immunoenzimatiche
• Tecniche quantitative
nel monitoraggio dell’infezione
e della terapia
– Nelle cellule : antigeni
• Analisi delle sequenze per la
di superficie o
intracellulari
determinazione delle resistenze,
per la genotipizzazione, per
Immunofluorescenza
l’epidemiologia
immunoistochimica
Limiti tecniche “tradizionali”

EM/IEM
Isolamento

Ricerca antigeni

Virus non coltivabili
Scarsamente visualizzabili
Agentisconosciuti

Costi




Manualità
 Tempi
 Manualità
 Sensibilità

Difficoltà di individuare
antigeni (HCV,TTV…)
Tecniche di ibridazione

Impiego prevalente per rivelazione e
conferma specifictà prodotti di
amplificazione
 Ibridazione in situ

Nuove versioni
Quali tecniche di
amplificazione

Amplificazione della sequenza bersaglio
 Amplificazione del segnale
 Amplificazione della sonda
Applicazioni qualitative e quantitative
Non solo PCR
Per quali esigenze:
Virus epatite B e C
•per virus non coltivabili o
Papillomavirus
•coltivabili con difficoltà
Parvovirus B19, TTV
•a lento sviluppo - effetto
•per virus “ad alto rischio”
•per la ricerca di virus nel liquor
o comunque
•in campioni in cui la carica virale sia
bassa
Impiego delle tecniche di biologia
molecolare nella diagnostica virologica
Applicazioni quantitative per

distinzione tra infezione latente e infezione attiva
(riattivazione)
 monitoraggio
infezione (prognosi)

monitoraggio terapia

valutazione del rischio di trasmissione
La ricerca di componenti del virus nel
campione clinico

Antigeni virali
Sensibilità +
Specificità +++
Rapidità ++++

Acido nucleico virale
Sensibilità +++
Specificità +++
Rapidità ++
L’interpretazione

L’immunodepressione Può rendere poco attendibili
i risultati della sierologia


Infezioni virali latenti e infezioni virali
L’uso di tecniche molto sensibili rende
persistenti
Necessario riconsiderare il valore
diagnostico di un risultato positivo
Infezioni subcliniche
I marcatori sierologici dell’HCV nel
periodo seguente all’infezione
HCV RNA1
0
Infezione
Infection
13
2
EIA 3.0
70
EIA 2.03
80
EIA 1.04
150 (giorni)
Ortho-Clinical Diagnostics
Nuovi sviluppi

L’analisi delle sequenze nella diagnostica
virologica
– Genotipizzazione

Nuove tecnologie
– Amplificazione real time
– Microarray
– Pyrosequencing