L.S. in Scienze e tecnologie alimentari
Anno Accademico 2008/2009
Corso integrato:
Controllo delle modificazioni chimiche negli alimenti (7 CFU)
Modulo di:
Chimica analitica strumentale (4 CFU)
Giorgio Bonaga
CROMATOGRAFIA LIQUIDA (LC)
(CAS-4c)
Giorgio Bonaga
RICHIAMO DI CHIMICA
AUTODISSOCIAZIONE DELL’ACQUA
-OH
H3O+
H2O
?
H2O
Giorgio Bonaga
Nell’acqua pura è molto piccola la percentuale di molecole dissociate in ioni ossonio
e ioni ossidrile, secondo l’equilibrio:
H3O+ + -OH
H2 O + H 2 O
A 25°C, la costante di equilibrio è espressa dalla:
Kdis =
[H3O+] . [-OH]
[H2O] iniz
= 1,8 . 10-16
Il valore della costante di equilibrio conferma che l’equilibrio è decisamente spostato
verso sinistra, tanto che il termine relativo alla concentrazione dell’acqua
all’equilibrio ([H2O] eq), - pari alla concentrazione iniziale dell’acqua ([H2O] iniz)
meno la frazione x di molecole d’acqua che si dissociano ([H2O] iniz – x) - in realtà si
può equiparare alla concentrazione iniziale dell’acqua ([H2O] eq = [H2O] iniz), perché
l’approssimazione è ininfluente.
Tenendo conto che la concentrazione iniziale di 1 litro di acqua pura è, a
temperatura costante, una costante:
peso acqua
1000 g
[H2O] iniz =
numero moli
volume
=
mol wt.
1 litro
=
18
1l
= 55,55 mol/litro
Giorgio Bonaga
La Kdis può essere espressa da una nuova costante, detta prodotto ionico dell’acqua:
KW = [H3O+] . [ OH] = Kdis . [H2O]iniz= 1,8 . 10-16 . 55,55 = 10-14
In considerazione del fatto che da ogni molecola d’acqua dissociata si produce uno
ione ossonio e uno ione ossidrile, è ovvio che la concentrazione di queste due specie
ioniche è la medesima:
[H3O+] = [-OH]
Si può scrivere che:
[H3O+] = [-OH] =
KW
= 10-7 grammo-ioni/l
A 25°C, in un litro d’acqua pura (volume costante) sono presenti 10-7 (1/10.000.000)
grammo-ioni (grammo-moli) ossonio e 10-7 (1/10.000.000) grammo-ioni (grammomoli) ossidrile
•
[H3O+] = [-OH]
soluzione neutra
•
[H3O+] > [-OH]
soluzione acida
•
[H3O+] < [-OH]
soluzione basica
Essendo una reazione endotermica la dissociazione dell’acqua - nel rispetto del
principio di Le Chatelier - aumenta all’aumentare della temperatura e pertanto la
neutralità, a temperature superiori a 25°C, si raggiunge con concentrazioni degli ioni
Giorgio Bonaga
ossonio e ossidrile leggermente superiori a 10-7 grammo-moli/litro.
pH e pOH
(pH = pondus hydrogenii = potenziale dell’idrogeno)
(pOH = pondus oxidrilii = potenziale dell’ossidrile)
L’ordine di grandezza estremamente piccolo delle concentrazioni degli ioni ossonio
ed ossidrile suggerisce l’introduzione di un operatore matematico che consenta una
percezione immediata del carattere neutro, acido e basico delle soluzioni ed anche
un calcolo più rapido nelle applicazioni quantitative di questi concetti.
Questo operatore è il logaritmo negativo in base dieci (- log) che, come tutti i
logaritmi, esprime “l’esponente da dare alla base per ottenere il numero”.
Concettualmente l’introduzione del logaritmo capovolge l’obiettivo del calcolo
matematico delle concentrazioni delle soluzioni.
Infatti, se la simbologia [H3O+] = 10-6 indica che sono presento 10-6 grammo-ioni
H3O+ in 1 litro di soluzione, il –log [H3O+] = pH = - log 10-6 = 6 individua invece
l’esponente che bisogna dare alla base 10 per ottenere in quanti litri di soluzione è
presente 1 grammo-ione H3O+, ovvero 106 litri.
Il pH, pertanto, non definisce la concentrazione degli ioni ossonio della soluzione,
ma invece la diluizione di una soluzione che contiene 1 grammo-ione di H3O+.
Il discorso è del tutto analogo per il pOH.
Giorgio Bonaga
Il cologaritmo in base dieci (-log) converte la concentrazione (volume
costante e soluto variabile) in diluizione (soluto costante e volume
variabile), ovvero esprime in quanti litri (diluizione) di acqua pura è presente
1 grammo-ione ossonio (o ossidrile) anziché quanti grammo-ioni di ossonio
(o di ossidrile) sono presenti in 1 litro d’acqua pura (concentrazione) .
1/10.000.000 (10-7) grammo-ioni H3O+
in 100 litri d’acqua pura
(CONCENTRAZIONE)
100 grammo-ione H3O+
in 10.000.000 (107) litri d’acqua pura
(DILUIZIONE)
- log 10-7
Giorgio Bonaga
107
106
105
104
103
100
102
101
Giorgio Bonaga
Dal momento che nell’acqua pura
[H3O+] = [-OH] = 10-7
è intuitivo che nell’acqua pura:
pH = pOH = 7
ed anche che:
pH + pOH = 14
da cui:
pOH = 14 – pH
e
pH = 14 - pOH
Dal concetto stesso di pH si può dedurre che esso varia nell’intervallo 0-14 per
soluzioni 1N, ma anche che il pH può assumere valori inferiori a 0 e superiori a 14 in
soluzioni di concentrazione > 1N
ESEMPIO
Qual è il pH di una soluzione 10 N di HCl ?
Essendo l’HCl un acido forte completamente dissociato, la N della soluzione fornisce
direttamente la concentrazione di ioni ossonio:
[H3O+] = 10 = 101
pH = - log 101 = -1
(è presente un grammo-ione H3O+ in 10-1 litro = 1/10 litro = 100 ml)
Giorgio Bonaga
[H3O+]
pH
[-OH]
pOH
10-15
15
101
-1
10-14
14
100
0
10-13
13
10-1
1
10-12
12
10-2
2
10-11
11
10-3
3
10-10
10
10-4
4
10-9
9
10-5
5
10-8
8
10-6
6
10-7
7
10-7
7
10-6
6
10-8
8
10-5
5
10-9
9
10-4
4
10-10
10
10-3
3
10-11
11
10-2
2
10-12
12
10-1
1
10-13
13
100
0
10-14
14
101
-1
10-15
15
Giorgio Bonaga
pka e pkb
Giorgio Bonaga
Per il calcolo del pH di soluzioni di acidi e basi deboli non è sufficiente conoscere la
loro concentrazione iniziale, in quanto non sono completamente dissociati in
soluzione acquosa. Per determinare quale concentrazione assumeranno gli ioni H3O+
(o -OH) è quindi necessario conoscere anche la loro costante di dissociazione.
1) Per un generico acido monoprotico HA, l'equilibrio di dissociazione è:
H 3 O+ + A -
HA + H2O
La costante di equilibrio, detta costante di dissociazione acida (o kappa acida), è:
ka =
[H3O+] . [A-]
[HA]
Analogamente al pH, anche la costante di dissociazione acida può essere convertita
nella diluizione di ioni ossonio in soluzione, utilizzando il logaritmo negativo in
base 10 della ka:
pka = – log ka
Più elevato è il valore del pka maggiore è la diluizione degli ioni ossonio, ovvero più
elevato è il pka minore è la forza dell’acido.
Per gli acidi deboli poliprotici ci sono tante costanti di dissociazione quanti sono gli
atomi di idrogeno dissociabili: costante di prima dissociazione (kaI), costante di seconda
dissociazione (kaII) , ecc., dalle quali si possono calcolare le corrispondenti pkaI, pkaII,
ecc.
[H3O+] . [HSO3-]
H2SO3 + H2O
H3O+ + HSO3- kaI =
= 1,54 . 10-2
[H2SO3]
HSO3- + H2O
H3O+ + SO3--
kaII =
[H3O+] . [SO3--]
[HSO3-]
= 1,02 . 10-7
Naturalmente l'acido cede più facilmente il primo protone H+, mentre il secondo
protone H+, che deve staccarsi da uno ione negativo, è trattenuto con maggiore
forza. Il primo equilibrio di dissociazione è quindi più spostato verso destra del
secondo. È questo un comportamento generale: tutti gli acidi deboli poliprotici
mostrano valori decrescenti delle ka successive alla prima e pertanto anche valori
crescenti dei pka.
Giorgio Bonaga
2) Per una generica base monossidrilica BOH, l'equilibrio di dissociazione è:
BOH
B+ + - OH
La costante di equilibrio, detta costante di dissociazione basica (o kappa basica), è:
kb =
[B+] . [-OH]
[BOH]
Anche la costante di dissociazione basica può essere convertita nella diluizione di
ioni ossidrile in soluzione, utilizzando il logaritmo negativo in base 10 della kb:
pkb = – log kb
Più elevato è il valore del pkb maggiore è la diluizione degli ioni ossidrile, ovvero
più elevato è il pkb minore è la forza della base.
Per le basi deboli poliossidriliche ci sono tante costanti di dissociazione quanti sono
gli ossidrili dissociabili: costante di prima dissociazione (kbI), costante di seconda
dissociazione (kbII) , ecc., dalle quali si possono calcolare le corrispondenti pkbI, pkbII,
ecc. Naturalmente la base cede più facilmente il primo ossidrile -OH, mentre il
secondo ossidrile -OH, che deve staccarsi da uno ione positivo, è trattenuto con
maggiore forza. È questo un comportamento generale: tutti le basi deboli
poliossidriliche mostrano valori decrescenti delle kb successive alla prima e pertanto
anche valori crescenti dei pkb.
Giorgio Bonaga
C) CROMATOGRAFIA IONICA
1) CROMATOGRAFIA DI SCAMBIO IONICO
(Ion Exchange Chromatography = IEC)
1. GENERALITA’
È idonea alla separazione di composti ionici o ionizzabili (acidi e basi
organiche) che possono interagire con gruppi ionici.
FASE STAZIONARIA: polimeri o silice funzionalizzata a cui sono legati
gruppi carichi: anioni sulfonil- (-SO3-) o carbossil- (–COO-) come scambiatori di
cationi; cationi dialchilammino- (-NHR2+) o trialchilammino- (-NR3+) come
scambiatori di anioni.
FASE MOBILE: contiene un controione di carica opposta al gruppo ionico
della superficie, in uno stato di equilibrio per effetto della formazione di una
coppia ionica.
Lo scambio dipende dal pH della fase mobile, dalla forza ionica (selettività)
degli ioni fissati sulla fase stazionaria e dalla forza ionica dello ione della fase
mobile che con essi si scambia, dall’attività (concentrazione) dello ione della
fase mobile, dalla temperatura.
Giorgio Bonaga
SCAMBIATORE CATIONICO: anioni sulfonil-
O
O
S
CH
H+
K+
O-
-
SO3-
SO3
CH2 CH2 CH
CH
Li+
CH2
CH
SO3-
Na+
n
CH
Rb+
-O3S
CH2
CH
CH2 CH
n
Giorgio Bonaga
CROMATOGRAFIA LIQUIDA DI SCAMBIO IONICO
Scambio cationico
+Cs
Si
Si
O
S
O
S
O-
+K
fase mobile
(ionica)
+Cs
+
O
O-
O
Si
O
S
O
O- +Na
fase stazionaria
silice scambiatrice
(anionica)
Giorgio Bonaga
SCAMBIATORE ANIONICO: cationi trimetilamminoCH3
CH3
N
+
-
CH3
HO
CH
Cl
-
CH
CH2 CH2 CH
CH2
CH2 CH
CH
CH2
CH2
CH
n
CH
CH2
n
+ CH3
N
CH3
CH3
Giorgio Bonaga
CROMATOGRAFIA LIQUIDA DI SCAMBIO IONICO
Scambio anionico
-CN
-CN
Si
Si
R
N+
fase mobile
(ionica)
+
R
N+
R
R
-Cl
R
R
Si
R
N+
R
R
-OH
fase stazionaria
silice scambiatrice
(cationica)
Giorgio Bonaga
EQUILIBRI IONICI NELLA IEC
scambio cationico
X+(sol) + Y+ -O3S-FS
Kd =
scambio anionico
[X+ -O3S-FS] [Y+(sol)]
[X+
] [Y+ -O S-FS]
(sol)
X-(sol) + Y- +NR3-FS
Kd =
X+ -O3S-FS + Y+(sol)
3
VS
X- +NR3-FS + Y-(sol)
[X- +NR3-FS] [Y-(sol)]
[X] [Y- +NR -FS]
(sol)
= k’
VM
3
= k’
VM
VS
La costante di equilibrio di distribuzione Kd (o coefficiente di distribuzione)
determina il valore del fattore di capacità k’ di uno ione e quindi il suo tR.
Giorgio Bonaga
ORDINE DI SELETTIVITA’
La Kd è condizionata dal tipo di scambiatore e dall’attitudine dei due ioni a
scambiarsi. Per un particolare scambiatore entrano in gioco due fattori:
1. lo ione che viene fissato
2. il controione che viene spostato
L’attitudine dei cationi e degli anioni ad essere fissati sui gruppi carichi
della fase stazionaria è direttamente proporzionale al valore della loro Kd .
Per i cationi e gli anioni si può indicare il rispettivo ordini di selettività:
scambio cationico: Ba++>Ca++>Ni++>Cu++>Mg++>Ag+>Rb+>Cs+>K+>NH4+>Na+>H+>Li+
scambio anionico: HSO4->ClO3->NO3->ClO2->ClO->Br->CN->HSO3->NO2->Cl->HCO3->
HCOO->RCOO->HO->F-
E’ facile comprendere che Na+ sposta Li+ dalla fase stazionaria, ma non
viceversa. O meglio, affinchè Li+ sposti Na+ in modo significativo occorre
aumentare l’attività (cioè la concentrazione ionica) di Li+ nella soluzione, in
modo che l’equilibrio, per mantenere costante il valore della Kd, si sposti
verso destra.
Giorgio Bonaga
I fattori che intervengono nello scambio ionico sono:
1. la posizione nell’ordine di selettività dello ione da fissare nella fase
stazionaria;
2. la posizione nell’ordine di selettività degli ioni da spostare nella fase
mobile;
3. le attività (concentrazioni ioniche) dello ione da fissare e degli ioni da
spostare;
4. lo ione della fase mobile deve occupare una posizione nell’ordine di
selettività non troppo lontano da quelle degli ioni da spostare.
Dopo aver fissato sullo scambiatore Na+ e K+ si può eluire con una
soluzione di Li+Cl- ad opportuna concentrazione. Avviene lo scambio ionico
e i due ioni da separare eluiscono con tR differenti: tRK+ > tRNa+ (in base
alla loro posizione nella scala di selettività).
Dopo aver fissato sullo scambiatore Ni++ e Ba++, l’eluizione con una
soluzione di Li+Cl- non riuscirebbe a separare i due ioni, perché sono troppo
lontani da Li+ nella scala della selettività (bisognerebbe eluire con un grande
volume di fase mobile e per un tempo lungo). In questo caso si deve usare
una fase mobile dotata di maggiore capacità eluente, ad esempio MgCl2.
Giorgio Bonaga
2. FASE STAZIONARIA
Giorgio Bonaga
Vi sono vari tipi di fasi stazionarie:
a) POLIMERI
Sono resine ottenute da copolimeri reticolati di stirene-divinilbenzene (8%)
sulle quali vengono fissati i gruppi ionogeni positivi e negativi. La
reticolazione ha lo scopo di rendere il polimero insolubile nei solventi e di
conferirgli una stabilità strutturale alle pressioni di esercizio della colonna,
in modo da non restringere troppo la dimensione dei pori. Il diametro delle
particelle non deve essere superiore a 10 mm per ottimizzare il diametro dei
pori.
b) SILICE
Viene utilizzata silice porosa e silice pellicolare.
b1) Silice porosa
Costituita da particelle sferiche o irregolari, viene funzionalizzata per
silanizzazione allo scopo di fissare le catene ionogene sui gruppi silanolici e
sulla superficie dei pori.
-CH2-CH2-COO -CH2-CH2-SO3-
carbossietil- (debolmente acido)
sulfoniletil- (fortemente acido)
scambio
cationico
-CH2-CH2-NH3 +
-CH2-CH2-N(CH3)3-
amminoetil(debolmente basico)
trimetilamminoetil- (fortemente basico)
scambio
anionico
b2) Silice pellicolare
Costituita da particelle sferiche più grandi, viene funzionalizzata solo sulla
superficie esterna allo scopo di fissare le catene ionogene soltanto sui gruppi
silanolici.
SILICE
POROSA
SILICE
PELLICOLARE
RESINA
S-DVB
5-10
30-40
7-10
0,5-2,0
0,01-0,1
3-5
molto buona
eccellente
scarsa
forma delle particelle
sferica o irregolare
sferica
sferica
pressione di esercizio
molto alta
bassa
alta
alta
modesta
bassa
slurry
a secco
slurry
2-8
2-8
0-14
media
alta
bassa
PROPRIETA’
diametro (mm)
capacita di scambio (meq/g)
rigidità strutturale
efficienza
tecnica di impaccamento
intervallo di pH
velocità di rigenerazione
Giorgio Bonaga
La silice porosa è il materiale che consente le migliori separazioni perché
riassume una serie di proprietà idonee a questo tipo di cromatografia:
• ha una buona capacità di scambio;
• è resistente alle elevate pressioni di esercizio;
• ha elevata efficienza;
• ha una buona capacità di rigenerazione;
• ha però un limitato intervallo di pH di esercizio (2-8);
• ha anche un costo elevato, sebbene inferiore a quello dei polimeri.
In ogni caso la porosità ideale è quella che non ritarda troppo lo scambio tra
la fase stazionaria e la fase mobile all’interno dei pori, porosità che richiede
particelle con un diametro non superiore a 10 mm.
poro piccolo
poro grande
+
+
d = 10 mm
+
+
+
3. FASE MOBILE
Le principali caratteristiche della fase mobile sono:
a) EFFETTO TAMPONE
Le specie ioniche che stanno alla base dello scambio ionico possono derivare
da elettroliti forti (sostanze inorganiche) e da elettroliti deboli (sostanze
organiche). L’acido acetico e l’acido formico, ad esempio, possono essere
dissociati o no in funzione del pH.
Proprio per garantire che i soluti siano nella forma ionica, la fase mobile
deve contenere un componente con capacità tamponante. Naturalmente per lo
scambio anionico la fase mobile deve avere valori elevati di pH, mentre per
lo scambio cationico deve avere valori sufficientemente bassi di pH.
In pratica, la fase mobile deve avere un pH di almeno una unità superiore al
pka del soluto nello scambio anionico e di almeno una unità inferiore al pka
del soluto nello scambio cationico.
ESEMPIO
acido acetico: pka = 4,75
ione ammonio: pka = 9,0
la fase mobile deve avere pH = 5,75
la fase mobile deve avere pH = 8,0
Giorgio Bonaga
Si immagini di dover separare il sistema CH3COOH/CH3COO- (pka=4,75) e
HCOOH/HCOO- (pka=3,5) con uno scambiatore anionico.
 a 4,75 < pH > 3,5 l’acido formico si dissocia e lo ione formiato viene
trattenuto, mentre l’acido acetico, non dissociato, eluisce.
 a pH > 7,0 entrambi gli acidi sono dissociati e vengono trattenuti in
modo differente dalla fase stazionaria (l’acido formico è più trattenuto, in
base alla scala di selettività) .
• l’aumento di pH della fase mobile fa aumentare la dissociazione dei soluti nello
scambio anionico, pertanto aumentano i loro tempi di ritenzione; la diminuzione di
pH della fase mobile produce l’effetto contrario
• la diminuzione di pH della fase mobile fa aumentare la dissociazione dei soluti
nello scambio cationico, pertanto aumentano i loro tempi di ritenzione; l’aumento
di pH della fase mobile produce l’effetto contrario
I tempi di ritenzione dei soluti sono inversamente proporzionali alla
concentrazione della soluzione tampone perché se è vero che i soluti del
tampone mantengono costante il pH della fase mobile, è anche vero che essi
stessi sono degli ioni che entrano in competizione con i soluti nello scambio
ionico. Nello scambio anionico è la concentrazione dell’anione del tampone
ad essere competitivo, nello scambio cationico è competitivo il catione del
tampone.
Giorgio Bonaga
Quando il pH della fase mobile è minore di 2 o maggiore di 8, la silice non è
più utilizzabile e bisogna ricorrere a fasi stazionarie costituite da polimeri. Il
pH della fase mobile incide anche sulla scelta delle catene ionogene: mentre i
gruppi sulfonile (-SO3-) possono dare scambio cationico anche a pH
nettamente acido perché hanno scarsa attitudine a protonarsi, i gruppi
carbossile (-COO-) danno scambio cationico soltanto a pH neutro o basico,
proprio per la loro facilità a protonarsi.
TAMPONE
pka
pH
fosfato
pka(I)
pka(II)
pka(III)
2,1
7,2
12,3
1,1 – 3,1
6,2 – 8,2
11,3 – 13,3
citrato
pka(I)
pka(II)
pka(III)
3,1
4,7
5,4
3,1 – 4,1
3,7 – 5,7
4,4 – 6,4
formiato
3,8
2,8 – 4,8
acetato
4,8
3,8 – 5,8
tris(idrossimetil)-amminometano
8,3
7,3 – 9,3
borato
9,2
8,2 – 10,2
dietilammina
10,5
9,5 – 11,5
Giorgio Bonaga
CLASSI SEPARABILI PER IEC
CLASSE
pka
ammidi
0-1
pirroli
0,3
solfossidi alifatici
1,5
tiazoli
1-3
ammine aromatiche
4-7
amminoacidi (-COOH)
2-4
amminoacidi (-NH2)
6-12
acidi carbossilici
4-5
tioli aromatici
6,5
tioli alchilici
10,5
fenoli
10-12
ammine alifatiche
9-11
carbazoli
12
Giorgio Bonaga
N
H
R C
O
NH3+
ammide
NH3+
N+
H H
pirrolo
H C NH3+
amminoacido
OH
R SH
tiolo alifatico
-
solfossido alifatico
R
COOH
ammina aromatica
O
+
R S+ R
O
fenolo
R C
H
tiazolo
SH
O
O+
H
S+
H
acido carbossilico
R + H
N
R
H
ammina alifatica
tiolo aromatico
H + H
N
carbazolo
Giorgio Bonaga
b) EFFETTO DELLA CONCENTRAZIONE SALINA
Per modificare i tR dei soluti, senza modificare il pH della fase mobile, si può
aggiungere un sale (es.: NaNO3). La concentrazione di questo sale, per effetto
dell’azione competitiva degli ioni di cui è formato sullo scambio ionico, è
un’altra variabile che agisce sui tR dei soluti.
• l’aumento della concentrazione salina, a parità di pH, determina la diminuzione
della capacità della fase stazionaria di trattenere i soluti, pertanto si ha una
riduzione dei loro tR;
• la diminuzione della concentrazione salina, a parità di pH, determina un aumento
della capacità della fase stazionaria di trattenere i soluti, pertanto si ha una
aumento dei loro tR.
Ritenzione relativa
20
10
5
0
0,1
0,5
NaNO3 (molarità)
1,0
Giorgio Bonaga
a) EFFETTO DEI SOLVENTI ORGANICI NELLA FASE MOBILE
L’aggiunta di solventi organici alla fase mobile non ha alcun effetto sui tR di
cationi metallici e anioni inorganici, ma modifica sensibilmente i tR di
cationi e anioni organici perché influenza le interazioni tra i soluti e la fase
stazionaria e tra i soluti e la fase mobile.
Uno scambiatore a base di silice funzionalizzata con tetralchilammonio, ad
esempio, può dare sia scambio anionico che adsorbimento di molecole o ioni
organici contenenti gruppi alchilici, per interazione idrofobica tra le catene
alchiliche. Aggiungendo alla fase mobile un solvente organico le interazioni
idrofobiche che stanno alla base dell’assorbimento vengono inibite.
CH33
CH3
CH
CH
CH22
CH22
-CH
CH
COO
CH22
CH22
COO
OOC
CH3
CH2
CH3
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH3
Si
Si
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
adsorbimento
R
R
N+ R
scambio anionico
Giorgio Bonaga
4. DETECTOR NELLA IEC
a) RIVELATORI ELETTROCHIMICI
Poiché lo scopo della cromatografia ionica è la separazione e la
determinazione di specie ioniche, il rivelatore più idoneo è quello
conduttometrico, che misura la conduttanza della soluzione effluente.
Le più moderne celle conduttometriche, con acquisizione digitale,
permettono un ampio intervallo operativo senza necessità di variare
manualmente il range di lavoro, entro un intervallo dinamico di rivelazione
conduttimetrica molto esteso (da 0,1 nanosecondi a 15 millisecondi). Il
trattamento del segnale digitale, comandato da microprocessore, rileva
automaticamente le concentrazioni alte e basse dei soluti nel corso
dell'esecuzione della medesima serie. Un aspetto importante è l'accuratezza
del controllo della temperatura, che si realizza con sistemi di controllo
integrati della colonna e del rivelatore. La cella può essere riscaldata in
modo indipendente dagli altri componenti del cromatografo tra 35° e 55°C,
per assicurare la massima accuratezza nel controllo di temperatura,
eliminando in questo modo qualunque deriva dovuta a variazioni
ambientali di temperatura. In altri casi, per assicurare una temperatura
omogenea durante l'intero corso dell'analisi, il rivelatore viene inserito nel
vano portacolonna, termostatato da 30° a 60°C.
Giorgio Bonaga
b) RIVELATORI SPETTROFOTOMETRICI
In genere i cromatografi ionici possono essere configurati con un qualsiasi
rivelatore ottico tra quelli messi a disposizione dal mercato. Ad esempio,
uno spettrofotometro a diode array (DAD) a matrice di 1024 fotodiodi ad
alta risoluzione, caratterizzato da basso rumore di fondo e bassa deriva
oppure un rivelatore UV-VIS con lampade al deuterio e al tungsteno per
operare nel range 190-800 nm. L'uso di questi rivelatori è utile nella
rivelazione di specie con cromoforo nell'UV, come ad esempio il nitrato, ma
soprattutto trovano applicazioni in metodi, anche ufficiali, che prevedono la
derivatizzazione post-colonna.
c) RIVELATORI MS
Lo spettrometro di massa con ionizzazione a pressione atmosferica (Atmospheric
Pressure Ionization = API) si è rivelato un insostituibile rivelatore per la
cromatografia liquida in generale e per la cromatografia ionica in
particolare, grazie alla capacità di risolvere problemi analitici non superabili
con le tecniche di rivelazione elettrochimica o spettrofotometrica. Sono
disponibili sul mercato sistemi dedicati IC-MS, gestiti con un unico
software. L'uso della soppressione a membrana prima dell'interfaccia API
permette di modificare il pH della soluzione da analizzare ottimizzando
così la fase di ionizzazione per elettrospray.
Giorgio Bonaga
La scelta dello spettrometro di massa come rivelatore per IC si basa sul
principio di mettere a disposizione un rivelatore affidabile, robusto e di
facile utilizzazione, anche per operatori non esperti. Per ottimizzare la
sensibilità strumentale l’operatore deve agire solo su due parametri:
1) la temperatura del probe dell’elettrospray, in funzione del flusso e della
composizione dell'eluente, ;
2) il potenziale della sorgente.
Un aumento del potenziale della sorgente produce una maggiore
frammentazione delle molecole per effetto di collisioni indotte, generando
frammenti diagnostici che aumentano la specificità dell'analisi e possono
dare informazioni strutturali aggiuntive per l’identificazione dei soluti.
Dal punto di vista spettrometrico la caratteristica più importante è la
possibilità di ottimizzare la risposta dell'analizzatore nell'intervallo di masse
basse, tipiche degli ioni inorganici. Questa tecnica detta ELMO (Enhanced
Low Mass Option) permette di estendere il “mass range” al di sotto di m/z 19,
con un aumento della sensibilità di 350 volte per lo ione m/z 18 e con una
limitata perdita di risposta alle masse più alte. Questa opzione si ottiene
mediante una modifica dell'hardware, ovvero con l'introduzione di una
lente RF esapolare da 5 mm e di due generatori di radiofrequenza separati.
Giorgio Bonaga
SO3- -
0 7
3,0 9
6,0
9,0
12,0
min
IEC di un vino bianco (solfiti)
• Colonna analitica: 200 mm x 4 mm i.d., IonPac AS12A
• Precolonna: 50 mm x 4 mm i.d., IonPac AG12A
• Elettrolita di trasporto: NaOH 0,1 M
• Flusso: 1,0 ml/min
• Sample Loop: 20 ml.
Giorgio Bonaga
O
H3C
O
N
N
N
CH3
O CH2CH3
O
H3C
N
C
N
H
CH3
fenacetina
caffeina
O
H3C
C
N
H
acetanilide
0 7
5,0
10
min
IEC di un farmaco
(analgesico, antinfiammatorio)
• Colonna analitica: scambiatore anionico
• Fase mobile: acquosa a pH 5,5
• Rivelatore: UV a 254 nm
Giorgio Bonaga
2) CROMATOGRAFIA IONICA CON SOPPRESSIONE
(Suppressed Ion Chromatography = SIC)
1. SOPPRESSIONE A COLONNA
La colonna analitica viene collegata ad una seconda colonna (colonna di
soppressione) che elimina il contributo alla conducibilità dovuto alla fase
mobile (solventi, tampone, sali), così che la conducibilità sia soltanto quella
dei soluti che sono stati separati, anche se presenti in piccole concentrazioni.
a)SOPPRESSIONE DI ANIONI
Se la fase mobile fosse costituita da NaOH (o NaHCO3), la fase stazionaria da
una resina a scambio anionico e il campione da separare contenesse NaF,
NaCl e NaBr, quali sarebbero i passaggi logici nella colonna analitica ?
1. la colonna viene saturata con gli anioni –OH (o HCO3-) della fase mobile;
2. caricando il campione la resina scambia gli –OH con gli ioni F-, Cl- e Br-;
3. al passaggio della fase mobile (eluizione) gli ioni F-, Cl- e Br- si scambiano
nuovamente con gli ioni –OH della fase mobile ed eluiscono in questo
ordine, nel rispetto della scala di selettività;
4. all’uscita dalla colonna si ha la seguente composizione:
fase mobile: NaOH (o NaHCO3)
soluti separati: NaF, NaCl, NaBr
Giorgio Bonaga
La composizione dell’eluato richiede alcune considerazioni: la concentrazione
e la conducibilità della fase mobile (NaOH o NaHCO3) è molto elevata mentre
le concentrazioni e le conducibilità dei soluti sono talmente basse che non
produrrebbero variazioni significative dei segnali del detector, con enorme
riduzione della sensibilità strumentale.
Questo limite può essere superato collocando tra la colonna analitica e il
detector una colonna a scambio cationico saturata di ioni H+ (HCl). Gli ioni
H+ vengono scambiati con gli ioni Na+ sia perché sono meno trattenuti dalla
fase stazionaria (in accordo con la scala di selettività), sia perché reagiscono
con gli ioni –OH (o HCO3-) con formazione di H2O (o H2CO3 = H2O+CO2).
All’uscita dalla colonna di soppressione si ha la seguente composizione:
fase mobile:
soluti separati:
H2O (o H2O + CO2)
HF, HCl, HBr
Il risultato netto è che le nuove specie della fase mobile hanno una
conducibilità minima, mentre le nuove specie dei soluti sono acidi con valori
di “ka” che producono una conducibilità elevata.
Naturalmente la colonna di soppressione si esaurisce e va rigenerata con una
soluzione di HCl prima di essere reimpiegata.
Giorgio Bonaga
b) SOPPRESSIONE DI CATIONI
Se la fase mobile fosse costituita da HCl (o H2SO4), la fase stazionaria da una
resina a scambio cationico e il campione da separare contenesse LiCl, NaCl e
KCl, quali sarebbero i passaggi logici nella colonna analitica ?
1. la colonna viene saturata con gli anioni H + della fase mobile;
2. caricando il campione la resina scambia gli H+ con gli ioni Li+, Na-+e K+;
3. al passaggio della fase mobile (eluizione) gli ioni Li+, Na-+e K+ si
scambiano nuovamente con gli ioni H+ della fase mobile ed eluiscono in
questo ordine, nel rispetto della scala di selettività;
4. all’uscita dalla colonna si ha la seguente composizione:
fase mobile:
HCl (o H2SO4)
soluti separati: LiCl, NaCl, KCl
La composizione dell’eluato richiede alcune considerazioni: la concentrazione
e la conducibilità della fase mobile (HCl o H2SO4) è molto elevata mentre le
concentrazioni e le conducibilità dei soluti sono talmente basse che non
produrrebbero variazioni significative dei segnali del detector, con enorme
riduzione della sensibilità strumentale.
Giorgio Bonaga
Questo limite può essere superato collocando tra la colonna analitica e il
detector una colonna a scambio anionico saturata di ioni –OH (NaOH). Gli
ioni -OH vengono scambiati con gli ioni Cl- perché sono meno trattenuti dalla
fase stazionaria (in accordo con la scala di selettività), sia perché reagiscono
con gli ioni H+ con formazione di H2O.
All’uscita dalla colonna di soppressione si ha la seguente composizione:
fase mobile:
soluti separati:
H2 O
LiOH, NaOH, KOH
Il risultato netto è che le nuove specie della fase mobile hanno una
conducibilità minima, mentre le nuove specie dei soluti sono basi con valori di
“kb” che producono una conducibilità -elevata.
+
O Na
Naturalmente la colonna di soppressione si esaurisce e va rigenerata con una
soluzione di NaOH primaHO
di essere reimpiegata.
N
N
Nel caso della cromatografia ionica di metalli
di transizione la soppressione
N
produce degli idrossidi non dissociati o insolubili [Ni(OH)2, Cu(OH)2, ecc.] e
PAR
pertanto anziché un detector conduttometrico
si utilizza un rivelatore
spettrofotometrico, previo trattamento della soluzione del campione - prima
dell’eluizione in colonna analitica - con un indicatore metallocromico [ad es.:
sale monosodico del 4-(2-piridilazo) resorcinolo o PAR] in grado di formare i
cromofori necessari alla rivelazione UV-VIS.
Giorgio Bonaga
SOPPRESSORE A COLONNA
fase mobile
campione
pompa
colonna analitica
colonna di soppressione
cella conducimetrica
Giorgio Bonaga
2. SOPPRESSIONE A FIBRA CAVA
Il limite della colonna di soppressione è che si esaurisce e la sua rigenerazione
non consente un processo in continuo. Un’alternativa è la soppressione a fibra
cava, cioè una fibra cilindrica nel cui canale interno passa la soluzione eluente
proveniente dalla colonna analitica e all’esterno, in controcorrente, viene fatta
fluire la soluzione che deve provvedere alla soppressione degli ioni della fase
mobile.
a) SOPPRESSIONE DI ANIONI
La fibra è permeabile ai cationi Na+ (in uscita) della fase mobile NaOH e H+
(in entrata) della soluzione di soppressione di HCl. Il risultato netto è la
conversione degli ioni –OH della fase mobile in H2O e dei soluti NaF, NaCl e
NaBr nei corrispondenti acidi HF, HCl e HBr.
b) SOPPRESSIONE DI CATIONI
La fibra è permeabile agli anioni Cl- (in uscita) della fase mobile HCl e -OH (in
entrata) della soluzione di soppressione di NaOH. Il risultato netto è la
conversione degli ioni +H della fase mobile in H2O e dei soluti LiCl, NaCl e
KCl nei corrispondenti idrossidi LiOH, NaOH e KOH.
Il limite della fibra cava è la limitata superficie della fibra, dovuta al fatto che
per evitare l’allargamento dei picchi il diametro del canale interno dev’essere
Giorgio Bonaga
ridotto.
FIBRA CAVA
eluente
canale interno
della fibra
fibra permeabile
a cationi o anioni
scambio cationico
o
scambio anionico
soluzione di soppressione
scambio cationico
o
scambio anionico
soluzione di soppressione
Giorgio Bonaga
SOPPRESSORE A FIBRA - ANIONI
NaBr
NaCl
NaOH
NaF
Na+
Cl Cl –
Na+
NaOH NaOH
NaOH
NaOH
Na+
Na+
Na+
+
-OH
H+
Cl -
Na+
H+ H H+
H+
-OH -OH OH
H+
Cl -
Na+
Cl -
H2O
F
Na+
H+
H2O
H2O
H+
Cl –
HBr
HCl
- HCl
2O
HF
H2O Cl
H+
Br -
H+
Cl -
Giorgio Bonaga
SOPPRESSORE A FIBRA - CATIONI
KCl
NaCl
HCl
LiCl
Na+
Cl Na+
Cl -
HCl
HCl
Cl -
H+
H+
Na+
-OH
Cl Cl -
Cl -
-OH OH-OH
-OH
-OH
-OH
Na+
HCl
HCl
H2O
Na+
Cl Na+
Cl -OH
H+ H+
H2O
H2O
KOH
NaOH
+
Li+ HNa
2O
LiOH
H2O
K+
-OH
Na+
Na+
-OH
Giorgio Bonaga
c) SOPPRESSIONE A MEMBRANA
È una soppressione che opera secondo gli stessi principi del soppressore a
fibra cava, ma la permeabilità ai cationi o agli anioni è dovuta ad una
membrana semipermeabile.
Il soppressore a membrana è costituito da una camera laminare con tre
schermi metallici scambiatori alternati con due membrane di scambio
(struttura a “sandwich”).
schermo scambiatore
membrana di
scambio ionico
Il soppressore a membrana non soltanto consente di operare in continuo, ma
la maggiore superficie di contatto tra la soluzione di soppressione e la
soluzione eluente, consente una soppressione più completa.
Giorgio Bonaga
SOPPRESSORE A MEMBRANA
soppressore
HCl
DETECTOR
Na+Cl flusso
NaBr
eluente NaCl
HBr
HCl
H2O
HF
NaOH
NaF
COLONNA
Na+
H+
H+
Na+
ELETTRODO
Giorgio Bonaga
maleico
malonico
lattico
formico
acetico
propionico
SO4- -
0
79
8
16
min
SIC di acidi organici liberi
Giorgio Bonaga
Leu
Val
Ala
30 9
Arg
Lys
His
Met
Ile
Cys
Gly
7
Tyr
Phe
Ser
Glu
Thr
Asp
0
60
min
SIC di amminoacidi liberi di un mangime
Giorgio Bonaga
3) CROMATOGRAFIA DI COPPIA IONICA
(Ion Pair Chromatography = IPC)
Giorgio Bonaga
È una tecnica cromatografica nella quale viene soppressa la ionizzazione di
soluti ionizzabili e le specie che si ottengono, dotate di carattere lipofilo,
vengono separate su fase inversa.
1. PREMESSA
Se un soluto con proprietà ioniche (elettrolita debole) viene eluito con una
opportuna fase mobile, produce un picco cromatografico caratteristico, in
funzione del pH della fase mobile, come risultato del suo equilibrio di
protonazione. La prima frazione del soluto che eluisce è quella ionizzata,
dunque poco trattenuta dalla fase inversa (non polare), mentre la seconda
frazione è quella indissociata, affine alla fase inversa.
Nel caso di un acido carbossilico:
R-COOH
a pH basico:
a pH acido (< pka):
pH
pH basico
acido
R-COO- + H+
prevale R-COO - il picco ha un tR molto basso
prevale R-COOH il picco ha un tR più alto
Il risultato netto è un picco molto allargato e non risolto. Per evitare la
formazione di specie indesiderate nella separazione di elettroliti deboli si può
utilizzare un tampone che stabilizza il pH di esercizio. Naturalmente nel caso
di elettroliti forti non soltanto il tampone non funziona, ma non si può
neppure abbassare o alzare il pH della fase mobile fuori dall’intervallo di pH
(2-8) entro il quale la silice funzionalizzata è stabile.
R-COO- R-COOH
tR
2. TECNICA IPC
Il problema si può risolvere aggiungendo alla fase mobile un elettrolita
costituito da uno ione (accoppiatore ionico) di dimensioni sufficientemente
grandi e con carica opposta allo ione che si vuole “sopprimere”. Dal momento
che il solvente organico della fase mobile produce un abbassamento della
costante dielettrica, ci sono le condizioni affinché si formi una coppia ionica
che, in un certo senso, si comporta come un soluto indissociato.
Giorgio Bonaga
ACCOPPIATORI PER
CATIONI
ione perclorato
dodecilsolfato di sodio (SDS)
tetrafenilborato di sodio (STPB)
-O
CATIONI
ACCOPPIATORI
PER ANIONI
ANIONI
tutti
ione tetrabutilammonio (TBA)
tutti
ammine
protonate
tutti
O
Cl
O
O
CH3
O
H3C
O
S
O
-
+
Na
O
+
H 3C
B
N
CH3
+
Na
+
CH3
Giorgio Bonaga
R
O
C O
N+
R
C
O
O H
Gli accoppiatori ionici del tipo SDS, che sono costituiti da una catena alchilica
media, interagiscono con le catene alchiliche della silice funzionalizzata con
C18 e la fase inversa diviene così uno scambiatore ionico per la presenza del
gruppo –O-SO3-.
Si
-
Si
Giorgio Bonaga
D) CROMATOGRAFIA DI ESCLUSIONE DIMENSIONALE
(Size Exclusion Chromatography)
Utilizzando colonne impaccate con fase stazionaria costituita da materiale
poroso a dimensione controllata dei pori, i soluti si possono separare in
base alla loro dimensioni molecolari.
fase mobile
fase stazionaria porosa
Giorgio Bonaga
1. TEORIA GENERALE DELLA ESCLUSIONE DIMENSIONALE
Il volume interno di una colonna di esclusione si può così suddividere:
mg
mm
mp
Vp
Vst
1. volume della fase mobile
che non occupa i pori
(V0)
2. volume della fase stazionaria
a) volume strutturale non disponibile per i soluti (Vst)
b) volume totale dei pori occupati dalla fase mobile (Vp)
Giorgio Bonaga
Le 3 molecole: piccola dimensione (mp), media dimensione (mm) e grande
dimensione (mg) hanno destini diversi. La mp penetra completamente i pori,
la mm li penetra parzialmente e la mg ne viene esclusa.
La domanda è: qual è il volume a disposizione dei soluti che attraversano la
colonna ?
È intuitivo che il volume è diverso in funzione della dimensione della
molecola:
mp = V0 + Vp
mm = V0 + Vp/x
mg = V0
(Vp/x = parte di Vp)
È possibile definire un coefficiente di distribuzione K che rappresenta la
frazione di volume dei pori disponibile per le molecole di un determinato
soluto A:
VA
K=
(da cui VA = K . Vp)
Vp
dove VA = volume dei pori accessibile alle molecole del soluto A
Possiamo stabilire il valore di K in funzione della dimensione molecolare dei
soluti:
Giorgio Bonaga
mp
mg
mm
K=1
K=0
0<K<1
Il volume totale a disposizione delle molecole dei soluti, corrispondente al
volume di ritenzione VR, sarà:
VR = V0 + VA
VR = V0 + K . Vp
ovvero :
per:
K=0
K=1
0>K>1
VR = V0
VR = V0 + Vp
V0 < VR < V0 + Vp
esclusione totale
permeazione totale
permeazione parziale
Si può anche affermare che l’intervallo di volume necessario per eluire tutti i
soluti è compreso tra V0 e V0 + Vp (corrispondente all’intervallo del
coefficiente di distribuzione K compreso tra 0 e 1) ed è pertanto necessario
che la colonna sia molto efficiente.
In conclusione, maggiore è il valore di K maggiore è la penetrazione e la
permanenza delle molecole di soluto nei pori e, dunque, più elevato è il suo
tR.
Giorgio Bonaga
Possiamo diagrammare i pesi molecolari dei soluti in funzione del volume di
ritenzione VR, ovvero tracciare una curva di taratura (o di calibrazione):
mol wt
107
esclusione
totale: K=0
106
105
104
103
102
permeazione
selettiva: 0<K<1
intervallo
operativo
di mol wt
V0
Vp
V0 + Vp
permeazione
totale: K=1
101
Riportando su un cromatogramma teorico una miscela di soluti con valori
differenti di K si può concludere che il soluto con K = 1 è escluso, il soluto
con K = 1 è permeato totalmente e il soluto con K = 0,5 è permeato al 50%.
Giorgio Bonaga
mol wt
107
esclusione
totale: K=0
106
105
104
103
102
permeazione
selettiva: 0<K<1
intervallo
operativo
di mol wt
V0
Vp
permeazione
totale: K=1
101
QUAL’E’ IL
VALORE DI K ?
K=0
K=0,5
K=1
V0
V0+1/2Vp
V0+Vp
Giorgio Bonaga
I due asintoti della curva di taratura corrispondono a due limiti: quello della
permeazione nulla (o esclusione totale) corrispondente a K = 0 e quello della
permeazione totale (o esclusione nulla) corrispondente a K = 1.
È ovvio che il tratto analiticamente utile della curva di taratura (intervallo
operativo dei pesi molecolari dei soluti) è quello lineare, cioè quello compreso tra
K = 0 e K = 1.
I solventi utilizzati come fase mobile nella cromatografia di esclusione sono
costituiti da molecole a basso peso molecolare, con K = 1, cioè con il più
elevato tR. Essi, pertanto, eluiscono quando sono già eluiti tutti i soluti.
Questa è la principale differenza tra la SEC e le altre tecniche di separazione
cromatografica. Il compito del solvente è esclusivamente quello di essere un
buon solvente dei soluti che devono essere separati, oltre ad essere inerte
verso la fase stazionaria.
L’efficienza di una colonna per cromatografia di esclusione dimensionale
dipende da:
a) Lunghezza della colonna
È evidente che l’allungamento della colonna produce un aumento della sua efficienza,
ma nel caso della SEC è più efficace connettere 2 colonne differenti (cromatografia
bimodale) piuttosto che 1 colonna più lunga.
Giorgio Bonaga
b) Struttura della fase stazionaria
• Se la fase stazionaria è costituita da materiale con diametro piccolo dei pori il
tratto lineare della curva di taratura si sposta verso il basso e interesserà soluti
di piccole dimensioni. Se la fase stazionaria è costituita da materiale con
diametro grande dei pori il tratto lineare si sposta verso l’alto e interesserà i
soluti di grandi dimensioni.
mol wt
107
106
105
104
103
A
B
102
101
VR (ml)
Giorgio Bonaga
A: pori più grandi (intervallo operativo per mol wt elevati)
B: pori più piccoli (intervallo operativo per mol wt meno elevati)
• Alla maggiore o minore omogeneità della dimensione dei pori, invece, è
correlata la pendenza della curva di taratura: l’angolo del tratto lineare è
proporzionale alla disomogeneità dei pori. È ovvio che minore è la pendenza
del tratto lineare e maggiore è l’efficienza e la selettività della colonna,
naturalmente se i soluti hanno dimensioni comprese nel tratto lineare.
mol wt
107
106
105
104
A
B
103
102
101
VR (ml)
A: pori omogenei (alta selettività)
B: pori disomogenei (bassa selettività)
Giorgio Bonaga
Se prendiamo in considerazione le curve di taratura di fasi stazionarie diverse si può
notare che, seppure con andamenti diversi, l’incremento della dimensione dei pori
sposta il tratto lineare delle curve di taratura verso l’alto (cioè verso pesi molecolari
maggiori), sia con materiale polimerico sia con gel si silice.
500 Å
107
106
600 Å
700 Å
400 Å
300 Å
105
200 Å
104
100 Å
103
102
101
VR (ml)
6
7
8 9
10 11
12 13
14
CURVE DI TARATURA DI POLIMERI
Giorgio Bonaga
300 Å
107
106
125 Å
1000 Å
500 Å
105
104
103
102
101
VR (ml)
1,6
2,0
2,4
2,8
3,2
CURVE DI TARATURA DI GEL DI SILICE
Un problema concreto è quello della scelta della porosità più idonea alla
separazione di due soluti di peso molecolare diverso.
Tracciamo le curve di taratura di tre impaccamenti A, B e C di porosità
diversa e individuiamo qual è quello più idoneo a separare il soluto 1 (~ 104)
e il soluto 2 (~ 103).
Giorgio Bonaga
mol wt
107
C
106
B
105
A
soluto 1
104
103
DVA
102
DVB
DVC
soluto 2
101
V0
Vp
VR
Mentre con gli impaccamenti A e C i pesi molecolari sono fuori dal tatto
lineare della curva, con l’impaccamento B sono compresi. Inoltre, la
differenza dei volumi di ritenzione dell’impaccamento B (DVB) è maggiore di
quella A (DVA) e di quella C (DVC) e pertanto la separazione sarà migliore.
Giorgio Bonaga
Dal punto di vista pratico conviene fare una cromatografia di “screening” con
una colonna che ha una curva di taratura a pendenza elevata, cioè una curva
il cui tratto lineare comprende un intervallo ampio di pesi molecolari.
Individuato l’intervallo reale in cui rientrano i pesi molecolari dei soluti da
nalizzare si potrà procedere utilizzando una colonna più selettiva, cioè con
una curva di taratura a bassa pendenza del tratto lineare.
Giorgio Bonaga
2. CROMATOGRAFIA DI ESCLUSIONE BIMODALE
Collegando due colonne impaccate con materiale a differente dimensione dei
pori si amplia l’intervallo di pesi molecolari che rientrano nel tratto lineare
della curva di taratura.
colonna 2
pori piccoli
colonna 1
pori grandi
Ognuna delle due colonne esercita la sua funzione in un proprio intervallo di
pesi molecolari e l’attraversamento dei soluti in una colonna non ha alcuna
influenza sull’altra, perché i diversi soluti subiranno esclusione totale o
permeazione totale. Normalmente la prima colonna è quella meno selettiva,
cioè impaccata con materiale a dimensione dei pori maggiore.
È evidente che se ogni singola colonna consente la separazione di 2 ordini di
grandezza di pesi molecolari, l’accoppiamento di due colonne consentirà la
separazione di 4 ordini di grandezza di pesi molecolari.
mol wt
107
106
105
A
104
103
102
B
A
101
B
VR (ml)
Giorgio Bonaga
1
1
7
3 5
7
3 5
4
4 6
2
2
0
10 min
CROMATOGRAFIA CON 1 COLONNA
CON DIAMETRO DEI PORI = 60 Å
6
0
10
20 min
CROMATOGRAFIA CON 2 COLONNE
CON DIAMETRO DEI PORI = 60 Å
1 = polistirene
2 = polistirene
3 = diottilftalato
4 = dibutilftalato
5 = dietilftalato
6 = dimetilftalato
7 = benzene (solvente)
20.000
2.100
390
278
222
194
78
Giorgio Bonaga
3. FASE STAZIONARIA
Le fasi stazionarie nella cromatografia di esclusione dimensionale possono
essere costituite da: Materiali rigidi, materiali semirigidi, materiali “soft”.
3.1. MATERIALI RIGIDI
Viene utilizzata gel di silice o silice vetrosa in granuli, con diametro compreso tra 510 mm e diametro dei pori compreso tra 60-10000 Å.
La silice ha le seguenti proprietà:
• sopporta alte pressioni senza variare di volume;
• è compatibile con fasi mobili acquose e organiche;
• è compatibile con una temperatura di esercizio di 60-80°C;
• è idonea alla separazione di soluti polari;
• è instabile a pH > 8 perché si scioglie nella fase mobile;
• può dare interazioni (adsorbimento e scambio ionico) con i soluti.
Per eliminare i fenomeni di adsorbimento si può funzionalizzare la silice con TMCS
(trimeticlorosilano), ovvero si convertono i gruppi silanolici nei loro
trimetilsiliderivati.
Per eliminare lo scambio ionico dovuto all’acidità dei gruppi silanolici (pH ≈ 9) si
può aggiungere alla fase mobile una sale donatore di anioni e cationi ai siti attivi
della silice (ad es. una soluzione 0,1-0,01 M di tetrabutilammoniodiidrogenofosfato).
HO
O
P
OH
O
-
CH3CH2CH2CH2
CH3CH2CH2CH2
+
N
CH2CH2CH2CH3
CH2CH2CH2CH3
3.2. MATERIALI SEMIRIGIDI
Vengono utilizzati copolimeri stirene/divinilbenzene (PS-DVB), ma questi materiali
variano il loro volume in funzione della pressione a cui sono sottoposti. La loro
porosità può essere modulata variando l’entità della reticolazione, che è direttamente
proporzionale alla percentuale di divinilbenzene (dal 2 al 12%, comunemente 8%).
Non essendo bagnabile il copolimero non può consentire la Gel Permeation
Chromatography, la tecnica che utilizza una fase mobile acquosa. I solventi più
utilizzati in associazione con questi materiali sono: THF, toluene, cloroformio e
decaidronaftalene.
3.3. MATERIALI “SOFT”
Vengono utilizzati polisaccaridi (amido, poliagarosio, ecc.) che però hanno
l’inconveniente di subire una notevole riduzione di volume a pressioni elevate. Il loro
utilizzo comporta una pressione di esercizio non superiore a 10 atmosfere, ottenuta
con pompe peristaltiche.
4. FASE MOBILE
La fase mobile deve possedere alcuni requisiti:
• buon solvente dei soluti da nalizzare;
• compatibilità con la fase stazionaria (bagnabilità)
• inerzia verso la fase stazionaria
I “buoni” solventi di una fase mobile impiegata nella SEC devono solvatare
fortemente i soluti, in modo da ridurre al massimo il VR.
d+
dd+
dd+
In base al tipo di fase stazionaria e di fase mobile la SEC può essere così
classificata:
TIPO DI SEC
FASE STAZIONARIA
FASE MOBILE
Gel Permeation Chromatography (GPC)
• silice
• copolimeri
• organica
Gel Filtration Chromatography
• silice
• acquosa
(GFC)
5. TEMPERATURA
La separazione dei soluti ad alto peso molecolare, cioè ad elevata viscosità,
richiede un incremento di temperatura proprio per ridurre l’eccessiva
viscosità della miscela da analizzare.
Nella SEC si opera alla temperatura di 60-80°C, compatibilmente con il
solvente utilizzato come fase mobile, perché comunque bisogna operare ad
una temperatura inferiore di 30-40°C a quella di ebollizione del solvente.
Il materiale di riempimento più idoneo è la silice, anche perché l’aumento
della sua solubilità nella fase mobile all’aumentare della temperatura può
essere ovviato predisponendo una precolonna di silice mantenuta alla stessa
temperatura d’esercizio. In questo modo la fase mobile si satura di silice
nella precolonna, garantendo l’inalterabilità della silice della colonna
analitica.
precolonna
silice, 60-80°C
colonna
silice, 60-80°C
6. IMPIEGHI DELLA SEC
Le sostanze che possono essere separate con la SEC e i relativi intervalli di
peso molecolare sono indicati nello schema.
• composti organici
•
•
•
additivi per polimeri
plasticizzanti
resine epossidiche
• resine epossidiche
• resine fenoliche
• peptidi
• proteine globulari
• enzimi
101
102
103
104
105
106
107
mol wt
Giorgio Bonaga
ESEMPIO
Separazione di proteine del plasma umano.
3
2
1. fibrinogeno
2. immunoglobulina
3. albunina
341.000
156.000
69.000
1
Giorgio Bonaga
ESEMPIO
Separazione di alchilbenzeni.
5
1
3
2
15
25
7
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
4 6
8
35
n-dodecilbenzene
n-ottilbenzene
n-esilbenzene
n-butilbenzene
n-propilbenezene
etilbenzene
toluene
benzene (solvente)
218
190
162
134
120
106
92
78
min
• Colonna: copolimero S/DVB, pori 60 Å
• Fase mobile: THF
• Flusso: 1 ml/min
Giorgio Bonaga
ALTRE COMATOGRAFIE
E) CROMATOGRAFIA DI AFFINITA’
(Affinity Chromatography = AC)
È utilizzata per isolare composti biologicamente e/o chimicamente nobili, di costo
elevato, il cui recupero è economicamente vantaggioso. È una tecnica cromatografica
molto utilizzata nella separazione degli enzimi, perché sfrutta la specificità delle
interazioni enzima/substrato.
La colonna viene preparata con materiale fisicamente e chimicamente inerte (matrix),
attivato con degli spaziatori flessibili (spacer arm), sui quali vengono immobilizzati dei
ligandi (ligand), cioè dei siti attivi verso un enzima. Gli spaziatori hanno la funzione
di evitare l’impedimento sterico tra i siti attivi e le molecole di enzima.
ligand
spacer arm
(Br-CN)
matrix
(agarosio)
Giorgio Bonaga
Facendo eluire una miscela di enzimi, soltanto quello in grado di interagire
(affinità) con i ligandi viene trattenuto, mentre gli altri eluiscono molto
rapidamente. In un secondo tempo si fa fluire una fase mobile in grado di
dissociare il complesso enzima/substrato, in genere variando il pH o la forza
ionica della fase mobile.
A+B
C
C
AFFINITA’
Giorgio Bonaga
A
B
F) CROMATOGRAFIA LIQUIDA CHIRALE
(Chiral Liquid Chromatography = CLC)
Ha lo scopo di separare le miscele di enantiomeri (R e S), cioè isomeri che
hanno le stesse proprietà chimiche e fisiche, ma diversa attività ottica
(antipodi ottici). La cromatografia liquida chirale si può realizzare in due
modi:
1. FASE STAZIONARIA CHIRALE
La fase stazionaria di silice viene funzionalizzata con gruppi contenenti
centri chirali che determinano una enantioselettività dovuta alla formazione
di addotti diasteroisomerici non permanenti. L’enantoseparazione avviene se
i due enantiomeri differiscono nel numero di punti di attacco al centro
chirale.
Le interazioni temporanee sono:
1. legami a idrogeno;
2. interazioni dipolo-dipolo;
3. interazioni di orbitali (p-p o d-metalli).
Giorgio Bonaga
Le tre interazioni che governano la stereoselettività sono note come “regola
dei tre punti di Dalgliesh”.
Si ottiene la separazione se uno dei due enantiomeri è ritenuto dalle tre
interazioni e l’altro soltanto da due.
ESEMPIO
Per ottenere la separazione di una miscela di enantiomeri R e S di alcuni
amminoacidi (valina, alanina, treonina) si funzionalizza una fase stazionaria
di silice con:
NH
O
C
NH2
*C
CH3
H
(S)-N-(1-feniletil)-urea
Giorgio Bonaga
Gli enantiomeri R eluiscono prima perché formano soltanto 2 interazioni
temporanee con i centri chirali S, mentre gli enantiomeri S ne realizzano 3.
H
O
H3C C C
OH
NH2
alanina
H
O
CH C C
OH
H3C
NH2
H3C
R
S
valina
R
H
O
CH C C
OH
HO
NH2
H3C
S
treonina
R
0
4
8
12
S
16
min
Giorgio Bonaga
2. FASE MOBILE CHIRALE
Alla fase mobile viene aggiunto un componente chirale, in grado di
interagire (per complessazione, addizione, condensazione) in modo diverso con i
due enantiomeri. In questo caso l’enantiomero affine al componente chirale
della fase mobile eluisce per primo. Questo secondo tipo di cromatografia
liquida chirale è poco diffuso.
Giorgio Bonaga
G) CROMATOGRAFIA CON SCAMBIO DI LEGANTE
(Ligand Exchange Chromatography = LEC)
È una cromatografia di scambio cationico che utilizza un copolimero
(comunemente stirene/divinilbenzene) funzionalizzato con gruppi –SO3-, ma
in più la fase stazionaria viene caricata con un controione metallico (ad es.
Fe+++) capace di formare complessi con le sostanze da separare. Lo ione
metallico non deve saturare tutti i siti attivi del copolimero, ma maggiore è il
numero dei siti caricati con il controione maggiore è la capacità della
colonna. È anche opportuno che la concentrazione dei soluti da separare non
sia tanto elevata da determinare la rimozione del controione dal silicone. Il
soluto è trattenuto tanto più a lungo dalla fase stazionaria quanto maggiore è
la stabilità del complesso ione/soluto (con un conseguente aumento del suo
tR), secondo l’equilibrio:
Copolimero-SO3- Fe+++ + HO-R
Copolimero-SO3- Fe+++ -O-R + H+
Dopo la formazione dei complessi Fe+++/soluti, si impiega con una soluzione
tampone a pH decrescente per avere l’eluizione selettiva dei soluti, secondo
un ordine che dipende dalla stabilità del complesso ione /soluto e dalla
basicità del soluto.
Giorgio Bonaga
a) A PARITA’ DI STABILITA’ DEI COMPLESSI IONE/SOLUTO: viene eluito prima
il soluto più basico;
b) A PARITA’ DI BASICITA’ DEI SOLUTI: viene eluito prima il soluto che forma il
complesso ione/soluto meno stabile.
ESEMPIO
Separazione di fenoli monosostituiti.
OH
OH
OH
Br
NO2
OH
Cl
CH3
0
6
100
5
200
4
volume fase mobile
pH fase mobile
Giorgio Bonaga
H) CROMATOGRAFIA A FLUIDO SUPERCRITICO
(Supercritical Fluid Chromatography = SFC)
Rispetto le altre LC, la cromatografia a fluido supercritico è più versatile,
economicamente più vantaggiosa, di facile esecuzione, con una risoluzione
migliore, non impiega solventi organici, comporta tempi di analisi più rapidi.
1. TEORIA GENERALE DELLA SFC
Un fluido supercritico può essere definito dal diagramma di fase di una
sostanza pura, in cui sono indicate le regioni corrispondenti allo stato solido,
liquido e gassoso.
SOLIDO
pressione
critica
punto
triplo
LIQUIDO
.
regione
del fluido
supercritico
VAPORE
temperatura critica
Giorgio Bonaga
Una sostanza può esistere in fase solida, liquida e gassosa in diverse
combinazioni di temperatura e pressione. Per ogni sostanza, però, c’è una
temperatura (temperatura critica) al di sopra della quale essa non può esistere
allo stato liquido, indipendentemente dalla pressione a cui è sottoposta e c’è
una pressione (pressione critica) al di sopra della quale essa non può esistere
allo stato gassoso, indipendentemente dalla temperatura a cui è sottoposta.
A questo punto il liquido e il vapore hanno la stessa densità e il fluido non
può essere liquefatto per incremento della pressione. Sopra questo punto non
avviene più nessun cambiamento di fase e la sostanza è un fluido
supercritico.
temperatura
critica (°C)
pressione
critica (bar)
31.0
73,8
9,2
50,4
propilene
91,8
46,0
triclorometano
198,0
44,1
ammoniaca
132,3
113,5
acqua
374,1
221,2
cicloesano
280,3
40,7
toluene
318,6
41,0
FLUIDO
anidride carbonica
etilene
Giorgio Bonaga
La SFC è una tecnica cromatografica intermedia tra la GC e la LC nella quale
la fase mobile è un fluido ottenuto per riscaldamento al di sopra della sua
temperatura critica e compresso al di sopra della sua pressione critica. C’è
una transizione continua da liquido a fluido supercritico per incremento
della temperatura a pressione costante o da gas a fluido supercritico per
incremento della pressione a temperatura costante.
I fluidi supercritici hanno proprietà, intermedie tra quelle dello stato gassoso
e dello stato liquido, proprietà che sono particolarmente utili nella
cromatografica. Per la loro densità elevata sono in grado di dissolvere
molecole ad alto peso molecolare, non volatili, termolabili, ma hanno anche
un grande potere solvatante. Per il loro coefficiente di diffusione elevato
consentono di usare colonne lunghe e di ridurre i tempi di analisi. Per la loro
viscosità bassa riducono i fenomeni di caduta di pressione in colonna.
gas
fluido
supercritico
liquido
densità (g/cm)
0,6-2,0 x 10-3
0,2-0,5
0,6-2,0
coefficiente di diffusione (cm/s)
1,0-4,0 x 10-1
10-3- 10-4
0,2-2,0 x 10-5
viscosità (g/cm . s)
1,0-4,0 x 10-4
0,6-2,0 x 10-3
0,2-3,0 x 10-2
PROPRIETA’
Giorgio Bonaga
2. FASE MOBILE
Nonostante siano disponibili numerosi fluidi, la SFC utilizza comunemente
l’anidride carbonica e, a volte, l’acqua.
a) CO2
Non è infiammabile, non è tossica, è ecocompatibile, ha una temperatura
critica bassa e una pressione critica modesta, è miscibile con molti solventi
organici e facilmente recuperabile alla fine del processo. Le molecole di CO2,
piccole e lineari, diffondono velocemente.
b) H2O
Ha temperatura critica e pressione critica elevate a causa della sua notevole
polarità. In condizioni supercritiche l’acqua cambia, da solvente di sole
specie ioniche a solvente di paraffine, sostanze aromatiche, sali.
3. PRESSIONE
Il potere solvatante di un fluido supercritico è proporzionale alla sua densità
e la densità aumenta all’aumentare della pressione. La programmazione
della pressione nella SFC corrisponde alla programmazione della
temperatura nella GC e alla eluizione a gradiente nella HPLC.
Giorgio Bonaga
4. STRUMENTAZIONE SFC
È molto simile a quella HPLC, perché le temperature e le pressioni richieste
per produrre il fluido supercritico si ottengono anche con uno strumento
HPLC. Ci sono due differenze sostanziali:
1) forno termostatato
2) restrittore
a) POMPE
• colonne impaccate: pompe reciprocanti
• colonne capillari: pompe a siringa
b) INIETTORI
• colonne impaccate: tradizionali valvole di iniezione HPLC per grandi volumi
• colonne capillari: valvole pneumatiche per piccoli volumi
c) FORNO
È necessario un forno termostatato con controllo accurato delle temperature, molto
simile a quello della GC.
d) COLONNE
Nella SFC il notevole potere solvatante della fase mobile rende importante e delicata
la scelta della fase stazionaria.
• colonne impaccate: acciaio inox (3-25 cm) di allumina, silice, polistirene e altre fasi
insolubili nel fluido supercritico (diametro: 3-10 mm), anche legate (silice-C18, ecc.)
• colonne capillari: silice fusa (1-35 m), tipo WCOT (f.t.: 0,1-3,0 mm)
Giorgio Bonaga
e) RESTRITTORE (back-pressure device)
È un dispositivo, collocato tra l’estremità finale della colonna e il detector, che serve a
mantenere la pressione desiderata nella colonna, mediante un diagramma di
pressione variabile.
f) DETECTOR
La SFC è compatibile sia con i detector della HPLC e della GC (RI, PD, UV-VIS, LSD,
FID, MS).
La scelta del detector dipende da: composizione della fase mobile, velocità di flusso
della fase mobile, tipo di colonna, abilità del detector di garantire le alte pressioni
necessarie nella SFC.
g) FLUIDI MODIFICATORI
La CO2 non è un ottimo solvente per soluti ad alto peso molecolare, polari o ionici.
Questo limite può essere superato per aggiunta di piccole quantità di un secondo
fluido, completamente miscibile con la CO2 (alcol, eteri ciclici, acetonitrile, acqua, ecc),
detto fluido modificatore. La sua funzione è di innalzare il potere solvatante della CO2,
ma anche di incrementare la selettività (a) e la efficienza (HETP) della separazione
attraverso la neutralizzazione di parte dei siti attivi della fase stazionaria.
Giorgio Bonaga
Giorgio Bonaga
GC
0
80
10
20
30
temperatura (°C)
40
50 min
250
0
0,225
24
48
72
densità (g/ml)
96
120 min
0,70
SFC
ULTRA PERFORMANCE
LIQUID CHROMATOGRAPHY (UPLC)
È basata su una nuova fase stazionaria, con particelle di diametro inferiore a
2 mm, che garantisce efficienza, risoluzione e sensibilità analitica oltre ad una
riduzione dei tempi di analisi di quasi un fattore 10. La fase stazionaria è
costituita da particelle, a fase inversa da 1,7 mm di tetraetossisilossano (TEOS)
successivamente polimerizzato e derivatizzato con C18 (ottadecilsilil-),
resistenti alle elevate pressioni di esercizio (15000 psi, pari a oltre 1000 atm).
Le caratteristiche di questa fase consentono un ottimale interfacciamento
della UPLC con la MS.
Giorgio Bonaga
HPLC TRADIZIONALE, FAST HPLC, UPLC
10 mm (1970)
30
5 mm (1980)
HETP (mm)
25
HPLC
20
3 mm (2000)
15
FAST HPLC
10
1,7 mm (2004)
5
UPLC
0
0
1
2
3
4
v (mm/sec)
5
6
Giorgio Bonaga
EFFETTI DELL’HETP SULL’EFFICIENZA E SUL TEMPO
•
•
•
•
•
•
flusso: 1,0 ml/min
colonna: 4,6 mm I.D. x 150 mm
fase stazionaria: C18 (5,0 mm)
fase mobile: H2O/CH3CN (50/50)
lunghezza d’onda: 254 nm
campione (20 ml):
1. uracile
2. alcol benzilico
3. benzene
4. toluene
5. alcol etilico
HPLC
mV
1
300
2
200
3
100
4
5
rrr0
- 25
0
2
4
6
8
10
18
t (min)
•
•
•
•
•
•
flusso: 0,6 ml/min
colonna: 2,1 mm I.D. x 50 mm
fase stazionaria: C18 (1,8 mm)
fase mobile: H2O/CH3CN (50/50)
lunghezza d’onda: 254 nm
campione (1 ml):
1. uracile
2. alcol benzilico
3. benzene
4. toluene
5. alcol etilico
mV
2
300
3
4
200
5
100
rrr0
- 25
0
Giorgio Bonaga
UPLC
1
2
4
6
8
10
12
t (min)
Si
C
O
H
.. . ....
. ...
... . .
.
OEt
EtO CH2 CH2
O
Si
Si
Si OEt
O
O
O
Si O Si
Si OEt
O
EtO
EtO
OEt
polietossisilano
(BPEOS)
EtO
EtO
4
EtO Si OEt
EtO
+
tetraetossisilano
(TEOS)
CH2
EtO Si CH2
EtO
OEt
Si OEt
OEt
bis (trietossisililetano)
(BTEE)
Giorgio Bonaga
particelle
da 5 mm
capello umano
60 mm
particelle
da 1,7 mm
Giorgio Bonaga
STRATEGIA HPLC
CAMPIONAMENTO
1. LSC
SCELTA DEL METODO
CROMATOGRAFICO
2. LLC
3. IEC
4. SEC
N
1.
2.
3.
4.
lunghezza colonna
tipo di fase stazionaria
dimensione delle particelle
diametro dei pori
SCELTA DELLA
FASE MOBILE
1.
2.
3.
4.
composizione fase mobile
forza dell’eluente
indice di polarità eluente
viscosità fase mobile
SCELTA DELLE
CONDIZIONI
1.
2.
3.
4.
pressione
temperatura
eluizione isocratica o a gradiente
column switching
SCELTA DELLA
COLONNA
a
k’
Giorgio Bonaga
RFC
NPC
IEC
SIC
GFC
GPC
COLUMN SWITCHING
È un sistema costituito da due colonne di lunghezza diversa, ma riempite con
lo stesso materiale d’impaccamento, collegate tra loro con una valvola a 3 vie.
Agendo sulla valvola si può fare in modo che una parte della miscela eluisca
in entrambe le colonne (la parte i cui soluti hanno tR non elevati) e una parte
eluisca soltanto nella prima colonna (quella i cui soluti hanno tR molto elevati)
perché “deviata” dalla valvola direttamente sul detector.
valvola
a 3 vie
colonna corta
Giorgio Bonaga
colonna lunga
detector
Un’alternativa è l’impiego di due colonne di lunghezza uguale, ma a diverso
grado di funzionalizzazione della silice con catene C18 (RPC). La colonna
meno funzionalizzata trattiene meno i soluti a tR elevati, che verranno deviati
dalla valvola prima di entrare nella seconda colonna direttamente sul
detector.
valvola
a 3 vie
colonna a bassa
capacità
colonna ad elevata
capacità
detector
Giorgio Bonaga
1+2+3+4
5
8
6
colonna 1: 5,0 cm
7
0
1
2
15
30 min
3
45
colonna 2: 15,0 cm
8
6
7
1
8
6
colonna 1 + colonna 2
column switching
3
2
4
5
7
Giorgio Bonaga
DERIVATIZZAZIONI IN LC
Il limite di rilevabilità di alcuni soluti può essere abbassato con reazioni di
derivatizzazione che vanno scelte in relazione alla natura dei soluti e al tipo
di rivelatore che è più opportuno utilizzare.
Le reazioni possono essere fatte in due momenti diversi del processo
cromatografico:
a) POST-COLUMN
Tra la colonna e il detector si inserisce un tubo immerso in un bagno
termostatico ed una pompa peristaltica che miscela i soluti già separati dalla
colonna analitica con i reagenti necessari alla derivatizzazione.
VANTAGGI
• il campione non richiede preparazione e manipolazioni;
• la reazione può essere automatizzata a vantaggio della riproducibilità;
• non si formano artefatti perché i reagenti non attraversano la colonna analitica.
SVANTAGGI
• è richiesta una apparecchiatura supplementare (bagno termostatico, pompa, ecc.);
• è compatibile soltanto con reazioni molto veloci (circa 30-40”) perché tempi
maggiori produrrebbero un allargamento dei picchi;
• il solvente di reazione deve essere compatibile con la fase mobile;
• un eccesso di derivatizzazione produrre un background che disturba la misura dei
segnali dei soluti.
Giorgio Bonaga
b) PRE-COLUMN
Prima dell’iniezione nella colonna analitica la miscela da separare viene
sottoposta alla reazione di derivatizzazione.
VANTAGGI
• non ci sono incompatibilità tra solvente di reazione e fase mobile;
• la velocità di reazione non è un fattore limitante;
• è richiesto il “clean up” (filtrazione, estrazione, precipitazione) del campione per
evitare la formazione di artefatti, pertanto la separazione viene fatta su un campione
obbligatoriamente “pulito”;
• non è richiesta una apparecchiatura supplementare, dal momento che è sufficiente
una provetta con tappo a tenuta in un termostato;
SVANTAGGI
• il campione reale che viene iniettato nella colonna analitica può essere complesso
per la presenza di solventi di reazione (ad esempio l’acetone, che assorbe nell’UV),
catalizzatori, tamponi, ecc.;
• è necessario l’uso di uno standard interno quando la reazione di derivatizzazione
non è quantitativa;
• la resa della reazione di derivatizzazione è spesso variabile, a spese della
riproducibilità;
• molte volte i composti prodotti dalla derivatizzazione sono più difficili da
separare dei loro precursori, per effetto di una riduzione delle differenze dei valori
dei k’ di derivati che hanno nella molecola lo stesso gruppo funzionale introdotto.
Giorgio Bonaga
In generale nella LC si usa prevalentemente la derivatizzazione pre-column,
più raramente quella post-comumn (come nel caso dell’indicatore
metallocromico nella IEC), abitualmente per rendere i soluti da separare
capaci di assorbire nell’UV-VIS o di emettere radiazioni di fluorescenza.
Le principali reazioni di derivatizzazione riguardano:
1.
2.
3.
4.
ACIDI
AMMINE
COMPOSTI CARBONILICI
ZUCCHERI
Giorgio Bonaga
1. DERIVATIZZAZIONE DI ACIDI
DERIVATIZZANTE
SISTEMA DI REAZIONE
DETECTOR
1. bromuro di fenacile
acetone, KHCO3, 18-crown-6
UV (254 nm)
2. bromometil-metossicumarina
acetone bollente
FD (ecc.: 330 nm, emis.: 380 nm)
3. metil-metossicumarina
acetone bollente
FD (ecc.: 330 nm, emis.: 380 nm)
O
C
CH2Cl
F
F
F
F
CH3O
O
O
CH2Br
F
1.
2.
CH3O
O
O
CH3
3.
O
K+
O
O
O
O
O
18-crown-6
Giorgio Bonaga
0
5
10
15
min
Cromatogramma di acidi carbossilici di un vino “Dolcetto”
derivatizzati con bromuro di fenacile
Giorgio Bonaga
acido citrico
acido succinico
acido malico
acido tartarico
acido gliossilico
acido lattico
acido acetico
bromuro di fenacile
acetone
2. DERIVATIZZAZIONE DI AMMINE
DERIVATIZZANTE
AMMINE
DETECTOR
1. cloruro di 2,4-dinitrobenzoile
RNH2, R2NH
UV (254 nm)
2. cloruro di dansile
RNH2, R2NH
FD (ecc.: 330 nm, emis.: 540 nm)
3. o-ftalaldeide
RNH2
FD (ecc.: 390 nm, emis.: 450 nm)
4. fluram
RNH2
FD (ecc.: 390 nm, emis.: 450 nm)
RNH2, R2NH
FD (ecc.: 480 nm, emis.: 650 nm)
5. cloruro di nitrobenzoossadiazolo
O
C
Cl
H 3C
N
CH3
C
NO2
C
NO2
1.
O
2.
S
O
Cl
Cl
O
O
3.
H
H
N
O
O
O
N
O
NO2
O
4.
5.
Giorgio Bonaga
CH3CN (75%)
CH3CN (40%)
0
2 4 6 8 10
min
Cromatogramma di dansil-derivati di ammine alifatiche
• FASE STAZIONARIA: silice-C18 (porosa) 10 mm
• FASE MOBILE: H2O/CH3CN con eluizione a gradiente da 40% a 75%
Giorgio Bonaga
3. DERVATIZZAZIONE DI COMPOSTI CARBONILICI E ZUCCHERI
DERIVATIZZANTE
1. 2,4- dinitrofenilidrazina
2. dansil-idrazina
AMMINE
DETECTOR
aldeidi, chetoni
VISIBILE
aldeidi
zuccheri
FD (ecc.: 350 nm, emis.: 500 nm)
RID
H 3C
NH2
N
CH3
NH
NO2
O
NO2
1.
S
O
NH
2.NH2
Negli zuccheri la danisil-idrazina produce un aumento della sensibilità del
RID di un fattore 102, inoltre la minor polarità dei dansil-derivati consente la
cromatografia a fase inversa.
Giorgio Bonaga
80
eccitazione
emissione
60
40
20
0
8
16
24
min
Cromatogramma di dansil-idrazoni
di steroidi
300
400
500
600
Spettri di eccitazione e di emissione
di fluorescenza dei dansil-derivati
Giorgio Bonaga