L.S. in Scienze e tecnologie alimentari
Anno Accademico 2008/2009
Corso integrato:
Controllo delle modificazioni chimiche negli alimenti (7 CFU)
Modulo di:
Chimica analitica strumentale (4 CFU)
Giorgio Bonaga
CROMAROGRAFIA SU
STRATO SOTTILE (TLC)
(CAS-5)
Giorgio Bonaga
COMATOGRAFIA LIQUIDA PLANARE
La fase stazionaria non è contenuta in una colonna, ma è distesa su una
superficie piana. Le tecniche cromatografiche planari sono fondamentalmente
due:
 cromatografia su strato sottile (TLC = Thin Layer Chromatography)
 cromatografia su carta
(PC = Paper Chromatography)
Sono tecniche rapide, semplici ed economiche. Specialmente la TLC è di
grande aiuto nella fase di screening, cioè nella fase che precede l’analisi qualiquantitativa più rigorosa di una miscela di sostanze. Nel settore della chimica
delle sostanze naturali, ed in particolare in quello dell’analisi degli alimenti,
la TLC è ancora oggi uno strumento prezioso.
Anche la TLC è governata dalla teoria generale della cromatografia, ma vanno
discusse alcune varianti che sono caratteristiche dei metodi planari.
Giorgio Bonaga
TLC
La trattazione della TLC può essere organizzata in 4 punti:
a.
b.
c.
d.
Flusso della fase mobile
Fase stazionaria
Fase mobile
Esecuzione della TLC
a. FLUSSO DELLA FASE MOBILE
La migrazione della fase mobile avviene per capillarità ascensionale (la
capillarità è l’insieme dei fenomeni dovuti alle interazioni tra le molecole di
un liquido ed un solido, in corrispondenza della superficie che li separa).
Il flusso ascensionale per capillarità dipende dalla natura della fase mobile
(dalla sua tensione superficiale g e viscosità h), dalla natura della fase
stazionaria (dimensione delle particelle) e dalla temperatura. In conclusione,
dalle stesse variabili che, nella teoria generale della cromatografia, venivano
indicate come i parametri che influenzano l’equilibrio di distribuzione
termodinamico.
Giorgio Bonaga
TENSIONE SUPERFICIALE (g)
Giorgio Bonaga
La tensione superficiale (N/m) è la forza che agisce sulle molecole della superficie libera di un
liquido, conferendo alla superficie proprietà simili a quelle di una pellicola elastica.
La natura della tensione superficiale è la stessa delle forze attrattive che agiscono tra le molecole
interne del liquido: sono forze di coesione, di natura elettrostatica (legami a idrogeno, forze di
London), antagoniste alle forze di adesione (legami a idrogeno), che si stabiliscono tra un fluido
ed una superficie solida. Tuttavia, mentre ogni molecola interna, completamente circondata dal
liquido, è attratta in ugual misura in tutte le direzioni dalle molecole vicine, ogni singola
molecola superficiale risente solo dell’attrazione esercitata dalle molecole vicine; il risultato è una
forza di richiamo, che tende ad attirare le particelle superficiali verso l’interno del liquido,
conferendo alla superficie caratteristiche elastiche.
tensione superficiale
Un effetto noto della competitività tra le forze di coesione e le forze di adesione è il profilo del
menisco del liquido (ad es.: acqua o mercurio) che riempie un tubo di vetro.
Nell’acqua le forze di adesione > forze di coesione e il menisco è concavo (l’acqua bagna il vetro
perché forma legami a idrogeno).
Nel mercurio le forze di adesione < forze di coesione e il menisco è convesso (il mercurio non bagna il
vetro perché non forma legami a idrogeno).
TENSIONE SUPERFICIALE E TEMPERATURA
La tensione superficiale (g) diminuisce all’aumentare della temperatura (T), dal momento che
aumentando il moto delle molecole si indeboliscono le forze di coesione intramolecolari.
solvente
acqua
esano
g
g (N/m)
0°C
20°C
50°C
7,6 . 10-2
7,2 . 10-2
6,8 . 10-2
2,2 . 10-2
1,8 . 10-2
1,4 . 10-2
Giorgio Bonaga
TENSIONE SUPERFICIALE (g) DI LIQUIDI
liquido
g (20°C)
N . m-1
etere etilico
1,7 . 10-2
esano
1,8 . 10-2
acetonitrile
1,9 . 10-2
metanolo
2,2 . 10-2
tetraidrofurano
2,6 . 10-2
cloroformio
2,7 . 10-2
tetraclorometano
2,7 . 10-2
diclorometano
2,8 . 10-2
toluene
2,8 . 10-2
benzene
2,8 . 10-2
diossano
3,4 . 10-2
glicerina
6,3 . 10-2
acqua
7,6 . 10-2
mercurio
42,7 . 10-2
Giorgio Bonaga
DUE ESEMPI DI TENSIONE SUPERFICIALE
Giorgio Bonaga
VISCOSITA’ (h)
La viscosità (Pa . s) è la resistenza allo scorrimento dei fluidi reali (liquidi e gas). Prendiamo un
fluido confinato tra due lastre di vetro di superficie A e distanti tra loro l. Tenendo ferma la
lastra di vetro inferiore, per fare scorrere quella superiore a velocità costante v occorre applicare
una forza F. Tale forza F è necessaria perché lo strato monomolecolare di fluido vicino alla
lastra superiore esercita una resistenza viscosa che si oppone allo scorrimento; ogni strato
monomolecolare di fluido esercita su quelli adiacenti una resistenza, tanto che la velocità v del
fluido ha un andamento a gradiente (diminuisce, fino ad azzerarsi, procedendo dagli strati
superiori verso quelli inferiori) Il modulo della forza F risulta direttamente proporzionale a v e
ad A, inversamente proporzionale alla distanza l e dipende anche da un coefficiente di
proporzionalità detto coefficiente di viscosità (h).
F
v
v
v
l
v
v=0
Giorgio Bonaga
L’espressione che definisce il modulo F è:
F=h
A.v
l
Da cui si ricava il coefficiente di viscosità h:
F.l
h=
A.v
= Pa . s =
kg
m.s
COEFFICIENTE DI VISCOSITA’ E TEMPERATURA
Il coefficiente di viscosità h diminuisce all’aumentare della temperatura, dal momento che
aumentando il moto delle molecole diminuiscono le forze di coesione intramolecolari.
solvente
h (Pa . s)
0°C
20°C
60°C
acqua
1,8 . 10-3
1,0 . 10-3
0,65 . 10-3
glicerina
10000 . 10-3
1400 . 10-3
81 . 10-3
NOTA: nei gas, contrariamente ai liquidi, l’aumento di temperatura produce un aumento del
valore del coefficiente di viscosità.
Giorgio Bonaga
COEFFICIENTI DI VISCOSITA’ (h) DI LIQUIDI
liquido
h (20°C)
Pa . s
etere etilico
2,4 . 10-4
esano
2,9 . 10-4
acetonitrile
3,2 . 10-4
diclorometano
4,5 . 10-4
tetraidrofurano
4,6 . 10-4
metanolo
5,4 . 10-4
toluene
5,5 . 10-4
cloroformio
5,9 . 10-4
benzene
6,5 . 10-4
tetraclorometano
1,0 . 10-3
acqua
1,0 . 10-3
diossano
1,4 . 10-3
mercurio
1,7 . 10-3
glicerina
14,0 . 10-1
Giorgio Bonaga
DUE ESEMPI DI VISCOSITA’
Giorgio Bonaga
CONFRONTO DELLE g e h DI ALCUNI LIQUIDI
14,0 . 10-1
12
1,7 . 10-3
≈
10
h
(Pa . s)
50
42,7 . 10-2
≈
10
1,0 . 10-3
9
8
8
6,5 . 10-4
6
7,2 . 10-2
6
6,3 . 10-2
5,4 . 10-4
7
g
(N . m-1)
5
4
4
2,3 . 10-4
2
1,7 . 10-2
3
2,2 . 10-2
2,8 . 10-2
2
1
0
0
etiletere metanolo benzene
glicerina
acqua
mercurio
Giorgio Bonaga
Giorgio Bonaga
• la tensione superficiale
g favorisce l’ascesa
del liquido
CAPILLARITA’
(h)
• la densità d (e la gravità g) rallentano l’ascesa del liquido
tubo
capillare
H2O
Hg
La domanda è: quanto sale un liquido per capillarità ?
• La forza diretta verso l’alto è il prodotto della tensione superficiale (g) per la
lunghezza del contatto tra la superficie liquida e la parete di vetro, cioè la
circonferenza (2pr) del tubo.
• La forza diretta verso il basso è la gravità, pari all’accelerazione di gravità (g) per la
massa (m) del liquido, cioè il prodotto del suo volume (pr2h) per la sua densità (d).
Quando il liquido raggiunge l’altezza massima consentita, le due forze si eguagliano:
2prg = pr2hdg
da cui :
2prg
2g
h=
rdg
m = pr2hd
h
mg
Giorgio Bonaga
ESEMPI
Di quanti cm si innalza l’acqua, in un tubo di diametro interno di 0,4 mm, a 20°C ?
g (20°C) = 7,2 . 10-2 N . m-1
r = 0,2 mm
d(20°C) = 0,998 g . cm-3
g = 9,81 m . s-2
h = 7,43 cm
Di quanti cm si innalza l’esano, in un tubo di diametro interno di 0,4 mm, a 20°C ?
g (20°C) = 1,8 . 10-2 N . m-1
r = 0,2 mm
d(20°C) = 0,659 g . cm-3
g = 9,81 m . s-2
h = 2,78 cm
7,43 cm (acqua)
2,78 cm (esano)
Giorgio Bonaga
CAPILLARITA’ E TEMPERATURA
0°C
20°C
7,76 cm
3,40 cm
50°C
7,43 cm
2,78 cm
6,95 cm
2,20 cm
acqua
esano
Giorgio Bonaga
DUE ESEMPI DI CAPILLARITA’
Giorgio Bonaga
ASCIUGHIAMO …. IL TAVOLO
(un esempio di una pseudo-cromatografia su carta)
carta assorbente
superficie solida
Giorgio Bonaga
CAPILLARITA’ NELLA TLC
supporto inerte
(vetro, alluminio, PET)
fase stazionaria
(silica gel, allumina)
Sf
Af
Bf
fase mobile
(miscela di solventi)
Giorgio Bonaga
La capillarità ascensionale, dunque, trascina la fase mobile lungo lo strato di
fase stazionaria per effetto della tensione superficiale, in una migrazione
frenata dalla forza di gravità.
La distanza percorsa dal fronte del solvente (Sf) è data dall’espressione:
con:
t = tempo di migrazione
k = costante di proporzionalità =
1 . g
2dp h
con: dp = diametro delle particelle della fase stazionaria (in mm)
g = tensione superficiale del liquido (in N . m-1)
h = viscosità del liquido (Pa . s)
Giorgio Bonaga
Sf = √ t . k
Il flusso di fase mobile, pertanto, è direttamente proporzionale a g e
inversamente proporzionale a h. Esso non è costante, ma a gradiente, da un
valore massimo (estremità inferiore della lastra) a zero (estremità superiore
della lastra). Il fronte del solvente, pertanto, può essere definito la distanza
dall’origine nella quale il flusso della fase mobile è zero. È bene sottolineare che
nella TLC il flusso non è facilmente regolabile e che la sua tendenza ad
azzerarsi determina anche la dimensione massima della lastra (20 x 20 cm).
ESEMPI
Qual’è il Sf in una TLC ottenuta sviluppando con esano per 20 minuti a 20°C una lastra di gel di
silice con particelle del diametro di 5 mm ?
dp = 5 mm = 5 . 10-6 m
g (esano) = 1,8 . 10-2
Sf = √ k . t
N . m-1
h (esano) = 2,9 . 10-4 Pa . s
t = 20’ = 1200 s
Sf =
Sf =
1200 s
1
1,8 . 10-2 N . m-1
2 x 5 . 10-6 m
2,9 . 10-4 Pa . s
74 . 10-4 m2
Sf =  8,5 . 10-2 m =  8,5 cm
Nelle stesse condizioni, con:
dp = 20 mm
Sf =  4,5 . 10-2 m =  4,5 cm
Giorgio Bonaga
ESEMPI
Qual è il Sf in una TLC ottenuta sviluppando con metanolo per 30 minuti a 20°C una lastra di
gel di silice con particelle del diametro di 5 mm ?
dp = 5 mm = 5 . 10-6 m
g (metanolo) = 2,2 . 10-2
N . m-1
Sf = √ k . t
h (metanolo) = 5,4 . 10-4 Pa . s
t = 30’ = 1200 s
Sf =
Sf =
1200 s
1
2,2 . 10-2 N . m-1
2 x 5 . 10-6 m
5,4 . 10-4 Pa . s
49 . 10-4 m2
Sf =  7,0 . 10-2 m =  7,0 cm
Nelle stesse condizioni, con:
dp = 20 mm
Sf =  3,5 . 10-2 m =  3,5 cm
Giorgio Bonaga
ESEMPI
Qual è il Sf in una TLC ottenuta sviluppando con diossano per 20 minuti a 20°C una lastra di gel
di silice con particelle del diametro di 5 mm ?
dp = 5 mm = 5 . 10-6 m
g (diossano) = 3,4 . 10-2
N . m-1
Sf = √ k . t
h (diossano) = 1,4 . 10-3 Pa . s
t = 20’ = 1200 s
Sf =
Sf =
1200 s
1
3,4 . 10-2 N . m-1
2 x 5 . 10-6 m
1,4 . 10-4 Pa . s
29 . 10-4 m2
Sf =  5,4 . 10-2 m =  5,4 cm
Nelle stesse condizioni, con:
dp = 20 mm
Sf =  2,8 . 10-2 m =  2,8 cm
Giorgio Bonaga
Quando sulla lastra TLC si depone una soluzione di campione e si sviluppa
immergendola in una vaschetta contenente la fase mobile, nell’ascesa ciascun
soluto presente nel campione si ripartisce tra la fase mobile e la fase
stazionaria e migra con una certa velocità. Alla fine dell’eluizione (cioè
quando la fase mobile ha percorso la distanza Sf) ciascun soluto avrà percorso
una certa distanza (Xf) dal punto di caricamento del campione, distanza che
definisce il suo fattore di ritardo (Rf = Retard factor) o fattore di ritenzione
(Retention factor). L’ Rf è espresso dal rapporto tra il valore in centimetri della
migrazione del soluto, misurata a partire dalla linea di caricamento (cioè a
circa 2,5 cm dall’estremità inferiore della lastra) e la misura in centimetri
(normalmente 10-12 cm, con fasi mobili a bassa viscosità) del Sf .
Xf = 3 cm
Sf = 12 cm
Sf
Rf (X) = 3/12 = 0,25
Xf
Giorgio Bonaga
I valori di Rf possono essere convertiti nei valori del fattore di capacità k’,
attraverso la relazione:
1
-1
k’ =
Rf
Le condizioni TLC ottimali si realizzano quando il valore di Rf è compreso tra
0,20 e 0,25 perché ad essi corrisponde un valore di k’ compreso tra 4 e 3 (i
valori ideali del k’).
ESERCIZIO
Un soluto è migrato per 6 cm, in una TLC con Sf = 12 cm. Calcolare Rf e k’ del
soluto.
Rf = 6/12  0,5
1
- 1 = 1,0
0,5
Più è elevata la viscosità della fase mobile minore è la capillarità ascensionale
(h) dei soluti. Inoltre le bande (o le macchie) “scodano” (trascinamento). È un
effetto analogo alla diminuzione di flusso di gas di trasporto nella GC o alla
diminuzione di pressione della fase mobile nella HPLC.
k’ =
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LASTRA PER TLC (20 x 20 cm)
Sf
supporto di vetro
(20 x 20 cm)
Rf = 0,25
strato di
silica gel
start
PROPRIETA’
•
•
•
•
material
layer thickness
particle size
pore size
silica gel 60
250 mm
5-20 mm
60 Å
Giorgio Bonaga
b. FASE STAZIONARIA
Nella TLC la fase stazionaria è generalmente costituita da silice (più
raramente allumina), la cui gelificazione viene ottenuta con sostanze diverse
(acidi carbossilici, alcoli grassi, ecc.), successivamente addizionata di leganti
(gesso, alcol polivinilico, polimeri diversi) ed infine stratificata (con spessori
dipendenti dal tipo di TLC) sulla lastra di vetro.
Proprietà
Silice 40
Silice 60
Silice 100
40
60
100
Volume pori (ml/g)
0,65
0,75
1,0
Superficie specifica (m2/g)
650
500
400
Tipo di TLC
Spessore
strato
(mm)
Diametro
particelle
(mm)
Volume
depositabile
(ml)
Preparativa
500 - 2000
20 - 40
150
Analitica
250
10 – 20
1
HPTLC
150
5
1
Diametro pori (Å)
Giorgio Bonaga
Anche per la TLC è disponibile sul mercato silice per cromatografia a fase
diretta, silice funzionalizzata (C18) per cromatografia a fase inversa (con fasi
mobili contenenti al massimo il 25% di acqua, a causa della limitata
bagnabilità della silice funzionalizzata), silice per cromatografia a coppia ionica,
silice per cromatografia chirale.
La TLC che utilizza particelle di silice della dimensione di 5 mm è una tecnica
che raggiunge alte prestazioni ed è definita con l’acronimo HPTLC (High
Performance Thin Layer Chomatography).
2000 mm
40 mm
TLC
PREPARATIVA
250 mm
10 mm
TLC
ANALITICA
150 mm
5 mm
HPTLC
Giorgio Bonaga
c. FASE MOBILE
Nella TLC la fase mobile è una miscela di liquidi scelti in base al tipo di
tecnica cromatografica prescelta (fase diretta, fase inversa, ecc.).
Analogamente alla LC, per:
 FASE DIRETTA: la fase mobile si prepara miscelando un primo solvente
non polare (es. esano) con un secondo solvente più polare (es. etere etilico)
e con piccole quantità di un terzo solvente molto polare (es. acido acetico)
in modo da disattivare, in parte, lo strato di gel di silice ed evitare lo
scodamento delle macchie o delle bande;
 FASE INVERSA: la fase mobile si prepara miscelando un primo solvente
polare (es. acetonitrile) con un secondo solvente non polare (es.
toluene).
Giorgio Bonaga
d) ESECUZIONE DELLA TLC
1. Stoccaggio delle lastre
Le lastre per TLC vengono conservate in essicatore o attivate in stufa a
circa 100°C per un’ora prima dell’uso.
Giorgio Bonaga
Giorgio Bonaga
2. Caricamento del campione
Mediante una microsiringa o un capillare, la soluzione di campione viene
depositata a circa 2,5 cm dall’estremità inferiore della lastra, “a macchia”
(“spot”) nella TLC analitica o bidimensionale, a “banda” nella TLC
preparativa.
3. Sviluppo della lastra
La camera di sviluppo, a tenuta, è dotata di una vaschetta contenente circa
100 ml di fase mobile. La camera viene presaturata di fase mobile in
frigorifero, prima dello sviluppo. La lastra viene posta nella vaschetta e al
termine dello sviluppo viene estratta e asciugata.
Nel caso della TLC bidimensionale la lastra viene ruotata di 90° e
sviluppata una seconda volta in una seconda camera presaturata con la
fase mobile scelta per la seconda eluizione cromatografica.
ascensione
(capillarità)
CARICAMENTO E SVILUPPO
TLC MONODIMENSIONALE
Sf
(12 cm)
2,5 cm
caricamento del
campione “a banda”
Giorgio Bonaga
caricamento del
campione “a macchia”
CARICAMENTO E SVILUPPO
TLC BIDIMENSIONALE
caricamento del
campione
Giorgio Bonaga
CARICAMENTO E SVILUPPO
TLC BIDIMENSIONALE
caricamento del
campione
Giorgio Bonaga
CAMERA DI SVILUPPO PER TLC
Giorgio Bonaga
Giorgio Bonaga
4. Rivelatori e visualizzazione
Nella TLC sono numerosi, ma i più comuni si basano su due principi.
 Rivelatori di fluorescenza
Con un nebulizzatore si spruzza la lastra con una soluzione alcolica
di sale sodico di 2’,7’-diclorofluoresceina. La lastra viene visualizzata
con una lampada di Wood (radiazioni UV).
O
O
Cl
Na + - O
O
Cl
O-
+
Na
 Rivelatori per carbonizzazione
Con un nebulizzatore si spruzza la lastra con una soluzione satura
di bicromato di potassio in acido solforico. La lastra viene
visualizzata dopo riscaldamento in stufa a 110°C per alcuni minuti.
RIVELATORI E VISUALIZZAZIONE
lampada di Wood
Giorgio Bonaga
soluzione alcolica del sale sodico della 2',7'- diclorofluoresceina
RIVELATORI E VISUALIZZAZIONE
soluzione satura di K2Cr2O7 in H2SO4 (in stufa a 110°C per alcuni minuti)
Giorgio Bonaga
Giorgio Bonaga
ALTRI RIVELATORI
RIVELATORE
PREPARAZIONE DELLA SOLUZIONE
anisaldeide
soluzione di 0,5 ml di anisaldeide in 50 ml di CH3COOH
glaciale con aggiunta di 1 ml di H2SO4 concentrato
• steroli
• terpeni
reattivo di Dragendorff
soluzione 0,11 M di KI aggiunta a una soluzione 0,6 mM di
subnitrato di bismuto in CH3COOH 3,5 M
• alcaloidi
• composti con N quaternario
iodoplatinato di potassio
soluzione allo 0,15% di iodoplatinato di potassio aggiunta a
una soluzione al 3% di HCl diluito
• alcaloidi
• ammine
• composti azotati
soluzione al 10% di acido fosfomolibdico in etanolo
•
•
•
•
•
•
soluzione allo 0,25 % di rodammina B in etanolo
• lipidi
acido fosfomolibdico
rodammina B
O
C
SOSTANZE RIVELABILI
lipidi
steroli
lattoni
cheto- e idrossi-acidi
acidi grassi insaturi
composti fenolici
H
OCH3
anisaldeide
COOH
Bi5O(OH)9(NO3)4
K2PtI6
H3[P(MoO10)4] . xH2O
H3C
N
N
CH3
subnitrato
di bismuto
iodoplatinato
di potassio
acido fosfobolibdico
H3C
rodammina B
CH3