FACOLTA’ DI SCIENZE MATEMATICHE FISICHE E NATURALI
Corso di Laurea triennale in Scienze Biologiche
Effetto combinato di agonisti del recettore muscarinico M2
e farmaci chemioterapici convenzionali in linee tumorali
Relatore:
Candidato:
Prof.ssa Ada Maria Tata
Ludovica Spagnuolo
Anno accademico 2014-2015
ACETILCOLINA E TUMORI
Sottotipi
recettoriali espressi
Effetto biologico
dell'attivazione
del recettore
Gruppo di ricerca
M3, M5 (in minor misura)
migrazione
Sailer et al., 1999 Boss et al., 2005
M3 overespresso
proliferazione
M1-M5 (solo M3 funzionale)
proliferazione
Carcinoma polmonare broncoalveolare
M3
-
Song et al., 2007
Carcinoma polmonare delle cellule dello
squamoso
M3
-
Song et al., 2007
Adenocarcinoma alla prostata
M3
proliferazione
Rayford et al., 1997
Ipertrofia prostatica benigna (BPH)
M3
proliferazione
Carcinoma prostatico (PC)
M3
proliferazione
Tumore al seno
M3
proliferazione,
sintesi proteica
Adenocarcinoma mammario murino
M3
proliferazione,
angiogenesi
Rimmaudo et al., 2005
M2, M3, M5 (in minor misura)
proliferazione, inibizione
della migrazione
Guizzetti et al., 1995 Guizzetti et
al., 1998 Bordey et al., 2000
Tumore
Melanoma
Tumore al colon
Tumore polmonare a piccole cellule (SCLC)
Glioma
L’espressione e l’attivazione dei
mAChRs è in grado di regolare, in
Frucht et al., 1999
diverse linee cellulari tumorali, la
la migrazione e
Song et al.,proliferazione,
2007
l’angiogenesi
Acetilcolina:
neurotrasmettitore del
Rayford et al., 1997
sistema nervoso centrale
(SNC)
e periferico (SNP)
Rayford et al.,
1997
Jimènez & Montiel, 2005
RECETTORI COLINERGICI MUSCARINICI
I recettori muscarinici risultano espressi in molti
tumori primari e metastatici, in particolare M2:
Tumore alla
vescica
Neuroblastoma
Tumore alla
mammella
Glioblastoma
ESPRESSIONE DEL RECETTORE MUSCARINICO M2
Glioblastoma
Tumore alla mammella
hBrain
M1
M2
M3
M4
M5
M2
M3
-250 bp
-150 bp
18S-
Caratterizzazione del recettore muscarinico M2 nelle U251 MG
-84 bp
Caratterizzazione dei recettori muscarinici nelle MDA-MB-231
Effetto inibitorio dell’arecaidina sulla proliferazione e la sopravvivenza in entrambe le linee cellulari
TUMORE ALLA MAMMELLA
Caratteristiche del tumore
Terapia corrente
Farmaco antitumorale
 Altamente eterogeneo
 Resezione chirurgica
Antracicline
 Sorprendente diversità
fenotipica:
 Radioterapia
 Chemioterapia
- gruppo luminale A/B
 Ormonoterapia
- gruppo basal-like
 Uso di anticorpi monoclonali
- gruppo HER2
Taxani: Paclitaxel (o taxol)
GLIOBLASTOMA MULTIFORME
Caratteristiche del glioblastoma
Terapia corrente
 Astrocitoma di IV grado
 Asportazione chirurgica
 Forma tumorale aggressiva
 Radioterapia
 Prognosi severa
 Chemioterapia
 GM primario e secondario
Farmaco antitumorale
 Temozolomide
CHEMIO-RESISTENZA
Over-espressione delle pompe di efflusso ai farmaci
Meccanismi di chemio-resistenza intrinseci
 Cellule staminali tumorali
 Alterazione dei mi-RNAs
 Mutazione delle proteine di riparo
OBIETTIVI DELLA RICERCA
Individuare le concentrazioni sub-tossiche dei
farmaci antitumorali, la temozolomide e il
paclitaxel rispettivamente nelle linee cellulari
U251MG e MDA-MB-231
Combinare ognuno dei due farmaci con l’agonista
M2 usato a concentrazioni sub-tossiche
Valutare la modulazione dell’espressione delle
pompe da efflusso ai farmaci, in seguito al
trattamento combinato
SCHEMA SPERIMENTALE
Linee cellulari
Cellule di glioblastoma
multiforme U251
Tecniche utilizzate:
 Saggio di vitalità cellulare
 Analisi per RT-PCR e Western Blot
Cellule tumorali della ghiandola
mammaria MDA-MB-231
EFFETTO DEI FARMACI SULLA CRESCITA CELLULARE
LINEA CELLULARE: MDA-MB-231
RISULTATI: COTRATTAMENTO ARECAIDINA-PACLITAXEL
Effetti sulla crescita cellulare nelle MDA-MB-231 a 48h
***
O.D. (arbitrary units)
0.25
**
0.20
***
0.15
0.10
0.05
0.00
Ctrl
Are
12,5 M
Px
10 -9 M
Are 12,5 M +
Px 10 -9 M
EFFETTI DELL’ARECAIDINA SULLA CRESCITA CELLULARE
cell number/well X 1000
Concentrazioni sub-tossiche di arecaidina
nella linea cellulare U251 MG a 48h
40
30
***
20
10
0
ctrl
100
12.5
6.25
Are (M)
3
EFFETTI DELLA TEMOZOLOMIDE SULLA CRESCITA CELLULARE
Concentrazioni sub-tossiche del farmaco antitumorale
nella linea cellulare U251MG
DMSO
cell number/well X 1000
40
30
20
10
**
***
0
t=0
48h
72h
TMZ 400 M
TMZ 12.5 M
TMZ 100 M
TMZ 6.25 M
TMZ 50 M
TMZ 3 M
RISULTATI: COTRATTAMENTO ARECAIDINA-TEMOZOLOMIDE
Effetti sulla crescita cellulare nelle U251 MG a 48h
***
cell number/well x1000
40
**
**
30
20
10
0
DM SO
TM Z
3 M
Are
6,25 M
TM Z 3M +
Are 6,25 M
CONSIDERAZIONI
L’effetto combinato
determina una
diminuzione della
crescita cellulare
Questo consente di
ridurre gli effetti
tossici sull’intero
organismo
Cosa succede alle
pompe da efflusso in
seguito al cotrattamento?
RISULTATI - ESPRESSIONE DELLA POMPA ABC G2
Ctrl
abcg218S-
Are
12.5µM
Px Are 12.5µM+
10-9M Px10-9M
-203 bp
-84 bp
RISULTATI - ESPRESSIONE DELLA POMPA ABC B1
DMSO
abcb1 -
Are
6,25 M
TMZ
3M
Are 6,25 M+
TMZ 3 M
-294 bp
-84 bp
18S-
mRNA abc b1/18S
(O.D. arbitrary units)
4
3
2
1
0
DMSO
Are
TMZ Are 6,25  M+
6,25 M 3 M
TMZ 3 M
CONSIDERAZIONI
Il trattamento combinato è in grado di
ridurre significativamente l’espressione
delle pompe da efflusso
La diminuzione della farmacoresistenza,
causata da una ridotta espressione delle
pompe di efflusso MDR, determina
l’incapacità da parte della cellula di
estrudere i farmaci
CONCLUSIONI
L’utilizzo combinato dei farmaci a basso dosaggio
pone l’attenzione su un nuovo interessante approccio
terapeutico nella terapia anti-tumorale, che potrebbe
vedere potenziare gli effetti dei farmaci
chemioterapici diminuendo gli effetti collaterali che
questi hanno sull’intero organismo.