Per estrarre le aflatossine dal campione da
analizzare si utilizza cloroformio; dopo aver
filtrato, per purificare una parte del filtrato si
utilizza una cartuccia di florisil e poi una di
C18;
La separazione e la determinazione
successive si effettuano con sistema HPLC,
utilizzando una colonna C18 a fase inversa,
poi si effettua una derivatizzazione con una
soluz. di iodio satura e, infine, una
quantificazione, utilizzando un rivelatore a
fluorescenza.
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Cloroformio stabilizzato con etanolo (allo 0,5 – 1%)
Metanolo
Propanone (acetone)
Soluzione acetonelacqua (98:2)
Soluzione acqualmetanolo (80:20)
Soluzione acqualacetone (85:15)
Eluente per HPLC, costituito da una soluzione
acqualmetanolo/acetonitrile (130:70:40), i tre solventi devono
essere per HPLC
Soluzione di iodio satura in acqua (2 g di iodio in 400 ml di
acqua, agitazione magnetica almeno per 2 ore e filtrare)
Celite 545 o equivalente lavata con acido
Cartucce di florisil
Cartucce di C18
Soluzione standard di aflatossine
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Tritacarne
Agitatore meccanico
Bilancia analitica
Rotavapor
Carta da filtro a pieghe con diametro 24 cm o altra
equivalente
Filtro Millipore con pori di diametro 0,45 fvn
Colonna di vetro, con diametro interno di 1 cm circa
e lunghezza di 30 cm circa con attacco luer
Rubinetto di nylon con attacco luer
Siringa da 10 ml con attacco luer
Cromatografo HPLC
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Colonna C 18 da 311 o da 5 u per HPLC
Pompa per HPLC per la soluz. di iodio
Collegamento a T in acciaio inox, Vmorto zero da 1/16 per
0.75 nun
Spirale di reazione in teflon o in acciaio inox, avente
dimensioni comprese tra 300 x 0.5 mm e 5000 x 0.5 mm
Bagno termostato a olio o ad acqua a 60 °C con
regolatore di temperatura (± 0.1 °C)
Rivelatore a fluorescenza con λ di eccitazione = 365 nm
ed emissione = 435 nm, mentre per gli strumenti a filtri
l’emissione è < 400 nm; usare anche un regolatore di
contropressione per evitare la formazione di bolle d’aria
nella cella a flusso.
Integratore elettronico
AF = aflatossine
Le aflatossine sono cancerogene e quindi devono essere
maneggiate con molta prudenza. L’analisi va quindi eseguita
rigorosamente, sotto cappa, indossando guanti in lattice di
gomma; utilizzare il più possibile degli standard di aflatossine
in soluzione acquosa, evitando quindi quelli allo stato secco.
Infatti queste sostanze, essendo particolarmente
elettrostatiche, potrebbero diffondersi molto facilmente
nell‘ambiente di lavoro. In caso di versamento accidentale
di soluz. di AF, bisogna detergere con una soluz. di NaClO all'l
%, lasciare reagire per 10 min e successivamente utilizzare
una soluz. al 5% di acetone. Sciacquare tutta la vetreria
utilizzata con MeOH, aggiungere la soluz. all’1% di NaClO e
successivamente, passate due ore, aggiungere acetone fino
al 5% del tot. Fare reagire per 30 min e poi lavare con cura.
Macinare
completamente il
campione e renderlo
omogeneo
Estrarre 50 g di
campione, utilizzando
250 ml di CHCl3 e 25 ml
di acqua distillata, in
una beuta con tappo
smerigliato, e
aggiungere 25 g di
celite, che funge da
coadiuvante di
filtrazione(cioè un
materiale ausiliare nel
proc. di filtraz. la cui
funzione è di rendere
incomprimibile e poroso
il deposito di particelle
solide che si accumula
sul mezzo filtrante
durante la filtrazione)
Agitare per 30 minuti,
filtrare con filtro a
pieghe e poi
raccogliere 50 ml di
filtrato
Collegare il
rubinetto di nylon al
gambo corto della
cartuccia florisil,
lavare quest’ultima
e aspirare 10 ml di
CHCl3 con la siringa
e farne passare 8
nella cartuccia
attraverso il
rubinetto, per
togliere l’aria
Collegare il gambo
lungo della
cartuccia alla
colonna di vetro e
far passare gli altri 2
ml di CHCl3,
attraverso la
cartuccia, nella
colonna; poi
chiudere il rubinetto
e staccare la siringa
Aggiungere il filtrato
al complesso
colonna-cartuccia e
lasciare filtrare per
gravità, poi lavare
con 5 ml di CHCl3 e
poi con 20 ml di
MeOH; poi scartare i
componenti
dell’eluito
(attenzione: nel
frattempo
controllare che la
colonna-cartuccia
non vada a
secchezza)
Eluire le aflatoss.
con 40 ml di
acetonelacqua e
raccogliere
l’eluato
Utilizzando il
rotavapor,
concentrare
l’eluato, anche per
eliminare i residui di
acetone rimasti
che porterebbero
a perdita di analita
nella cartuccia
C18; riprendere
questo residuo con
1 ml di MeOH e 4
di acqua
Attaccare il
rubinetto al
gambo corto della
cartuccia di C18 e
far passare con la
siringa 10 ml di
MeOH, per togliere
l’aria; aspirare 10
ml di acqua e
farne passare 8
attraverso la
cartuccia
Collegare il gambo
lungo della
cartuccia a una
colonna di vetro e
far passare,
attraverso la
cartuccia, gli altri 2
ml di acqua, nella
colonna; poi
chiudere il
rubinetto e
staccare la siringa
Mettere l’estratto
ottenuto nella
colonna e, con
acqualmetanolo,
lavare il pallone
almeno 2 volte;
lasciare filtrare per
gravità; controllare
che la colonnacartuccia non
vada a secchezza
Eluire le aflatoss.
con 50 ml di
acqualacetone;
raccogliere tutto
l’eluato in un
cilindro graduato;
se ritenuto
necessario, portare
a 50 ml con acqua
e mescolare.
Predisporre il
flusso della
pompa a 0,5/0,3
ml/min, rispettiv.
per colonna da 5
o da 311 u; la
fase mobile
(eluente) è
acqualmetanolo
/acetonitrile
Il flusso dell’altra
pompa
dev’essere
predisposto a
0,4/0,2 ml/min
della soluzione
satura di iodio per
flussi rispettiv. per i
flussi 0,5 e 0,3
ml/min della fase
mobile
Il rivelatore a
fluorescenza va
impostato alle λ
di lavoro;
regolare il
detector
impostando una
deviazione di
circa l’80% del
fondo scala del
registratore per 1
ng di AFB1
Introdurre per iniezione
nello strumento 250 μl
degli standard e
dell’estratto del
campione
Verificare la linearità
della risposta
fluorimetrica
calcolando la curva di
regressione lineare
(y=ax+b) che si ottiene
correlando la quantità
x delle AF iniettate in
ng con le aree
proporzionali
all’intensità di
fluorescenza y
II contenuto delle aflatossine totali del
campione, in μg/Kg, è calcolato con la
seguente formula:
ISTITUTO SUPERIORE DI SANITA’, Metodi di
analisi utilizzati per il controllo chimico degli
alimenti, raccolta a cura di Massimo Baldini,
Fabio Fabietti, Stefania Giammarioli,
Roberta Onori, Leucio Orefice e Angelo
Stacchini, 1996, v, 265 p. Rapporti ISTISAN
96/34
 RICERCA SULLE CARATTERISTICHE DI
FILTRABILITA’ DELLA BIRRA E OTTIMIZZAZIONE
DEL PROCESSO DI FILTRAZIONE, tesi
Presentata da: MICHELE SENSIDONI,
Università di Bologna
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