LE BIOTECNOLOGIE E IL DNA RICOMBINANTE
di Gabriele Virgilio classe 2 G a.s. 2012/13
CHE COSA SONO LE BIOTECNOLOGIE
Le biotecnologie sono un insieme di tecniche sviluppate a
partire dalle conoscenze scientifiche acquisite nel campo della
biologia e della genetica. Sono finalizzate alla produzione di
nuove molecole a partire da sistemi biologici esistenti in natura
ed opportunamente selezionati o appositamente creati in
laboratorio.
Struttura dell’RNA
Struttura
a doppia elica
del DNA
FASI DI SVILUPPO DELLE BIOTECNOLOGIE
I fase: (preistoria – 1850) : Le tecnologie sono rozze senza
comprensione dei principi scientifici.
Esempi: Bevande alcoliche; pane; formaggi; cibi fermentati
(yogurt); concia delle pelli; purificazione dei liquami.
II fase: (1850 – 1940) : Le tecnologie svolte in condizioni di quasi
sterilità prevedono la manipolazione dei mezzi di coltura per
incrementare le rese dei prodotti.
Esempi: Glicerolo; acido citrico; colture pure di lievito per
l’alimentazione; preparazioni enzimatiche grezze; primi insetticidi
microbici.
III fase: (1840 – anni Settanta) : Le tecnologie prevedono processi
microbici più complessi. Si producono sostanze di interesse
farmaceutico e i livelli di sterilità sono molto elevati. Colture pure e
sviluppo estensivo di nuovi ceppi.
Esempi: Antibiotici.
IV fase: (Fine anni Settanta – oggi) : Le tecnologie prevedono
l’identificazione, l’isolamento, la modifica e lo sviluppo controllato di
specifici prodotti genici.
Esempi: Prodotti farmaceutici mediante trasferimento genico
(l’ormone umano della crescita e l’insulina); diagnosi prenatale delle
malattie geniche.
SETTORI BIOTECNOLOGICI
Blue biotechnology (o biotecnologie marine)
È il settore che si occupa di applicare le metodiche della biologia
molecolare agli organismi marini e di acqua dolce.
Grey biotechnology (o biotecnologie ambientali)
È il settore che si interessa di tutte le applicazioni
correlate all'ambiente.
Green biotechnology (o biotecnologie agroalimentari)
È il settore delle biotecnologie che si occupa dei processi agricoli.
Red biotechnology (o biotecnologie farmaceutiche)
È il settore delle biotecnologie che si occupa
dei processi biomedici e farmaceutici.
White biotechnology (o biotecnologie industriali)
È il settore delle biotecnologie che si occupa dei
processi di interesse industriale.
Gold biotechnology (o bioinformatica)
La bioinformatica è una scienza multidisciplinare che integra
conoscenze informatiche, chimiche, matematiche, mediche e
biologiche
INGEGNERIA GENETICA O TECNICA DEL DNA RICOMBINANTE
È una tecnologia che permette di tagliare, modificare e trasferire
geni da una cellula all’altra (anche di specie diverse).
Il
DNA
ricombinante viene utilizzato per:
- ottenere frammenti specifici di DNA
in grandi quantità
- studiare la sequenza di determinati
frammenti genici
- identificare particolari sequenze in
un cromosoma
- studiare le modalità di espressione e
regolazione genica
- creare piante o animali transgenici
- diagnosticare e curare malattie
genetiche
Lo spostamento di geni da una cellula all’altra è un fatto che in
natura avviene regolarmente.
Nei batteri tramite:
-
CONIUGAZIONE
TRASDUZIONE
TRASFORMAZIONE
I microrganismi più usati nell’ingegneria genetica sono
BATTERI e VIRUS per
-
semplicità di struttura
rapidità di crescita
facilità di purificazione dei prodotti
STRUMENTI DELL’INGEGNERIA GENETICA
-Enzimi di RESTRIZIONE: alcuni ceppi di batteri (in particolare
Escherichia coli) riescono a prevenire l’infezione da parte di
alcuni fagi fra cui il FAGO LAMBDA perché sono capaci di
a) distinguere il DNA infettante dal proprio
b) distruggerlo servendosi di un particolare enzima, detto
ENZIMA DI RESTRIZIONE
Ogni enzima di restrizione riconosce una specifica sequenza
costituita da alcune coppie di basi dette SITO O SEQUENZA DI
RICONOSCIMENTO ; alcuni enzimi effettuano il taglio lasciando
sporgere alcuni nucleotidi di un filamento rispetto all’altro.
ENZIMI DI RESTRIZIONE ¹
Per esempio l’enzima EcoRI riconosce la
sequenza :
GAATTC
CTTAAG
e taglia il DNA di entrambi i
filamenti tra le basi G e A; i due
filamenti si separano lasciando
sporgere a ciascuna estremità una
sequenza singola.
GAATTC
CTTAAG
Siti di restrizione
ENZIMI DI RESTRIZIONE ²
Gli enzimi di restrizione
possono effettuare due
tipi di tagli:
netti
come l’enzima Hpa1
sfalsati
come gli enzimi EcoR1 e
Hind3, che tagliano in
maniera asimmetrica,
creando “estremità
appiccicose”
-Enzima DNA LIGASI: in natura (Escherichia Coli) funge
da riparatore del DNA; viene utilizzato per legare le
estremità di due molecole di DNA; in precedenza
tagliate dall’enzima di restrizione.
-Enzima TRASCRITTASI INVERSA: (presente nei RETROVIRUS)
è utilizzato per formare molecole di DNA da una molecola di
È possibile, partendo dall’m-RNA di una qualsiasi proteina,
sintetizzare la molecola complementare di DNA (il gene)
corrispondente.
m-RNA
RNA.
filamento
2° filamento (c-DNA)
trascrittasi
complementare DNAcomplementare di DNA
inversa
di DNA
polimerasi
INGEGNERIA GENETICA IN MEDICINA
Terapia genica: le tecniche di ingegneria genetica possono essere
molto efficaci per curare alcune malattie dovute all’alterazione
di un singolo gene, mediante la sostituzione di un gene malato
con un gene sano. In questo campo ci sono ancora molti aspetti
etici e tecnici irrisolti
Diagnosi delle malattie: sono oggi disponibili test per la diagnosi
prenatale di molte malattie ereditarie che utilizzano enzimi di
restrizione e sonde di acidi nucleici per rilevare la presenza di
geni alterati. Due importanti test diagnostici prenatali
riguardano l’anemia falciforme e la corea di Huntington
TECNICA DEL DNA RICOMBINANTE
Il procedimento comprende cinque fasi successive:
-
che codifica per la proteina che si vuole
ottenere in grande quantità
ISOLAMENTO DEL GENE
- costruzione di una molecola di DNA RICOMBINANTE: il DNA da
isolare ed un plasmide batterico vengono tagliati dallo stesso
enzima di restrizione; queste due molecole tendono a formare
legami a idrogeno alle loro estremità che vengono unite mediante
l’enzima DNA ligasi; si ottiene così una molecola di DNA
ricombinante
-
INTRODUZIONE DEL DNA RICOMBINANTE NELLA CELLULA OSPITE:
il plasmide, pur contenendo anche DNA estraneo, si riproduce più
volte duplicando così anche il DNA associato
-
I batteri così modificati si riproducono.
Le cellule sono tutte geneticamente identiche; questo insieme è
detto CLONE. Poiché anche il DNA ricombinante presenta nella
cellula originaria si è riprodotto, si dice che il gene È STATO
CLONAZIONE DEL DNA
CLONATO
-
RECUPERO PROTEINA
mediante purificazione
ALCUNI PRODOTTI OTTENUTI PER LA CURA DELLA SALUTE
-
ormone della crescita
insulina umana
TPA (attivatore tissutale del plasminogeno)
calcitonina
fattore VIII della coagulazione per il trattamento dell’emofilia
vaccini contro malattie virali (per esempio epatite B
enzima renmina per la produzione di formaggi
interferoni (proteine attive contro i virus)
APPLICAZIONI FARMACOLOGICHE: L’INSULINA
L'insulina è un ormone proteico
dalle proprietà anaboliche,
prodotto dalle cellule beta del
pancreas; è formata da due catene
unite da due ponti solfuro: catena
A di 21 aminoacidi e catena B di 30
aminoacidi. La sua funzione più
nota è quella di regolatore dei
livelli di glucosio ematico
riducendo la glicemia mediante
l'attivazione di diversi processi
metabolici e cellulari.
INTERFERONI
Gli interferoni (IFN) sono una famiglia di proteine prodotte sia da
cellule del sistema immunitario (globuli bianchi) sia da cellule tissutali
in risposta alla presenza di agenti esterni come virus, batteri,
parassiti ma anche di cellule tumorali. Gli interferoni appartengono
alla vasta classe di glicoproteine
Esistono due tipi di interferoni, che comprendono tre classi principali:
alfa (α) e beta (β) (Tipo I)
gamma (γ) (Tipo II).
L'interferone-γ umano
L'interferone-β umano
VACCINI
L’immunologia moderna si è sviluppata attorno alle scoperte di
Jenner e Pasteur sulle vaccinazione contro il Vaiolo. Jenner
inoculava nei pazienti sani il virus del vaiolo bovino, questo
scatenava una risposta immunitaria che produceva anticorpi
protettivi contro il vaiolo umano senza scatenare la malattia.
Questo tipo di vaccinazione però causava la malattia in soggetti
sani nel 3% dei casi, una cifra troppo elevata per gli standard
moderni. Nell’ultimo secolo sono state fatte numerose ricerche
che hanno portato alla costruzione di vaccini sicuri e efficaci.
I VETTORI DI CLONAZIONE E CLONAZIONE GENICA
-
i plasmidi sono stati i primi vettori di clonazione
ultimamente nella maggior parte delle ricerche si impiegano
anche VIRUS, utilizzati comunemente quando si lavora su
DNA eucariotico
Nel 1973, con il primo esperimento di
clonazione di un segmento genico
inserito nel batterio Escherichia coli,
Stanley Cohen e Herbert Boye
dimostrarono che è possibile produrre
copie multiple di un determinato gene
LE BASI PER LA CLONAZIONE
I materiali necessari per il processo di clonazione sono:
-un frammento di DNA, che può essere ricavato anche da un
mRNA (in questo caso viene detto cDNA)
-specifici enzimi di restrizione che servono a “tagliare” il DNA
-particolari enzimi in grado di unire le estremità di nucleotidi
(DNA-ligasi)
-i plasmidi, vettori in grado di inserirsi nelle cellule ospiti
-cellule batteriche modificate in modo da rendere la loro
membrana permeabile al plasmide
PLASMIDI E…
I plasmidi sono:
-molecole circolari di DNA che
contengono alcuni geni (da uno a
decine)
-presenti naturalmente nelle cellule
batteriche, alle quali conferiscono
caratteristiche peculiari
-utilizzati in natura dai batteri per
favorire il trasferimento di
informazioni da una cellula all’altra
-in grado di trasportare un
frammento genetico da un
organismo all’altro (vettori)
…INSERZIONE DI UN GENE IN UN PLASMIDE
Se trattiamo un frammento di DNA e un plasmide
(anello di DNA) con lo stesso enzima di
restrizione, il frammento può integrarsi nel
plasmide, dato che le loro estremità sono
complementari
L’enzima DNA-ligasi
unisce e richiude le
estremità di DNA
ANIMALI GENETICAMENTE MODIFICATI
La clonazione nei mammiferi
consiste nel trasferimento del
nucleo di una cellula somatica,
prelevato da un organismo, in una
cellula uovo non fecondata privata
del materiale genetico proveniente
da un altro organismo
La pecora Dolly è stato il primo organismo
nato da un esperimento di clonazione nei
mammiferi
LA TECNICA PCR (polymerase chain reaction) O
REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI
PCR: reazione a catena della polimerasi
La PCR è una tecnica che permette di ottenere grandi quantità di
un determinato segmento genico grazie a cicli successivi di
duplicazione. Il campione di DNA può provenire da:
-un frammento di tessuto (es. biopsia)
-un capello (dalle cellule della base)
-una goccia di sangue essiccata
IBRIDAZIONE E SONDE NUCLEOTIDICHE
-L’ibridazione è una tecnica utilizzata per localizzare un segmento di
DNA in un cromosoma e si basa sull’utilizzo di una sonda marcata di
DNA complementare alla sequenza nucleotidica cercata
-La sonda può essere marcata con
radioisotopi o con un colorante
fluorescente; se la sonda incontra molecole
di DNA complementari, si appaia a esse,
evidenziandole
PROGETTO GENOMA UMANO
-Frammentando il DNA con
enzimi di restrizione si
ottengono segmenti che possono
essere separati (tramite
elettroforesi), clonati,
sequenziati e conservati in
banche dati informatizzate
-Nel 2000, grazie alla
collaborazione fra scienziati di
varie discipline scientifiche
(soprattutto biologia e
informatica), si è concluso il
Progetto Genoma Umano che ha
permesso di mappare l’intero
genoma dell’uomo
OGM E PIANTE TRANSGENICHE
Gli OGM (Organismo
geneticamente modificato)
Un organismo geneticamente
modificato (OGM) è un essere
vivente che possiede un patrimonio
genetico modificato tramite
tecniche di ingegneria genetica,
che consentono l'aggiunta,
l'eliminazione o la modifica di
elementi genici.
GloFish, pesci d’acquario resi fluorescenti
tramite transgenesi. Sono i primi animali
geneticamente modificati.
Le piante transgeniche sono piante il cui DNA è stato
modificato con tecniche di ingegneria genetica allo
scopo di approntare miglioramenti o modifiche di una o
più caratteristiche. Le piante transgeniche, spesso
indicate con il termine più generale di OGM (Organismi
Geneticamente Modificati), rappresentano una delle
più rilevanti innovazioni apparse nell'ultimo decennio.
APPLICAZIONI AGROALIMENTARI
Le piante GM (geneticamente modificate) presentano uno o più
geni modificati, con lo scopo di conferire loro particolari
caratteristiche o farle diventare resistenti a determinate malattie
Le fragole
GM risultano
più resistenti
al freddo
I pomodori
GM risultano
più resistenti
ai virus
In Italia le leggi vigenti non consentono di coltivare gli OGM su
larga scala
ORGANISMI TRANSGENICI
Gli organismi transgenici
possiedono nel proprio
genoma uno o più geni
appartenenti a individui di
un’altra specie
Si possono ottenere
isolando il gene che si
vuole trasferire e
inserendolo, mediante
microscopici aghi, in
cellule uovo fecondate;
queste verranno poi
impiantate in un organismo
che genererà individui in
grado di esprimere quel
carattere
APPLICAZIONI AMBIENTALI
Si possono utilizzare
microrganismi modificati
geneticamente per degradare
sostanze tossiche di rifiuto,
come metalli, idrocarburi,
pesticidi, diserbanti
Questo (Sulfolobus acidicaldarious)
appartiene a una delle specie più
spesso usate nella biorimediazione,
in quanto permette il passaggio in
soluzione di elementi metallici
In laboratorio sono stati
ottenuti batteri contenenti
plasmidi artificiali in grado di
ossidare idrocarburi più
velocemente dei batteri
naturali
Modifica genetica degli animali
Modifica genetica delle piante
DIBATTITO
OGM:
pro e