The Journal of Biological Chemistry,
published on September 25th, 2009 as Manuscript
The macrophage cholesterol
exporter ABCA1 functions as
an anti-inflammatory receptor
Chongren Tang, Yuhua Liu, Peter S.Kessler, Ashley M.Vaughan
and John F.Oram
Division of Metabolism, Endocrinology and Nutrition, Department of
Medicine, University of Washington, Seattle.
ATP-binding cassette
transporter A1
(ABCA1)
è una proteina integrale
di membrana,
responsabile dell’efflusso
del colesterolo dalle cellule e…
...espleta un’azione immunomodulante!!!
• Funzione e trasporto del
colesterolo
• Struttura e regolazione
dell’espressione di ABCA1
• Receptor-like activity and lipid
transport model
Il colesterolo è un metabolita abbondante nei tessuti dei
mammiferi,essenziale per parecchie funzioni biologiche.
ACAT
Fluidità di
membrana
Lipid rafts
Precursore
Ormoni steroidei:
-Mineralcorticoidi,
-Glucocorticoidi,
-Ormoni sessuali
Esteri del
colesterolo
Vitamina D
Acidi Biliari
8
1
6a
6c
6b
5
4
2
3
6
7
Le lipoproteine sono formate da :
1) apoproteine (alfa-elica amfipatica)
2) fosfolipidi
3) trigliceridi
4) colesterolo libero ed esterificato
5) acidi grassi liberi
Classificazione delle Lipoproteine
%proteine
1-2
7-10
10-12
20-22
30-35
55-77
99
LDL
Le LDL sono il principale trasportatore di
colesterolo ai tessuti. L'uptake delle LDL avviene
per via recettoriale al fegato (75/%), corteccia
surrenale e tessuto adiposo e MACROFAGI.
5
1
3b
2
4a
4b
3a
Immagine in TEM
dell’endocitosi
Mediata da
recettore
delle LDL
HDL
A subfraction of circulating lipoproteins called high-density lipoproteins
(HDLs) is involved in the export of excess cholesterol from cells
•Una delle maggiori funzioni delle
HDL è il trasporto del colesterolo dai
tessuti periferici al fegato, dove esso
viene escreto nella bile.
•Si ritiene che la rimozione
dell’eccesso di colesterolo dai
macrofagi del connettivo vascolare
da parte delle HDL abbia un ormai
ben stabilito effetto cardioprotettivo.
Core di esteri del
colesterolo
Sono stati identificati tre trasportatori di membrana che
mediano l’efflusso del colesterolo dalle cellule alle
componenti delle HDL.
Essi appartengono alla superfamiglia “ ATP-binding cassette
transporters (ABCs) “[trasportatori di membrana ATP-dipendenti]:
• ABCA1 trasporto di colesterolo, fosfolipidi ed altri metaboliti alle
apoproteine delle HDL;
è altamente espresso in fegato e macrofagi tissutali;
• ABCG1 e ABCG4trasporto del colesterolo a HDL e altre
lipoproteine;
ABCG1 è anch’esso espresso nei macrofagi e lavora in sinergia con
ABCA1 nel rimuovere il colesterolo in eccesso.
ABCG4 è selettivamente espresso nei neuroni dove è specializzato
nel trasporto lipidico
• Funzione e trasporto del
colesterolo
• Struttura e regolazione
dell’espressione di ABCA1
• Receptor-like activity and lipid
transport model
ABCA1
WalkerA
WalkerC
NBD2
NBD1
WalkerB
Substrati
Fosfolipidi
(fosfatidilcolina)
Colesterolo
Accettori
Proteine contenenti alfaeliche
anfipatichedi HDL:
Apolipoproteine
(11,22aa),in
gli C-III,
aa A-IV
A-I,
A-II, E, C-I,cui
C-II,
carichi si dispongono lungo
una faccia
dell’asse,gli aa
PLTP:
phospholipid-transferidrofobici protein
sulla faccia
opposta!
Cytogenetic location: 9q31.1
The cellular transporter ABCA1 is a critical protein
that transports excess free cholesterol (FC) out of
the cell to an acceptor, lipid-poor apo A-I.
ABCA1 gene transcription is regulated by the
nuclear receptor heterodimer liver X
receptor/retinoid X receptor (LXR/RXR). Cellular
oxysterols appear to be one of the endogenous
ligands for LXR and promote the transcription of
ABCA1. Oxysterols are generated from free
cholesterol. Presumably, this represents a
homeostatic mechanism by which macrophages rid
themselves of excess free cholesterol. LXR gene
transcription is also influenced by both peroxisome
proliferator-activated receptor  (PPAR-) and
PPAR-
PPARs
A-I
oxysterols
LXR/RXR
ABCA1
• Funzione e trasporto del
colesterolo
• Struttura e regolazione
dell’espressione di ABCA1
• Receptor-like activity and lipid
transport model
Receptor-like activity
ABCA1 is unique among eukaryotic ABC transporters
that requires the direct binding of the acceptor for
the transported substrate.The ABCA1 binding
determinant of apolipoproteins is the amphipatic αhelix.This binding may be mediated by the large
extracellular loops of ABCA1,which are unique for
this family of transporters.
The interaction of apolipoproteins with ABCA1expressing cells also activates signaling
molecules that modulate ABCA1 expression or
lipid transport activity:these findings suggest that
apolipoprotein/ABCA1 interactions behave like a
ligand/receptor system.In fact, this interaction
stimulates autophosphorylation of tyrosine
kinase Jak2,thus generating the active Jak2:apo
A-I potentiates its own interaction with ABCA1
by activating Jak2,which in turn increases the
apo A-I binding to ABCA1 required for lipid
removal (FEEDFORWARD MECHANISM)
RECEPTOR ACTIVITY
LIPID TRANSPORT MODEL
Chamber
P
ATP
ADP
2
3
4
5
HDL
(A)Phospholipids and perhaps free cholesterol ( C ) are translocated across the
plasma membrane to form tightly packed and disordered lipid domains that
protrude from the cells. (B) Apo A-I binds to ABCA1 and stimulates
phosphorilation of Jak2.( C ) The phosphorilated/activated Jak2 enhances the
Apo A-I binding to ABCA1 required for interaction with lipid domains generated by
ABCA1.(D)Apo A-I solubilizes the lipids to form nascent HDL particles.
ATP-binding cassette
transporter A1
(ABCA1)
è una proteina integrale
di membrana,
responsabile dell’efflusso
del colesterolo dalle cellule e…
...espleta un’azione immunomodulante!!!
Cholesterol uptake
• LDL e oxLDL
• Uptake di oxLDL: recettori
Scavenger
• Signaling pathway associato
a Recettori Scavenger
LDL/LDL-R
LDL
…Le LDL sono tutte uguali?
oxLDL (LDL modificate)
Danno da Radicali Liberi
(ROS,RNS):
-respirazione cellulare(mitocondriale) ossidasi microsomiali
-catalizzatori chimici (metalli di
transizione)
-prodotti di PMN (NADPH ossidasi,
Mieloperossidasi)
LDL
-introito alimentare di lipidi ossidati
(termo-ossidazione:frittura)
Perossidazione del colesterolo
LDL
oxLDL
Acido
9-idrossiAcido
linoleico
(C18)
octadecadienoico
Tirosina
nitrotirosina
ossiSteroli
Steroli
Formazione di
AGECross Links
Site of chemical modifications in in vivo LDL− and ONOO−-treated LDL
The secondary structure of the apoB-100 is showed. We show the chemical
modifications in LDL− and ONOO−-treated LDL.
Gli AGE sono in grado di modificare i gruppi aminici primari dei
fosfolipidi e delle apo(B-100) delle lipoproteine a bassa densità (LDL).
Gli AGE, inoltre, sono in grado di iniziare una serie di reazioni
ossidative che promuovono la generazione di LDL ossidate.
•Treatment of native LDL with ONOO- resulted in
extensive tyrosine
nitration , accumulation of
tyrosine nitration
lipid
peroxides, and loss of α-helical structure and,
lipid peroxides
as a corollary, formation of oxLDL:
Nitrotyrosine and lipid peroxide accumulation are
synergistically responsible for unfolding of αhelices inherent in LDL− formation.
•Glucose reacts nonenzymatically with the
amino groups of proteins to form stable,
cross-linking
cross-linking adducts called advanced glycation
end products or AGEs.
Self o NON-SELF?
(that’s the question!)
SELF ALTERATO!!
Le LDL modificate sembra che possano essere
riconosciute da recettori specifici a livello delle cellule
endoteliali e dei monociti/macrofagi e sono in grado quindi
di indurre modificazioni fenotipiche di tipo secretorio e
proliferativo.
oxLDL
Azione chemiotattica
IMMUNOGENA
induce
Pattern di espressione
genica (geni della flogosi)
Citochine proinfiammatorie
Molecole di adesione cellulare
Motilità dei
macrofagi
sulla parete
arteriosa
.oo
OOH
ONOO-
ROOH
le LDL modificate (oxLDL) non
vengono riconosciute dal
recettore fisiologico LDL-R
come vengono internalizzate?
Recettori SCAVENGER
Per Recettori scavenger(=“spazzini”) s’intende un
gruppo di recettori capaci di legare le LDL
modificate(ossidate,acetilate).
Sono prevalentemente espressi sui macrofagi(immunità innata)
Modified proteins
Apoptotic
cells’
Phosphatidyl
serine
Oxidised
Acetylated
AGE-
LDL
LDL
proteins
Bacterial
components
LPS
Lipoteichoic
acid
• Scavenger receptor class A:
LOX-1:
-Trimers
-collagene-like domain
-cysteine-rich domain
lectin-like
oxidized lowdensity
lipoprotein
receptor-1
They preferentially bind modified LDL by acetic acid and oxidized LDL
• Scavenger receptor class B:
-two transmembrane domains
-situated in specific plasma membrane
microdomains, the caveolae (lipid rafts).
CD36
Ossisteroli
endocitosi
Oxidized
fatty acid
The binding of oxidized low density
lipoprotein(LDL) to CD36 is mediated in part by
oxidized phospholipids that are associated with
both the lipid and protein moieties of the
lipoprotein.
CD36-dependent signaling pathway
Proteina
adattatrice
Ras_GDP
GTP
P
JNK
LYN
P
Grb2SoS
MAPK
ATP
P
ATP
Fos
Vav
AP-1
Jun
P
Dominio di omologia
CD4/CD8:
CysXCysX 5lys
(CXCX 5K)
Rac-GDP
GTP
Proteina
adattatrice
P
P
LYN
PLC
PKC
P
P
P
NFIκBκB
IKK
•Fas
•IL12
•MMPs
(MMP1, MMP2,
MMP3, MMP13)
Induzione
della
Flogosi
Innesco dei
meccanismi
effettori
dell’immunità
innata
•TNFα
•iNOS
•Fas
•MMPs
•CD40
•IL-1
•IL-6,IL-12
•CCL2(MCP-1)
Activator
Jun Protein
Fos– 1
(AP-1)
P
NF- κB
Uptake delle oxLDL
Induzione di un nuovo profilo trasduttivo
LDL
oxLDL
CD36
Geni
della
Flogosi
•Macrophage response to
oxidized lipid-loading:
A PATHWAY FOR
CHOLESTEROL EFFLUX
PPARγ-LXRα-ABCA1 Pathway
oxLDL
Acidi grassi
ossidati
ossisteroli
Foam
Cells
PPARγ
CD36
(Meccanismo
a feedback)
Attiva la
trascrizione
di
LXRα
RXR α
ABCA1
Efflusso di
colesterolo
(Apo-A1)
Sembra,quindi,che il rilascio di colesterolo e
lipidi ossidati dalle oxLDL provveda alla
clearance dei lipidi attraverso la trascrizione
attivata di ABCA1
•Uptake delle oxLDL
•Induzione di un nuovo profilo trasduttivo
(profilo infiammatorio)
Upregulation
di ABCA1
APOA1
Geni
della
Flogosi
CD36
ABCA1
HDL
oxLDL
LXRα
PPARγ
ABCA1 as an
anti-inflammatory
receptor
APO-A1
P
ESPERIENZE
Prima Esperienza (FIG.1,A-D)
Modello sperimentale: BHK-Cells
A n established line of Syrian hamster cells, descended from a clone (Clone 13)
isolated by Stoker and McPherson from an unusually rapidly growing primary
culture of new born hamster kidney tissue. Usually described as fibroblastic,
although smooth muscle like in that they express the muscle intermediate filament
protein desmin. Widely used as a viral host, in studies of oncogenic transformation
and of cell physiology.
TRANSFEZIONE
Introduzione di acidi nucleici (DNA,RNA) in cellule
eucariotiche. Si avvale dell’uso di genomi virali
ingegnerizzati(gene Target,sequenze di integrazione),
sfruttando la capacità del virus di trasmettere DNA.
(in genere retrotrascrizione tramite Retrovirus)
BHKcells
--
immunoprecipitazione
IP
+
-
+
ABCA1
+
APO-A1
RU-486
immunoblotting
IB
A
JAK2
P-JAK2
B
JAK2
JAK2
C
ABCA1
JAK2
D
ABCA1
P-JAK2
• L’incubazione di BHK-cells che esprimono ABCA1 con APO-A1
induce un aumento di Fosfo-JAK2
(N.B. JAK2 si autofosforila,attivandosi, e fosforila un residuo
tirosinico su ABCA1)-(Fig.1A)
• L’aumentata fosforilazione di JAK2 non è direttamente correlata ad
un aumento della propria espressione genica: la forma
fosforilata,secondo un meccanismo APO-A1/ABCA1-dipendente è
relativa ad un pool citoplasmatico preesistente (Fig.1B)
• L’immunoprecitpitazione di ABCA1 e la rivelazione di JAK2 tramite
anticorpi anti-JAK2,(immunoblotting),rivela un’interazione tra ABCA1
e JAK2(non fosforilata) ,non quantitativamente correlabile con il
pretrattamento con APO-A1,suggerendo che tale interazione sia
costitutiva. (Fig.1C)
• La forma fosforilata di JAK2,tuttavia,viene rivelata(con anticorpi anti
JAK-2-Fosforilato) , solo successivamente a pretrattamento con
APO-A1, suggerendo che l’attivazione di JAK2 (P-JAK2) sia da
imputarsi all’interazione di APO-A1 con ABCA1. (Fig.1D)
Plasmide
vuoto(controllo
negativo)
Le BHK-Cells che esprimono ABCA1sono state incubate con
APO-A1. Il pretrattamento con AG490*(+) è stato operato
30minuti prima. Gli immunoprecipitati(ABCA1) sono stati trattati
con anticorpi anti-fosfotirosina.
*AG490:potente inibitore della tirosin-chinasi JAK2; permea attraverso la membrana
plasmatica.
• La tirosin-chinasi JAK2 è responsabile della
fosforilazione di ABCA1.
• Inibitori di JAK2(es.AG490) rivelano,infatti,una
minore (ma non nulla)fosforilazione di
ABCA1,definibile come “basale”.
• L’attivazione di JAK2 incrementa di due volte lo
stato di fosforilazione di ABCA1
ApoA-I stimulates ABCA1-bound JAK2
autophosphorylation and ABCA1 tyrosine phosphorylation
APO-A1
XII
JAK2
P -Tyr
P
P
JAK2..e STATs?
STAT: Signal Transducers and Activator of Transcription
(fattori trascrizionali attivati da Chinasi della famiglia Janus)
a
2 esperienza (Fig.2)
Modello sperimentale
-Linea cellulare J774 (macrofagi murini): modello Biologico
-BHK-cells
Induttori di ABCA1 (N.B.:in assenza dell’induttore,ABCA1 non si rileva!)
- TO-901317:agonista non steroideo di LXR,permeante la
membrana (in J774,acLDL overnight)
-Mifepristone / RU-486
(in BHK-cells)
(/P-STAT5)
AG409
• L’attivazione di JAK2 lascia prevedere che associato ad ABCA1
sussista un meccanismo di trasduzione tramite il sistema
JAK/STAT.
• L’incubazione con di BHC-cells non transfette non rivela nessun
effetto sulla fosforilazione di STAT1,3,5.
ApoA1
interactions
with ABCA1• Tuttavia
sia nel modello
sperimentale(BHC-Cells
transfette cn
ABCA1) expressing
sia in quello biologico
di macrofagi
carichi di colesterolo
cells
increases
(J774,trattate cn TO-901317 che induce ABCA1),si determina un
aumento di P-STAT3 ma solo dopo preincubazione con APO-A1.
Tale effetto non si osserva per STAT1,5.
phosporylation of ABCA1associated STAT3
• L’interazione di APO-A1,induce il reclutamento di STAT3 nonché
della tirosin-chinasi-JAK2.
• STAT3 è fosforilata da JAK2
I domini citoplasmatici di legame a
STAT3(docking sites) presentano una
sequenza aa altamente conservata
YXXQ
(-Tyr-X-X-Gln-)
Y
Tyr
aa 19901993
G
aa 924927
Y
Tyr
Glu
E
Gly
G
̴ NBD1
Q
Gln
C
Cys
P
Pro
̴ NBD2
gp130
(prototypic
STAT3 docking site)
Q
Gln
3° esperienza
Modello sperimentale: transfected BHK-cells
(Mifepristone; [ 3H]colesterolo)
Tyr
924,
1990
•ABCA1-WT
•ABCA1 Y924F
•ABCA1 Y1990F
•ABCA1 Y924/1990F
Mutagenesi sito-diretta
(QuikChange XL SiteDirected Mutagenesis Kit)
Phe
Mutagenesi sito-specifica
• è una tecnica di biologia molecolare in cui una
mutazione è creata in modo selettivo in un particolare
sito di una molecola di DNA, solitamente un plasmide.
La tecnica differisce quindi dalla normale mutagenesi
in cui vengono indotte mutazioni che però si
distribuiscono in modo casuale nella sequenze di DNA.
In genere la mutagenesi sito specifica richiede la
conoscenza della sequenza di tipo selvatico (wild type)
del gene da mutagenizzare. La mutazione inserita potrà
essere una sostituzione di base o una inserzione o
DNAsisequenza
di
delezione di nucleotidi rispetto alla
per
originaria.La tecnica è talvoltarestrizione
chiamata
anche
DNA metilato
mutagenesi sito diretta o mutagenesi oligonucleotide
diretta.
Fig.3
• La mutazione sito diretta su ABCA1 dei siti di interazione di
STAT3 ha prodotto i risultati attesi:le cellule Y924P,Y1990P e
Y924/1990P mostrano una marcata riduzione nella
fosforilazione di STAT3 APO-A1-indotta;essa è abolita nelle
cellule a doppia mutazione,suggerendo un meccanismo di
cooperazione tra i due docking-sites(Fig.3B)
• La co-immunoprecipitazione
di ABCA1
e STAT3
si osserva
in
Mutating
candidate STAT3 docking
sites
in ABCA1
reduces
cellule WT e nonSTAT3
in cellule a doppia
apoA-I-stimulated
mutazione(Y924/1990P),implicando
il ruolo without
determinante
di
phosphorylation
and ABCA1 association
affecting
tali siti di legame(aa924,aa1990) nel reclutamento APO-A1
cholesterol
efflux
dipendente di STAT3(Fig.3C)
• Il reclutamento di STAT3,inoltre,sembra essere non richiesto
per l’attività di trasporto del colesterolo da parte del
trasportatore ABCA1(Fig.3A)
APO-A1
XII
JAK2
P -Tyr
(924,1990)
P
P
P
P-STAT3
4° Esperienza
Modello biologico(macrofagi carichi di colesterolo):
J774(+colesterolo derivato da acLDL) + TO901317(LXR-agonistABCA1)
•Pre-Incubazione con/senza APO-AI (3h)
•Incubazione con/senza LPS (3h)
[=attivazione cellulare,profilo proinfiammatorio]
IL-6
TNF-α
IL-1β NF-κB
(RT-PCR)
Fig.4
L’interazione di APO-A1 riduce l’effetto
stimolatorio(proinfiammatorio) dell’LPS
Scramble siRNA:
mSTAT3:
5’-AAGGCCGTGGTGGTGCGTGAGAAA-3’
RNAi:
5’-GCGTGGAAGCGGAGCATGATA-3’
silenziamento genico a livello post-traduzionale
• RNAi is a form of post-transcriptional
gene regulation in which doublestranded RNA (dsRNA) molecules
called small interfering RNA (siRNA)
mediate sequence specific
degradation of homologous mRNA.
STAT3-IB
J774
60%
MP
80%
100nM
50nM
100nM
siRNA
MP: mouse peritoneal
macrophages(+acLDL)
MP
Inbitore solubile di STAT3
L’interazione di APO-A1
con differenti
linee macrofagiche
che esprimono ABCA1,
deprime la produzione
di citochine
proinfiammatorie
attraverso il sistema
JAK2/STAT3
SH2-DOMAIN
5° ESPERIENZA
Modello in-vivo:
Topi C57B/6 che non esprimono STAT3 (˜macrofagi)
C57Black/6
Cholesterol-loaded macrophages from WT
or myloid-specific STAT3 KO mice
were pretreated for 3h with apoA-I or
10 ng/ml IL-10 and incubated for 3h with
LPS, and cytokine mRNA levels were
measured.
KnockOut (ricombinasi CRE-Lox)
Knock-OUT:metodo Cre-Lox
LysM
STAT-3
• Il metodo Knock-out condizionale più
usato è il metodo Cre-Lox, che si basa
Lys-M-Cre/C57BL/6 mouse
STAT3
/C57BL/6 mouse
sull’azione della Ricombinasi Cre, che è
un enzima che taglia un frammento di Dna
inserito tra due siti LoxP: la ricombinasi fa
avvenire lo scambio di filamenti
(ricombinazione omologa) tra due strutture
Lox allineateSTAT-3
originando delezione del
frammento interposto.
flox/flox
Macrofagi
(STAT3 -/- )
PM= macrofagi
peritoneali
Il K.O. di STAT3
BMM=
macrofagi del
chiaramente
midollo osseo
deprime
l’azione
antiinfiammatoria
WBC= cellule della
APO-A1,
seriedi
bianca(leucociti)
supportando
l’idea di un
coinvolgimento
centrale di STAT3
(APO-A1 mimics IL-10 in
suppressing inflammatory
cytokine production)
Fig.5
…ABCA1 -/- ?
L’abilità di APO-A1 di
sopprimere la produzione
di citochine proinfiammatorie (TNF-α ,IL-6)
è abolita dal K.O. di
ABCA1,
Indicando che ABCA1 è
primariamente richiesto per
l’attività di APO-A1.
APO-A1
JAK2
P
P
Il sistema trasduttivo APOA1/ABCA1 e IL-10/IL-10R
P
è del tutto analogo!
(JAK/STAT3)
P-STAT3
P
Dimero P-STAT3
P
STAT3 NETWORK
IL-10 family:
•IL-10
•IL-20
•IL-22
APO-A1
•TNF-α
•IFN-γ
•IL-1
•IL-6
Risoluzione
dell’infiammazione
•BIRC5
(survivin)
•HSP-90
•MCL1
(BCL2
family)
Oncogene
•Uptake delle oxLDL
•Induzione di un nuovo profilo trasduttivo
(profilo infiammatorio)
APOA1
STAT-3
Upregulation
di ABCA1
Efflusso
del
Geni
della
Flogosi
colesterolo
CD36
ABCA1
HDL
oxLDL
LXRα
PPARγ
Attività
antiinfiammatoria
•Dinamiche di una risposta infiammatoria
•Centralità nel ruolo dei macrofagi
Bilancio
Colesterolo
PAMP
LDL
oxLDL
LDL-R
Recettori
Scavenger
ossisteroli
PPARγ
LXR
Acidi
Grassi
ABCA1
R
E
S
O
L
U
T
I
O
N
OMEOSTASI
•Livelli plasmatici di HDL
(colesterolo HDL
> 40 mg/dL )
•Funzionalità di ABCA1
Segnali
proinfiammatori
Segnali
antiinfiammatori
•Livelli plasmatici di LDL
(colesterolo LDL
<100mg/dl)
•Ossidanti/antiossidanti
•Quota di lipidi ossidati
Pathophysiology
Gene variants
Over 70 mutations in ABCA1 have been identified in subjects with low
plasma HDL levels
ABCA1 GENE
1
3
2
ABCA1 and Cardiovascular
disease
•
•
•
Numerous population studies have
shown an inverse relationship between
plasma HDL levels and CVD risk..it‘s
clear that the relative activity of
ABCA1 plays a role!
Subjects with loss-of-function
homozygous or heterozygous
mutations in ABCA1 have a 4-6 fold
higher than normal incidence of
CVD,which applies equally to both
men and women.
Accumulation of sterol-laden “foam
cells” in the artery wall and
inflammation are early events in
formation of atherosclerotic
lesions.Thus,ABCA1’s role in
cholesterol export and antiinflammation suggests its impact on
ATHEROGENESIS.
ATEROSCLEROSI
L’ATEROSCLEROSI è una patologia
delle grosse e medie arterie,
caratterizzata da lesioni infiltrate di
lipidi,definite PLACCHE ATEROMATOSE,
che si sviluppano sulla superficie
interna dei vasi.
Ateroma (o placca fibrolipidica)
Inflammation & Atherosclerosis
• Numerose e controverse sono le ipotesi formulate nel tentativo di
identificare meccanismi responsabili di comparsa e progressione
dell’aterosclerosi.
• Al momento, la teoria più accreditata è quella infiammatoria di
Russel Ross (The response to injury),che ipotizza
nell’infiammazione il meccanismo mediante il quale i fattori di rischio
cardiovascolare evocano una risposta riparativa da parte della
parete vascolare,risposta che inizia con l’attivazione endoteliale
(alterazione meramente funzionale), per poi progredire e
stabilizzarsi con la formazione della placca aterosclerotica,vera e
propria alterazione morfologica.
• Le basi biologiche dell’infiammazione applicata all’aterosclerosi
hanno fornito una nuova chiave di lettura dei meccanismi
fisiopatologici,sottolineando il ruolo del RECLUTAMENTO
LEUCOCITARIO.
3
4
1
6
2
7
IFN-γ
5
e LDL ox
INFIAMMAZIONE CRONICA
Durata relativamente lunga (giorni - anni)
Accumulo di linfociti e macrofagi
ATEROSCLEROSI=Patologia
cronica multifattoriale
Caratterizzata
dalla infiammatoria
infiltrazione
di linfociti e
macrofagi, da proliferazione vascolare e
formazione di tessuto fibroso
Le cellule predominanti sono, in genere,
quelle mononucleate (macrofagi, linfociti)
Citochine & Aterosclerosi
• Macrofagi e linfociti secernono una serie di
mediatori,tra cui le CITOCHINE, responsabili di
amplificare e perpetuare il processo
infiammatorio fino alla rottura della placca a
livello del cappuccio fibroso,come risultato dello
sbilanciamento tra fattori pro- e anti-infiammatori
(perdita del BALANCE CITOCHINICO).
• Non a caso, i pz aterosclerotici presentano
elevati livelli sierici di PCR e di citochine proinfiammatorie (IL-1,IL-6,IFN-γ,etc.)
CITOCHINE
Mediatori polipeptidici che fungono da segnali di comunicazione fra le
cellule del sistema immunitario, non antigene specifici, e fra
queste e diversi organi e tessuti.
Citochine
Emopoietiche
(IL-3,Il-7,IL-11..)
Citochine infiammatorie
Secondarie
(chemochine)
Citochine della
Immunità specifica
Classificazione funzionale
delle
Citochine
Citochine anti-infiammatorie
o immunosoppressive
(IL-10,TGF-β)
(IL-2,IL-12,IL-23..)
Citochine infiammatorie
Primarie
(IL-1,TNF,IL-6)
La composizione cellulare delle placche vulnerabili è caratterizzata da
infiltrati di linfociti Th1 e macrofagi,entrambi attivati dalle LDL
ossidate,le quali possono stimolare i monociti a produrre fattori proinfiammatori e citochine.
LDL ox
IFN-γ
IFN-γ è la principale citochina per l’ATTIVAZIONE CLASSICA dei macrofagi e
svolge importanti funzioni sia nell’immunità innata sia nelle risposte cellulomediate specifiche contro i microrganismi intracellulari.
IFN-γ signalling
pathway
•Attività biologiche di IFN-γ
•IFN-γ e ABCA1
IFN-γ inibisce l’espressione di LXR,determinando così DOWN REGULATION
DI ABCA1 e conseguente diminuzione dell’efflusso
di colesterolo dai macrofagi:
IFN-γ
IFN-γ EFFETTO PRO-ATEROGENICO
X
PROLIFERATION
L’espressione della citochina anti-infiammatoria IL-10 è stata rilevata
negli ateromi umani e suoi alti livelli sono stati associati a significativa
riduzione di morte cellulare ed espressione di iNOS.
Inibizione di NFkb e
delle metalloproteasi
TNF-α
e
COX-2
Linfociti Th1
IL-10
Inibizione apoptosi
monociti/macrofagi e
soppressione della
funzione macrofgica
Linfociti Th2
Inibizione produzione
di citochine
pro-infiammatorie
Si può prevedere che la misurazione della concentrazione plasmatica delle citochine
pro-infiammatorie nei pz aterosclerotici assumerà nel futuro un’importanza
clinica sempre maggiore,che permetterà di individuare terapie mirate per
determinati sottogruppi di pazienti.
L’ATEROSCLEROSI si sviluppa anche in
soggetti che presentano livelli
perfettamente normali di colesterolo e di
lipoproteine.Alcuni dei fattori che
predispongono all’aterosclerosi sono:
(1) inattività fisica e obesità;
(2) Diabete mellito;
(3) Ipertensione;
(4) Iperlipidemia;
(5) Fumo.
Questi fattori predisponenti interagiscono tra
loro in modo sinergico nell’aumentare
Il rischio di aterosclerosi.
ABCA1 is highly expressed in islet β-cells, where its selective ablation
increases their cholesterol content.These islets have reduced glucosestimulated insulin secretion,suggesting that the increased cell cholesterol
caused by the absence of ABCA1 impairs islet function.
rosiglitazone
Activation of genes
Rosiglitazone
improves glucose tolerance,but these beneficial effects disappear when
in insulin-responsive
ABCA1 iscells
ablated in β-cells.These findings suggest that β-cells ABCA1 contributes to
The insulin sensitizing effects of thiazolidinediones.
• Difetti di ABCA1 potrebbero essere implicati nelle complicazioni
microvascolari del diabete mellito di tipo 2.
•Due caratteristiche del diabete e della sindrome metabolica sono eccesso
di glucosio e acidi grassi.
Prolonged hyperglycemia
AGE
Distruzione diretta di
ABCA1 nei macrofagi
Fosforilazione di
ABCA1
Degradazione di ABCA1
Conclusioni
Livelli plasmatici
delle
HDL cardioprotettive
nel fegato
nei macrofagi
ABCA1
activity
Previene l’aterosclerosi
inibendo la
formazione di
foam cells e
sopprimendo
l’infiammazione
ABCA1 target terapeutico contro aterosclerosi e diabete!
nelle β-cellule
Stimola la produzione
di
insulina
Pharmacology
The activity of the ABCA1 pathway can be modulated at
multiple levels.
•Transcription
Agonisti di LXR inducono la trascrizione di
ABCA1 e forniscono un ulteriore vantaggio,
inducendo altre proteine coinvolte in alcuni
steps del trasporto del colesterolo:
•ABCG1efflusso di colesterolo alle HDL
•APO-Eefflusso di colesterolo dai macrofagi
in modo sia dipendente che indipendente
da ABCA1
•ABCG5 e ABCG8escrezione del colesterolo
endogeno e di quello esogeno nella bile.
RISCHI: gli agonisti di LXR
inducono l’espressione della
ACIDO GRASSO SINTASI
e di un fattore trascrizionale
detto “Sterol Regulatory
Binding Protein-1c”
(SREBP-1c) che attiva geni
di diversi enzimi coinvolti
nella biosintesi degli acidi
grassi.
ipertrigliceridemia
Agonisti di RXR, il partner eterodimerico
di LXR,stimolano anch’essi l’espressione di ABCA1.
•Post-transcription
Agonisti che stimolano la trascrizione di ABCA1hanno un’efficacia limitata,giacchè
i livelli e l’attività di ABCA1 sono regolati soprattutto a livello
post-trascrizionale.
Rischi: il limite maggiore di
questa classe di agonisti è che
RXR forma eterodimeri attivi con
molti altri recettori nucleari che
controllano diversi pathways
metabolici.Tuttavia,gli attivatori di
RXR inducono ABCA1 senza
influenzare i geni target di LXR e
ciò rende il “sistema RXR” il
possibile bersaglio di una terapia
selettiva.
La ricerca,attualmente,mira allo sviluppo di peptidi e altri piccoli agonisti che interagiscano con
ABCA1.Finora,sono stati prodotti alcuni peptidi dotati di α-elica anfipatica di 18- e 37- aa
che mimano le interazioni della apolipoproteine con ABCA1.
Un potenziale vantaggio di questi peptidi è che si possono somministrare per via orale e hanno
una lunga emivita. Uno svantaggio è che essi hanno effetti detergenti non specifici sulle
membrane fosfolipidiche e possono accumularsi nei tessuti e danneggiare le cellule.
Studi recenti supportano l’ipotesi che peptidi e molecole apolipoproteino-mimetiche
potrebbero essere validi agenti terapeutici nel trattamento della CVD e della
sindrome metabolica.
…in conclusione…
YINee YANG
LDL
oxLDL
LDL e oxLDL
• Yin
Yang sono opposti
• Lo LDL
Yin eeoxLDL
lo Yang sono interdipendenti
• Lo LDL
YineeoxLDL
lo Yang si consumano e si
sostengono a vicenda
LDL eeoxLDL
• Lo Yin
lo Yang possono trasformarsi
l'uno nell'altro
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