Il metodo Sanger
(o metodo a terminazione di catena)
Nel sequenziamento a terminazione di catena la reazione oltre ad
1) Uno stampo a singola elica
2) un innesco specifico (primer)
3) La marcatura con un dNTP* marcato, di solito con
35S
ha bisogno di:
4) una miscela di ddNTP, uno per ogni reazione di sequenza
Terminazione della catena
La sintesi del filamento compementare, tuttavia non prosegue
indefinitivamente, perché la miscela di reazione contiene, in quattro
distinte reazioni piccole quantità di specifici dideossinucleotidi
trifosfati, ddATP, ddTTP, ddCTP e ddGTP, che bloccano l’allungamento perché
posseggono un solo atomo di idrogeno al posto del gruppo -OH in 3’
Schema di sequenziamento a terminazione di catena
DNA stampo a
singola elica
3’-GGCTAAC
5’
Ibridazione con
Il primer
3’
3’-GGCTAAC
+
[35S]dATP+dCTP,dGTP,dTT (dNTP) +Sequenasi
ddATP, dNTP
ddCTP, dNTP
-CCG ddA
-ddC
-C ddC
A C
ddGTP, dNTP
ddTTP, dNTP
-CC ddG
-CCGATT ddG
G
-CCGA ddT
-CCGAT ddT
T
-CCGATT ddG
-CCGAT ddT
-CCGA ddT
-CCG ddA
-CC ddG
-C ddC
-ddC
G
T
T
A
G
C
C
Sequenza: 5’-CCGATTG
Direzione di
lettura
Il sequenziamento automatizzato con marcatori fluorescenti
Coniugando a ciascun ddNTP
un diverso marcatore fluorescente, è
possibile effettuare le quattro reazioni di
sequenziamento in un unico tubo da saggio
e caricare il tutto in solo pozzetto di gel
ddA
ddT
ddC
ddG
Le emissioni fluorescenti vengono captate da un rilevatore e le
informazioni vengono integrate e trasformate in picchi di colore
diverso, con aree proporzionali all’intensità di emissione.
Fluorescent DNA Sequencing
AGTAC T G G GAT C
Gel
Electrophoresis
Detection of Fluorescently Tagged
DNA
DNA Fragments
Separated by
Electrophoresis
Optical
Detection System
Scanning Laser
Excites
Fluorescent Dyes
Output to Computer
Fluorescent DNA Sequencing
Data
Fluorescent DNA Sequence Trace
Overview of Facts Asserted
• 2.91 billion base pairs (bp)
• 1.1% exons, 24% introns, 75% intergenic
DNA
• 2.1 million single nucleotide
polymorphisms (SNP’s)
• less than 1% of all SNP’s reflected changes
in proteins
Structure of the genome