Ibridazione degli acidi nucleici
Condizioni che possono destabilizzare la
doppia elica provocando la separazione delle
due catene (denaturazione)
1.
2.
3.
4.
Alte temperature
pH alcalino estremo (>13)
Bassa forza ionica [Na+]
Presenza in soluzione di sostanze che
rompono i ponti a idrogeno (urea,
formamide).
La denaturazione della doppia elica si
accompagna a grosse variazioni delle proprietà
fisiche delle soluzioni di DNA
1. Diminuzione della viscosità
2. Aumento di assorbanza a 260nm
3. Variazione dell’attività ottica
Curve di denaturazione
La denaturazione non è un processo irreversibile.
Infatti se dopo la separazione delle eliche si fa
scendere gradualmente la temperatura, le singole
eliche complementari si possono riappaiarea
doppia elica può riformarsi. Questo processo si
chiama ibridazione.
La discesa graduale della temperatura e la
permanenza delle molecole per un certo tempo
pochi gradi al di sotto della temperatura di
denaturazione sono fondamentali affinchè ci
possa essere ibridazione, processo dipendente
dai moti di agitazione termica. Se dopo la
denaturazione la soluzione viene portata a
bassa temperatura non si ha ibridazione, ma
stabilizzazione della struttura secondaria delle
singole catene.
Per mezzo dell’ibridazione si possono
formare delle doppie eliche di DNADNA, DNA-RNA o RNA-RNA. La
condizione fondamentale perché ciò
avvenga è che in soluzione si mettano
molecole con sequenza complementare
(antiparallele). L’ibridazione è una
forma di riconoscimento molecolare
estremamente specifica.
In condizioni opportune di
temperatura e forza ionica
(stringenza) si possono
ottenere anche delle eliche
in cui sono tollerati degli
appaiamenti non perfetti
Effetti della stringenza di ibridazione
Cinetiche di rinaturazione
Come calcolare la temperatura di ‘melting’
(denaturazione) di una molecola di DNA
Tm= 81.5oC – 16.6(log10[Na+]) +
+0.41(%G+C) – 0.63 (%Formamide) –
–(600 / lunghezza)
•Valida per concentrazioni di sodio comprese tra 0.01M e 0.4M
•Valida per %G+C tra 30% e 75%
•Diminuisce di 1-1.5 gradi per ogni 1% di differenza nelle
sequenze
Come calcolare la temperatura di ‘melting’
(denaturazione) di oligonucleotidi
Formula più semplice (non molto
precisa, ma abbastanza valida per
oligonucleotidi < 20 basi):
4oC per ogni G o C
2oC per ogni A o T
Come calcolare la temperatura di ‘melting’
(denaturazione) di oligonucleotidi
Formula più complessa (risultati
ragionevoli tra 14 e 70 basi):
Tm= 81.5oC – 16.6(log10[Na+]) +
+0.41(%G+C) –(600 / lunghezza)
Come calcolare la temperatura di ‘melting’
(denaturazione) di oligonucleotidi
Metodo più rigoroso: nearest neighbor
Interazione
DH
DS
DG
AA/TT
AT/TA
TA/AT
CA/GT
GT/CA
CT/GA
GA/CT
CG/GC
GC/CG
GG/CC
9.1
8.6
6.0
5.8
6.5
7.8
5.6
11.9
11.1
11.0
24.0
23.9
16.9
12.9
17.3
20.8
13.5
27.8
26.7
26.6
1.9
1.5
0.9
1.9
1.3
1.6
1.6
3.6
3.1
3.1
Ibridizzazione degli acidi nucleici
Metodo più rigoroso: nearest neighbor
Calcolo entalpia di transizione per oligonucleotidi
DHtotale = Dhi + S Dhx
11.0
9.1
9.1
11.0




G-G-A-A-T-T-C-C
* * * * * * * *
C-C-T-T-A-A-G-G
5.6
S Dhx= 60 kcal
8.6
5.6
DH osservato=58.3 kcal
Programma per calcolare le temperature di melting
degli oligonucleotidi con i diversi metodi:
http://www.basic.nwu.edu/biotools/oligocalc.html
Sintesi chimica
oligonucleotidi:
Con questo sistema si possono
sintetizzare in vitro singoli filamenti di
DNA di grandezza compresa
tra 6 e 100 nucleotidi
Le DNA polimerasi batteriche possono essere
purificate e utilizzate per sintetizzare DNA in vitro
dATP
dCTP
dGTP
dTTP
Primer sintetico
3’
5’
5’
3’
DNA stampo (singolo filamento)
DNA polimerasi
Le DNA polimerasi batteriche possono essere
purificate e utilizzate per sintetizzare DNA in vitro
DNA polimerasi
5’
5’
3’
DNA stampo (singolo filamento)
Le DNA polimerasi batteriche possono essere
purificate e utilizzate per sintetizzare DNA in vitro
3’
5’
5’
3’
Traccianti utilizzati
Nucleotidi marcati con isotopi radioattivi
Traccianti utilizzati
Nucleotidi marcati con sostanze non radioattive
Traccianti utilizzati
Nucleotidi marcati con sostanze non radioattive
- Fluorocromi (marcatura diretta)
- Enzimi (perossidasi, fosfatasi alcalina)
- Digossigenina (riconosciuta da anticorpi specifici
marcati con fluorocromi o enzimi)
- Biotina (riconosciuta da avidina marcata con
fluorocromi o enzimi)
Traccianti utilizzati
Fluorocromi
POLIMERASE CHAIN REACTION (PCR)
-E’ UNA PROCEDURA PER OTTENERE IN
GRANDE QUANTITA’ UNA SPECIFICA
SEQUENZA DI DNA IN VITRO
-QUESTA TECNICA PUO’ AMPLIFICARE UN
TRATTO DI DNA PER PIU’ DI UN MILIONE DI
VOLTE
ELEMENTI NECESSARI ALLA REAZIONE:
1- DUE OLIGONUCLEOTIDI COMPLEMENTARI A
DUE REGIONI CHE SI TROVANO SU FILAMENTI
OPPOSTI DEL DNA STAMPO AI LATI DELLA
REGIONE CHE SI VUOLE AMPLIFICARE
2- DNA STAMPO CHE CONTENGA LA REGIONE
DA AMPLIFICARE
3- POLIMERASI TERMOSTABILE (NON VIENE
DENATURATA SE PORTATA A 95° C)
4- I 4 DESOSSINUCLEOTIDI TRIFOSFATI
PROCESSO DI PCR PREVEDE UN CERTO NUMERO
DI CICLI. OGNI CICLO CONSISTE DI 3 PASSAGGI:
1- DENATURAZIONE: TEMP. 95°C. IL DNA STAMPO
VIENE DENATURATO
2-APPAIAMENTO: 55°C CIRCA. I PRIMERS SI APPAIANO
CON IL DNA STAMPO
3- SINTESI: TEMP.72°C E’ OTTIMALE PER IL
FUNZIONAMENTO DI Taq (Termus aquaticus)
POLIMERASI
PCR
Cosa sono gli enzimi di restrizione
Sono enzimi che tagliano la doppia elica del
DNA in corrispondenza di specifiche
sequenze. Per questo motivo vengono anche
detti endonucleasi di restrizione (invece le
esonucleasi distruggono il DNA partendo
dalle estremità). Ne esistono molti tipi
diversi, ognuno dei quali riconosce una
sequenza particolare.
Gli enzimi di restrizione proteggono i batteri
dall’introduzione di molecole di DNA esogeno
Batteriofagi
Batterio
ceppo A
Batterio vivo
Batterio
ceppo B
Batterio lisato
-Nel 1970 Hamilton Smith ha isolato il primo enzima che taglia il
DNA a livello di una sequenza nucleotidica specifica.
-Endonucleasi di restrizione e metiltransferasi formano il
SISTEMA DI MODIFICAZIONE E RESTRIZIONE dei batteri.
SISTEMI DI RESTRIZIONE E MODIFICAZIONE
TIPO I: -primo ad essere scoperto
-composta da 3 subunità: 1-riconosce la seq di dna
2-metila il DNA
3-taglia il DNA
-devono essere presenti in complesso per funzionare
- NON TUTTI I SITI RICONOSCIUTI VERRANNO
TAGLIATI ALCUNI SARANNO METILATI.
-SEQ RICONOSCIUTE SONO LUNGHE E NON
PALINDROMICHE
-IL TAGLIO AVVIENE LONTANO DALLE SEQ
RICONOSCIUTE
TIPO III: Simile al tipo I. Costituito da 3 subunità.
-NON TUTTI I SITI VENGONO TAGLIATI
-RICONOSCE SEQ. PALINDROMICHE
-TAGLI A CIRCA 5 pb DI BASI DI DISTANZA
TIPO II: Costituite da due subunità
1-metila il DNA
2-taglia
- FUNZIONANO ANCHE SEPARATE!
- RICONOSCONO SEQ PALINDROMICHE
- TAGLIANO ALL’INTERNO DI SEQ RICONOSCIUTE O
A DISTANZA DEFINITA.
- UTILIZZATE PER MAPPARE E CLONARE IL DNA.
ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE DI TIPO II
-Servono a tagliare il DNA in modo preciso e prevedibile
-Sono stati isolati più di 1200 enzimi da procarioti
-Riconoscono più di 130 diverse sequenze nucleotidiche (sequenze
palindromiche di 4,6 o 8 nucleotidi).
Hae III
5’ GGCC 3’
3’ CCGG 5’
Eco RI
5’ GAATTC 3’
3’ CTTAAG 5’
Not I
5’ GCGGCCGC 3’
3’ CGCCGGCG 5’
Enzimi
Il taglio con gli
enzimididirestrizione
restrizione può
generare diversi tipi di estremità.
Eco RI= 5’ protruding
-GAATTC-G3’
-CTTAAG-CTTAA5’
Eco RV= blunt
-GATATC-CTATAG-
-GAT3’
-CTA5’
Pst I= 3’ protruding
-CTGCAG-CTGCA3’
-GACGTC-G5’
5’AATTC3’G-
5’ATC3’TAG-
5’G3’ACGTC-
QUANTE VOLTE TAGLIA UN ENZIMA DI RESTRIZIONE?
La maggior parte riconosce palindromi di 4 o 6 nucleotidi se
assumiamo che i 4 nucleotidi siano distribuiti a caso nelle molecole
di DNA:
-per enzimi che riconoscono palindromi di 4 nt si avrà IN MEDIA
un taglio ogni 256 nucleotidi (4x4x4x4).
-per enzimi che riconoscono palindromi di 6 nucleotidi avremo IN
MEDIA un taglio ogni 4.096 nucleotidi (46).
Il DNA digeritoEnzimi
con gli di
enzimi
di restrizione
restrizione
può essere analizzato mediante elettroforesi
Plasmide (P)
M
Eco RI (E)
10 kb
Bam HI (B)
Eco RI
DNA genomico (G)
3x 109 basi
P
P+B P+E G+E
-
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
+
MAPPATURA ENZIMATICA DI UN TRATTO DI DNA
6.6 bp
M
PstI
HindIII
PstI+HindIII
-
4.1
4
3
2.6
2.3
2
2.3
1.7
1.4
1.4
1.2
1.1
1.1
1
0.6
0,5
PstI HindIII
1.1 kb
0.6 kb
2.3 kb
+
HindIII PstI
1.2 kb
1.4 kb
Enzimi di restrizione
Gli enzimi di restrizione, consentendo di
tagliare il DNA in frammenti non
casuali, la cui grandezza dipende
unicamente dalla sequenza,
costituiscono un formidabile
strumento sia per l’analisi che per la
manipolazione del DNA.
Le DNA ligasi sono enzimi capaci di legare
covalentemente due molecole di DNA adiacenti
con estremità libere