Oncologia Sperimentale di
laboratorio
METASTASI SPERIMENTALI
RIPRODUZIONE DEL PROCESSO METASTATICO
IN VITRO
5° S. Beninati
METASTASI SPERIMENTALE
• Il processo metastatico può essere
riprodotto sperimentalmente e quindi
suddiviso nelle fasi che lo compongono.
• In tal modo è possibile studiare i diversi
momenti dell’invasione metastatica
riducendo le possibili variabili.
• L’osservazione diviene facilmente
interpretabile, permettendo di definire il
bersaglio della ricerca
Farmaci antineoplastici
• Una molecola o un insieme di molecole si
definisce antineoplastica quando esercita
una azione tesa ad inibire lo sviluppo e la
disseminazione delle cellule tumorali.
• Il termine antineoplastico è generico
poiché non specifica quale fase della
crescita tumorale viene colpita dalla
molecola.
Antiproliferativo o antimetastatico?
• Un tumore può essere altamente proliferante ma
con bassa metastaticità (questa condizione è
presente anche nei tumori benigni)
• Al contrario può essere altamente metastaticio
ma con bassa proliferazione
• Può anche possedere le due caratteristiche
assieme
Modelli sperimentali
• Al fine di studiare quale fase del processo
tumorale viene influenzata dalla molecola in
esame, si utilizzano modelli sperimentali.
• Si distinguono come:
• 1. modelli multivariabile (poiché comprendono più fasi
del processo)
• 2. modelli monovariabile (poiché viene valutata una
singola fase del processo)
Camere di Boyden
un esempio di modello multivariabile
• Le camere di Boyden rappresentano un
modello sperimentale multivariabile,
poichè riproduce i seguenti passaggi:
• 1. adesione
• 2. rilascio di metalloproteasi
• 3.invasione
• Tale modello quindi permette di valutare il
potere metastatico nelle tre variabili citate
ADESIONE
Le cellule tumorali
aderiscono al
substrato (Matrigel)
PROTEOLISI
Secrezione di
matalloproteasi
che idrolizzano il
Matrigel
INVASIONE
Superata la
barriera del
Matrigel le cellule
tumorali invadono
il compartimento
sottostante
Modelli monovariabile
• I modelli monovariabile permettono di
discriminare i singoli passaggi del
processo metastatico.
• Si effettuano in vitro utilizzando cellule di
una linea tumorale metastatica e in vivo
utilizzando topi o ratti.
• Con questi modelli è possibile valutare
l’effetto di un farmaco su di una o più fasi
del processo metastatico.
Modelli sperimentali in vitro
• Essi permettono di valutare:
•
•
•
•
proliferazione
adesione
migrazione
Invasione
Modelli sperimentali in vivo
• Permettono di valutare due parametri:
• proliferazione
• Colonizzazione/invasione
Modelli in vitro: Proliferazione
• La proliferazione cellulare è legata a
cinque fasi della vita della cellula:
• Il ciclo di crescita
• Il ciclo cellulare
• La divisione cellulare
• Il differenziamento
• Morte cellulare (Apoptosi e/o Anoikis)
Il ciclo di crescita
• IL CICLO DI CRESCITA CONTROLLA MOLTI
PASSAGGI CHE SONO NECESSARI PER LA
COLTURA DI CELLULE ANIMALI.
•
LA DENSITÀ CELLULARE DI SEMINA
IL TEMPO DI CRESCITA
LA DURATA DI UN ESPERIMENTO
IL MOMENTO ADATTO PER IL PRELIEVO DEI
CAMPIONI
IL METABOLISMO CELLULARE
Il ciclo cellulare
La divisione cellulare
Proliferazione cellulare in presenza di farmaci antineoplastici
% proliferation
100
75
50
*
2.5 mM THEO
0,05 uM PTX
0.05 uM PTX+2.5 THEO
0,5 uM PTX
25
0
24
48
Time (hrs)
72
Il differenziamento
• Nelle linee cellulari utilizzate, il
differenziamento può essere rivelato
osservando alcuni markers specifici.
• Nelle linee di melanoma l’aumentata
produzione di melanina è segno di
differenziamento
µg melanin/mg protein
40
Linea cellulare B16-F10
30
20
10
0
Control
AE 48h
AE 72h
Morte cellulare (Apoptosi)
• il termine apoptosi indica una forma di
morte cellulare programmata.
• Si tratta di un processo ben distinto
rispetto alla necrosi cellulare, e in
condizioni normali contribuisce al
mantenimento del numero di cellule di un
sistema.
Una cellula in apoptosi. In
uno dei molti scenari
apoptotici, il processo è
stimolato da una cellula
adiacente; la cellula morente
espone in seguito segnali
che richiamano dei
macrofagi
Percentuale di cellule in apoptosi misurata con il citofluorimetro
(evidenzia il numero di cellule in una certa fase del ciclo cellulare)
Cellule apoptotiche
Cellule in apoptosi
Cellule in apoptosi
Morte cellulare (Anoikis)
• Anoikis rappresenta l’apoptosi indotta da
uno scorretto attacco delle cellule alla
matrice extracellulare (ECM).
• E’ il meccanismo attraverso il quale le
cellule in vivo utilizzano segnali che
derivano dal ECM per mantenere
l’integrità dei tessuti.
•
Leggere: Gilmore A.P. Cell Death and Differentiation (2005)12,1473
Modelli in vitro:adesione
• Il primo passo per lo stravaso delle cellule tumorali è
l’adesione alle cellule endoteliali, mediato da molecole di
adesione cellulare (cell adhesion molecules – CAMs),
che comprendono la famiglia I-CAM ed N-CAM
(integrine), lectine di superficie cellulare e glicoproteine
che si legano alle lectine espresse dalle cellule.
• Un ruolo fondamentale in questa fase del processo
metastatico è svolto dalle piastrine e dalle selettine E e P
degli endoteliociti.
• le cellule neoplastiche, per potere ancorarsi stabilmente
agli endoteliociti, devono essere fornite di ligandi per le
selettine E e P e devono possedere proprie selettine che
riconoscano ligandi consensuali espressi dagli
endoteliociti.
Adesione cellulare
•
Le molecole responsabili dell’adesione cellulare (CAM = Cell Adhesion Molecules) sono un
particolare tipo di recettori glicoproteici che prende parte attiva nella costituzione delle strutture
adesive della superficie cellulare.
•
Ci sono diverse famiglie di CAM; tutte sono costituite da glicoproteine integrali che si estendono
nella membrana plasmatica, con domini che protrudono da entrambi i versanti della membrana
stessa. Le CAM che si legano possono essere dello stesso tipo (legame omotipico) o di tipi diversi
(legame eterotipico).
•
Una delle principali famiglie CAM, le Ig-CAM, è composta da molecole con domini di superficie
correlati agli anticorpi. Tra più delle 30 Ig-CAM esistenti si annoverano le C-CAM, trovate sulla
superficie delle cellule epatiche, le N-CAM, le molecole di adesione neuronale, e le Ng-CAM, le
molecole di adesione neuro-gliali. La I-CAM, invece, si trova su svariati tipi cellulari, tra cui i
leucociti. Tutte le Ig-CAM possono instaurare legami omo- ed eterotipici.
•
Un’altra famiglia di CAM, le caderine, possono instaurare solo legami omotipici. Tutti i membri di
questa famiglia sono Ca++-dipendenti Tra i membri di questa famiglia ci sono le L-CAM, trovate
su cellule epatiche e altri tipi cellulari, e le P-caderine, trovate sulle cellule della placenta e su
quelle epiteliali.
La famiglia LEC-CAM si trova sui leucociti e su altre cellule del sistema circolatorio.
•
Adesione e sedi vascolari
• La selettività per specifiche sedi vascolari è
legata ai meccanismi di adesione alle pareti
vasali.
• Ma anche al tipo di enzimi degradativi prodotti
dalla cellula neoplastica e di enzimi inibitori
presenti nel tessuto invaso
• Contribuiscono anche fattori chemiotattici e
aptotattici che guidano l’insediamento della
singola cellula nei siti ottimali per la
proliferazione, ai fattori di crescita autocrini e
paracrini e alla possibilità di iniziare e mantenere
il processo angiogenico.
Test di adesione cellulare in vitro
Si utilizzano piastre da 96 pozzetti il cui fondo è rivestito
con collagene, laminina o fibronectina.
Le cellule da saggiare vengono piastrate nei pozzetti e
incubate per 2 ore a 37 C°.
Dopo aver rimosso il mezzo di coltura si aggiunge un
colorante vitale e quindi incubate per altri 10 minuti a
temperatura ambiente.
PROTOCOLLO
• I pozzetti vengono quindi lavati tre volte con un tampone
isoosmotico.
Infine i pozzetti sono lavati con acqua distillata e le
piastre lette con un lettore automatico alla lunghezza
d’onda del colorante aggiunto.
In tal modo sono valutate le cellule adese al fondo dei
pozzetti
N° adherent cells
60000
40000
20000
0
Control
48h
Adhesion
(Matrigel adhesion assay)
72h
Modelli in vitro:migrazione
•
•
•
Il monostrato cellulare quando danneggiato, risponde alla distruzione del
contatto cellula-cellula e alla produzione di fattori di crescita nel punto
danneggiato, cercando di rimarginare la ferita per mezzo sia della
proliferazione che della migrazione.
Questi processi riflettono il compartamento di ogni singola cellula, ma anche
quello di tutta la popolazione cellulare.
•
Il tipico “Wound Healing assay”, (WHM) si ottiene graffiando la superfice di
una coltura cellulare ala confluenza, usando l’ago di una siringa o la punta
di una pipetta.
•
Il monostrato cellulare cerca di sanare la ferita in tempi relativamente brevi
(da 3 a 48 ore).
•
Il processo può essere quantificato con l’analisi di immagine computerizzata
sotto osservazione al MO
CONTROLLO
TEMPO 0
Migration
(Wound Healing Migration Assay)
48 ORE
Migration
(Wound Healing Migration Assay)
% migration
100
75
*
50
25
0
C ontrol
AE
circular wound-healing (CWA)
• Una variazione del “Wound Healing
Migration Assay” è il CWA.
• In questo caso si utilizza una punta di
silicone ruotante per creare una ferita
circolare uniforme, in un momolayer di
cellule alla confluenza.
circular wound-healing (CWA)
Modelli in vitro: invasione
L’invasione di cellule tumorali può essere valutata con il “3D
invasion/morphogenic assay” oppure con il “Circular invasion
assay”.
Nel 3D invasion/morphogenic assay le cellule sono immerse
in una matrice gelatinosa che mima la matrice extracellulare.
Il modello si definisce tridimensionale poiche le cellule
possono migrare nelle tre dimensioni dello spazio.
Al fine di valutare la capacità invasiva vengono contate le
estroflessioni cellulari dopo un certo periodo di tempo
Control
48h
72h
(3D invasion/morphogenic assay)
N° of processes / cell
6
5
4
3
2
1
0
Control
AE 48h
AE 72h
(3D invasion/morphogenic assay)
Circular invasion assay (CIA)
• Il “circular invasion assay” (CIA) si è
sviluppato recentemente (2007) per
sostituire il classico in vitro “wound-healing
assays” e altre tecniche per lo studio della
migrazione e invasione nelle metastasi.
Circular invasion assay
• Anche in questo caso si utilizza una punta ruotante di
silicone che crea una ferita perfettamente circolare nel
monolayer cellulare.
• A differenza del CWA la tecnica CIA utilizza il Matrigel
che viene steso sopra la coltura cellulare, mimando la
matrice extracellulare.
• Il modello si avvicina molto a quello che accade in vivo
l’aggiunta di Matrigel permette di valutare la reale
invasione.
• A differenza del CWA che permette di valutare
solamente la migrazione.
• Comparando le dimensioni della ferita nel tempo si può
quantificare l’invasione di cellule tumorali
t=0
AE
Control
Circular invasion assay
12h
% wound closure
30
24h
20
*
10
0
Control
AE