Anno Accademico 2010/2011
Laurea Magistrale in
CHIMICA
Analisi degli alimenti
(LMC-6: PACKAGING)
Giorgio Bonaga
ANALISI DEI CONTAMINANTI
DA PACKAGING
Bisfenolo A (BPA)
Bisphenol A (BPA) is 2,2-bis(4-hydroxyphenyl)propane.
H3C CH3
HO
OH
Sintetizzato per la prima volta dal chimico russo A.P. Dianin nel 1891,
attualmente viene preparato per condensazione dell’acetone (da cui deriva
la lettera A) con due equivalenti di fenolo. La reazione è catalizzata da una
acido o da una resina di poliestere sulfonato.
USI DEL BPA
precursore
di ritardatori
di fiamma
polisteri
BPA
policarbonati
inibitore
polimerizzazione
PVC
polisulfonati
chetoni
polieteri
BADGE
BADGE is an acronym for Bisphenol A diglycidyl ether
H3C CH3
O
O
O
O
BADGE
BADGE E DERIVATI REGOLAMENTATI
H3C CH3
O
O
H3C CH3
O
BADGE
O
O
O
O
OH
H3C CH3
O
Cl
O
O
OH
BADGE.H2O
O
OH
Cl
OH
H3C CH3
O
BADGE.2H2O
O
BADGE.2HCl
H3C CH3
HO
Cl
OH
BADGE. HCl
H3C CH3
HO
O
OH
OH
Cl
O
O
OH
OH
OH
BADGE.HCl.H2O
RESINE EPOSSIDICHE
resina
pigmenti
solventi
resina
epossidica
agenti di
cross-linking
O
Struttura di resina epossidica:
H2C
CH2
CH2
Sintesi di resina epossidica:
HO
CH3
C
CH3
bisphenol A
OH
+
O
H2C CH2 CH2 Cl
epichlorhydrine
NaOH
O
H2C CH
CH2 O
CH3
C
CH3
O CH2 CH CH2 O
OH
n
CH3
C
CH3
O
O CH2 CH CH2
EPOXY EQUIVALENT WEIGHT (EEW) = quantità di resina
espressa in grammi che contiene un grammo-equivalente di
gruppo epossidico. L’equivalente epossidico determina anche
lo stato fisico e la reattività della resina.
EEW  300
resine liquide la cui reattività dipende dall’elevata
concentrazione di gruppi epossidici.
EEW > 300
resine solide la cui reattività è anche legata alla presenza
di ossidrili secondari, la cui rilevanza aumenta con
l’incremento del peso molecolare.
VANTAGGI E SVANTAGGI DELLE RESINE
EPOSSIDICHE
VANTAGGI:
 i film hanno una notevole resistenza verso i principali agenti chimici;
 eccellente resistenza all’abrasione e all’urto;
 eccezionale adesione a superfici di diversa natura;
 termostabilità nell’intervallo da -70°C a +100°C;
 quelle a basso peso molecolare non richiedono solventi per la loro sintesi.
SVANTAGGI:
 i film sono abbastanza costosi;
 possono ingiallire ed opacizzare in presenza di radiazioni UV e a
contatto con l’ossigeno atmosferico;
 in condizioni spinte possono diventare fragili e il film si polverizza.
RESINE EPOSSI-FENOLICHE
Sono sintetizzate a partire da resine epossidiche e resine fenoliche. Le resine
fenoliche sono polimeri generalmente termoindurenti, ottenuti dalla reazione
del fenolo con la formaldeide. La reazione è una sostituzione elettrofila nella
quale tre molecole di formaldeide sostituiscono gli atomi di idrogeno nelle
posizioni orto e para del fenolo. Il 2,2,4-tris(idrossimetil)fenolo che, a sua volta,
reagisce con altre molecole di fenolo con eliminazione di una molecola di
acqua in ciascuna reazione. Il risultato netto è la condensazione di molecole di
fenolo attraverso gruppi metilenici in posizione orto e para.
OH
OH
OH
OH
*
*
*
O
+ 3 H
C
HO
OH
*
*
HO
*
*
H
OH
OH
*
*
OH
RESINE EPOSSI-FENOLICHE
resine
epossidiche
catalizzatori
pigmenti
resine
epossi-fenoliche
resine
fenoliche
La parte fenolica della resina conferisce le proprietà di resistenza verso
acidi e solventi, mentre la pesina epossidica conferisce flessibilità, adesione
e durezza. Per queste ragioni le resine epossi-fenoliche sono usate come
rivestimento interno di cisterne, contenitori metallici e silos industriali.
VALUTAZIONE DELL’ESPOSIZIONE AL BPA
 Presso la comunità scientifica le conseguenze dell’esposizione al BPA
sono controverse:
• sulla base delle conoscenze tossicocinetiche del BPA nel sangue umano
(rapida biotrasformazione e velocissima escrezione) le modeste
concentrazioni di BPA nel sangue umano non sono ritenute
significative per la valutazione del rischio tossicologico
• a causa della rapida e completa escrezione di BPA somministrato per
via orale, l’urina è il fluido biologico più idoneo a valutare l’esposizione
al BPA.
 Gli studi sulla tossicità del BPA risalgono circa all’anno 2000, ad
eccezione di alcune ricerche sull’estrogenicità del BPA che risalgono agli
anni ‘30.
• il BPA non è genotossico, non è carcerogeno e studi ripetuti sulla dose
tossica, che includono test di tossicità sulla riproduzione e crescita con
un ampio intervallo di dosi, mostrano che gli effetti nocivi si
manifestano soltanto ad una dose > 50 mg/Kg peso corporeo/giorno.
RESINE PER RIVESTIMENTI INTERNI
DI BARATTOLI, SCATOLE, TUBI
Le resine epossidiche e epossi-fenoliche sono utilizzate come rivestimento
interno di contenitori per alimenti.
 SCATOLE CON RIVESTIMENTO INTERNO SMALTATO BIANCO
Resine epossidiche + TiO2
prodotti ittici (in acqua)
pomodori
mais
 SCATOLE CON RIVESTIMENTO INTERNO TRASPARENTE
Resine epossi-fenoliche
prodotti ittici (in olio)
ortaggi verdi
sciroppi di frutta
cibi per animali
RESINE EPOSSI-FENOLICHE
Novolacche
Con un rapporto aldeide: fenolo < 1 ed una catalisi acida si ottengono le
novolacche, polimeri termoplastici perché costituiti da lunghe molecole lineari.
OH
H2C
OH
CH2
OH
CH2
OH
CH2
CH2
Resoli
Con un rapporto aldeide:fenolo > 1 ed una catalisi basica si ottengono i resoli,
polimeri termoindurenti dalla struttura reticolare assimilabile a quella di una
novolacca in cui residui di aldeide fanno da ponte tra due catene lineari.
OH
H2C
OH
CH2
OH
CH2
CH2
H 2C
OH
OH
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
OH
CH2
OH
OH
 Gli studi relativi agli effetti di BPA a basso dosaggio non sono
considerati sufficientemente convincenti per valutare il rischio
dell’esposizione al BPA (EFSA, 2006).
 La dose giornaliera tollerabile (tolerable daily intake = TDI) del BPA, basata
sulla dose senza effetti nocivi osservati (no-observed-adverse-effect-level =
NOAEL) divisa per un fattore di sicurezza (di incertezza) pari a 100, è stata
posta a 0.05 mg/Kg p.c./giorno dall’AFC panel dell’EFSA (2006).
 La United States Environmental Protection Agency (US EPA) ha
calcolato per il BPA una dose di riferimento (reference dose = RfD) pari a 0.05
mg/Kg p.c./giorno, basata sulla riduzione di peso corporeo osservato in
ratti alimentati con dosi di 50 mg/Kg p.c./giorno per 103 settimane,
applicando un fattore di incertezza pari a 1000 alla dose con il minimo effetto
osservato (lowest-observed-effect-level = LOAEL).
 I. A. Lang et al. (*) hanno condotto il primo studio incrociato sugli
effetti sulla salute umana dell’esposizione al BPA. Certi livelli di BPA
Sono significativamente correlati a disturbi cardiovascolari, diabete e
all’aumento anomalo del livello di alcuni enzimi epatici.
(*) I. A. Lang et al.: J. Am. Med. Assoc., 300 (11), 1303-1310 (2008).
EUROPA - BPA
 FRANCIA
Ottobre 2008: l’Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments
(AFSSA) afferma che i contenitori di policarbonato usati nel packaging
degli alimenti per l’infanzia non superano i livelli stabiliti dall’EFSA anche
quando vengono scaldati in forno a microonde per meno di 10 minuti.
Marzo 2009: il Ministro francese della Sanità, Roselyne Bachelot-Narquin,
in disaccordo con le conclusioni dell’AFSSA dichiara che “la decisone delle
autorità Canadesi di vietare l’uso del BPA nella produzione delle babies
bottles non è dovuta all’opinione pubblica, ma ai risultati di indagini
scientifcamente attendibili”.
 GERMANIA
Settembre 2008: il Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR), cioè l’ Istituto
Federale Tedesco per la valutazione del rischio, afferma che in
considerazione delle ricerche di Lang, non ci sono ragioni significative per
modificare la valutazione del rischio dell’esposizione al BPA.
 PAESI BASSI
Novembre 2008: la Dutch Food and Consumer Product Safety Authority
(VWA) afferma che le babies bottles di policarbonato non cedono livelli
misurabili di BPA e, pertanyo, vanno considerate sicure.
 SVIZZERA
Febbraio 2009: sulla base dei risultati di agenzie sanitarie pubbliche, il Swiss
Federal Office for the Public Health afferma che l’assunzione di BPA
attraverso gli alimenti e le bevande non rappresenta un rischio per i
consumatori, compresi i neonati e i bambini. Nonostante ciò l’ufficio
federale suggerisce un uso corretto delle babise bottles di policarbonato e
fornisce un elenco di soluzioni alternative.
 ITALIA
Novembre 2008: vengono considerati sicuri i livelli di BPA riportati da Lang
e pertanto non vengono modificati i limiti della resina negli alimenti.
EFSA - BPA
(European Food Safety Authority)
 Novembre 2006:
TDI (BPA) = 0.05 mg/Kg p.c./giorno
 Luglio 2008:
per gli adulti e i neonati l’esposizione al BPA ≤
alla TDI
 Ottobre 2008:
il parere dell’EFSA sulle ricerche di I. A. Lang
stabilisce la mancanza di evidenze sulla
relazione tra BPA e le patologie prese in
considerazione. Di conseguenza l’EFSA non
modifica la TDI
EFSA – BADGE
( E DERIVATI REGOLAMENTATI)
Luglio 2004:
 TDI(BADGE): 0.15 mg/Kg p.c./giorno
 BADGE
e cloridrin-derivati (BADGE.2HCl, BADGE.HCl e
BADGE.H2O.HCl) non sono considerati pericolosi rispetto la
cancerogenicità e la genotossicità in vivo. Viene confermato il limite di
1.0 mg/Kg alimento.
MIGRAZIONE - NORMATIVA
Direttiva CE 82/711
• SML(s) = Limite di Migrazione Specifica (singolo)
Limite di migrazione specifica negli alimenti o nei liquidi simulanti, se
non diversamente specificato.
• SML(T) = Limite di Migrazione Specifica (Totale)
Limite di migrazione specifica negli alimenti o nei liquidi simulanti,
espresso come totale del gruppo di sostanze indicate.
MIGRAZIONE - NORMATIVA
TIPO DI PRODOTTO
SIMULANTE
ABBREVIAZIONE
alimenti acquosi
(con pH > 4.5)
acqua distillata o acqua
di qualità equivalente
Simulante A
alimenti acidi
(con pH  4.5)
soluzione di acido acetico
al 3% (p/v)
Simulante B
prodotti alcolici
soluzione di etanolo
al 10% (v/v)
Simulante C
alimenti a base di olio
olio di oliva rettificato o
altri simulanti oleosi
Simulante D
alimenti secchi
no
no
MIGRAZIONE - NORMATIVA
CONDIZIONI DI CONTATTO NEI CASI
PIU’ CRITICI
DURATA DEL CONTATTO
t  5 min
5 min < t  0.5 h
0.5 h < t  1 h
1h<t2h
2h<t4h
4 h < t  24 h
t > 24 h
TEMPERATURA DI CONTATTO(°C)
T5
5 < T  20
20 < T  40
40 < T  70
70 < T  100
100 < T  121
121 < T  130
130 < T  150
T > 150
CONDIZIONI TEST
TEMPO
VEDERE CONDIZIONI
CRITICHE
0.5 h
1h
2h
4h
24 h
10 days
TEMPERATUTA (°C)
5
20
40
70
o temperatura di reflusso
(*)
(*)
(*)
(*)
(*) questa temperatura è usata solo con il simulante D. Per i simulanti A, B e C
il test può essere sostituito con una prova condotta a 100°C o a temperatura di
reflusso, per un periodo di tempo che è quattro volte maggiore di quello
stabilito dalle norme generali.
MIGRAZIONE- LIMITI NORMATIVI
BPA
Direttiva 2004/19/EC del 01/03/2004
 SML(T) = 0.6 mg/Kg
BADGE
Regolamento (CE) N. 1895/2005 del 18/11/2005
 SML(T) del BADGE e dei suoi derivati regolamentati:
la somma BADGE + BADGE.H2O + BADGE.2H2O non può
superare:
9 mg/Kg nei simulanti o nell’alimento
9 mg/6 dm2
la somma BADGE.HCl + BADGE.2HCl + BADGE.HCl.H2O non
può superare:
1 mg/Kg nei simulanti o nell’alimento
1 mg/6 dm2
SCHEMA ANALITICO
SML(s) di BPA, BADGE &
derivati regolamentati,
secondo quanto descritto
nella Direttiva CE 82/711 e
successive modificazioni,
sulle scatole nuove
Simulante D
Simulanti A & B
ESTRAZIONE
LC-MS/MS
CONFRONTO
MATRICI ALIMENTARI vs SIMULANTI
ALIMENTI
RISULTATI
ESTRAZIONE
 È stata utilizzata soltanto per gli alimenti e il simulante D.
 Per l’estrazione del BPA, BADGE and i suoi derivati regolamentati
l’estrazione solida-liquida-liquida seguita da clean-up con SPE è stata
sostituita con il metodo QuEChERS
 Il metodo QuEChERS è stato realizzato con DisQue Dispersive Sample
Preparation Kit, contenente DisQue di estrazione (tubo 1) and DisQue di
clean-up (tubo 2).
LC-MS/MS
 API 3200 (Applied Biosystems) triplo quadrupolo MS equipaggiato con
Turbo V Ionspray. Agilent (1200 Series), utilizzando una pompa binaria
per HPLC
 Colonna HPLC: Phenomenex® Luna 3 m C18 (2) 100 Å, 150 x 3.00 mm,
con precolonna Security-Guard
 Mass Spectrometry: Multiple Reaction Monitoring (MRM)
BPA
Sorgente:
Fase mobile:
Velocità flusso
ESI (ioni negativi)
Solvente A = 10 mM acetato d’ammonio in ACN
Solvente B = 10 mM ammonio acettao in H2O
0,5 ml/min
Tempo totale
(min)
Flusso
(ml/min)
A
(%)
B
(%)
0
3
4
5
8
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
70
70
90
70
70
30
30
10
30
30
BPA
BPA
CHROMATOGRAMMA DI BPA STANDARD (500 ppb)
BADGE AND ITS REGULATED DERIVATIVES
Sorgente:
ESI (ioni positivi)
Fase mobile:
Solvent A = 0.5% acido formico in ACN
Solvent B = 0.5% acido formico in H2O
0,5 ml/min
Velocità flusso:
Tempo totale
(min)
0,0
5,5
9,0
10,0
10,1
2,.0
Flusso
(ml/min)
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
A
(%)
50
50
95
95
50
50
B
(%)
50
50
5
5
50
50
BADGE.HCl
BADGE.2HCl + BADGE.H2O.HCl
BADGE.2H2O
BADGE
BADGE.H2O
CROMATOGRAMA DEI BADGEs (500 ppb)
RISULTATI - RECUPERI
COMPOUND
LOD LOQ
(ppb) (ppb)
R E C O V E R I E S
%
Tuna in
water
Tuna in
olive oil
Peaches in
Tomatoes Green Beans
White Beans
syrup
Anchovy
fillets in
olive oil
BPA
8
16
55.8 ± 5.8
70.0 ± 8.5
74.3 ± 5.1
78.1 ± 5.3
92.0 ± 2.0
54.7 ± 3.4
68.9 ± 1.4
BADGE.2H2O
4
8
121.0 ± 6.6
85.7 ± 11.5
87.5 ± 9.7
63.4 ± 11.3
82.0 ± 7.1
72.4 ± 3.7
67.0 ± 1.5
BADGE.HCl.H2O
16
32
107.9 ± 13.7
107.0 ± 2.5
88.8 ± 6.3
82.2 ± 5.1
95.0 ± 15.1
91.3 ± 5.4
90.3 ± 1.8
BADGE.2HCl
32
64
102.2 ± 8.5
64.0 ± 4.3
104.5 ± 9.7
73.0 ± 9.0
81.0 ± 4.4
87.2 ± 5.5
144.2 ± 4.4
BADGE.H2O
4
8
91.0 ± 5.0
102.0 ± 2.6
86. 7± 6.3
97.6 ± 9.4
90.3 ± 9.6
85.2 ± 6.9
102.0 ± 10.1
BADGE.HCl
16
32
88.7 ± 7.8
60.4 ± 8.6
103.0 ± 4.6
92.9 ± 3.6
105.0 ± 4.2
86.1 ± 5.5
87.0 ± 3.2
BADGE
4
8
120.0 ± 4.3
72.0 ± 4.3
114.0 ± 1.7
102.7 ± 3.4
110.7 ± 9.0
92.5 ± 3.3
101.0 ± 0.3
COMPOUND
RECOVERIES - SIMULANT D
%
BPA
62.0 ± 1.8
BADGE.2H2O
82.1 ± 2.4
BADGE.HCl.H2O
99.8 ± 1.6
BADGE.2HCl
67.7 ± 4.9
BADGE.H2O
118.0 ± 2.5
BADGE.HCl
80.0 ± 3.7
123.0 ± 2.7
BADGE
FOOD vs SIMULANT A
BADGE + BADGE.H2O + BADGE.2H2O
BADGE.HCl + BADGE.2HCl + BADGE.HCl.H2O
BPA
FOOD vs SIMULANT B
BADGE + BADGE.H2O + BADGE.2H2O
BADGE.HCl + BADGE.2HCl + BADGE.HCl.H2O
BPA
FOOD vs SIMULANT D
BADGE + BADGE.H2O + BADGE.2H2O
BADGE.HCl + BADGE.2HCl + BADGE.HCl.H2O
BPA
HPLC - FLD
• Estrazione con ACN (24 h, T ambiente) di scatole nuove rivestite
•
•
•
•
•
con resine epossidiche epossi-fenoliche;
Analisi degli estratti in ACN e dgli estratti mediante QuEChERS di
matrici alimentari;
Colonna HPLC: Waters® X Terra, RP18 5 m, 150mm x 4,6 mm
Fase mobile: ACN:H2O (50:50, v/v)
Velocità flusso: 0,5 ml/min
Diluizione del campione: 1:2 con H2O
• Volume iniettato: 20 µL
• exc = 275 nm, em = 325 nm
BADGE
BPA
BADGE. H2O
BADGE.2H2O
BADGE 2H2O
ESTRATTO DI RESINE EPOSSIDICHE
?
RISULTATI
CONCLUSIONI
 I risultati relativi agli alimenti sono differenti da quelli
relativi ai simulanti, con una discordanza significativa in
più del 60% dei casi;
 Il trend di migrazione del BPA è differente da quello dei
BADGEs;
 Il BADGE scompare negli alimenti in relazione alla durata
delle sue interazioni con la matrice alimentare;
 I test di conformità con i simulanti non sembrano essere in
grado di valutare la migrazione reale;
 È necessario realizzare le analisi della migrazione dalle
resine sia con i simulanti che con gli alimenti reali.