workshop ERSAF, 28 maggio, 2008
I microrganismi nella digestione anaerobica:
casi di studio
Dr.ssa Aurora Rizzi
Dipartimento di Scienze e Tecnologie Alimentari e Microbiologiche (DISTAM),
Università di Milano
Olive Mill Wastewater
Southern Europe Countries world major producers of olive oil
and hence major producers of OMW
OMW characteristsics
Very high COD (up to 200 g l-1)
High content of polyphenols (up to 6 g l-1)
Relatively low pH (4-5)
OMW anaerobic digestion
CH4 production
Spontaneous separation of CH4
Low sludge production
[Bertin et al. 2004 FEMS Microbiol. Ecol. 48:413-423]
Polyphenols can strongly decrease the process efficiency being toxic for
methanogenic Archaea, a key component of the reactor microflora
[Field & Lettinga 1987 Water Res. 21:367-371]
How methanogen community respond to increasing OMW organic loads?
Anaerobic Digester for OMW Treatment
Anaerobic digester (11 L)
Up-flow fixed bed digester (7.5 L)
Contact reactor (3.5 L)
Packing with wood chips
HRT = 48 h
Temperature = 37 °C
Vol. Org. Load = 1-15 g COD l-1d-1
Biogas
GC
Gas
Counter
Contact reactor
Fixed bed filter
OMW
Influent
OMW
Effluent
OMW-Influent
Diluted OMW
Influent pH = 6.1-6.4
N correction with NH4Cl
Influent COD = 5.9-31 g l-1
Process Performances
25
COD removal
100
20
80
15
60
VOL
40
10
CH4
20
5
97
10
5
11
3
12
1
12
9
13
7
14
5
15
3
16
1
16
9
89
81
73
65
49
41
33
25
17
0
9
1
0
57
% di abbattimento del COD
Removal (%)
COD
120
Time (d)
Te m po (d)
Abbattimento del COD
Carico organico
Produzione di metano
g COD/ll-1
d d-1)
COD
(gorganico
VOLCarico
Produzione di metano
COD rem)
CH4 (l/10g
l CH4/10g COD rimosso
TABLE 1. Process parameters of OMW anaerobic digestion at different VOL. For each process phase average values and
SD of the parameters were calculated for a number of samples n reported in brackets.
Parameter
VOL (g COD l-1react d-1)
2.70.47 (28)
5.70.5 (13)
6.60.9 (10) 10.12.4 (11)
15.23.7 (8)
Treatment time (d)
70
28
22
18
34
HRT (d)
2.20.3 (61)
20.1 (26)
20.1 (20)
2.20.3 (18)
20.1 (23)
Influent pH
6.170.12 (50) 6.380.09 (23) 6.40.07 (19) 6.420.14 (16)
6.40.1 (23)
Effluent pH
7.770.21 (43) 7.820.3 (17) 7.80.28 (18) 7.980.35 (14) 7.760.26 (24)
Infl. COD (g l-1)
5.90.8 (30)
11.90.8 (13) 13.21.3 (10) 21.82.7 (11)
31.37.8 (8)
-1
Effl. Sol. COD(g l )
0.960.3 (23)
1.40.4 (11)
1.40.4 (7)
1.610.48 (8)
2.9248 (6)
Sol COD removal (%)
84.15.1 (23)
88.53.6 (11) 88.73.9 (7)
92.41.6 (8)
89.21.9 (6)
-1
Spec. CH4 prod. (l g CODrem) 0.330.08 (22) 0.260.06 (11) 0.270.04 (7) 0.230.06 (8)
0.160.04 (6)
CH4 in the biogas (%)
74.22.5 (29)
71.91.6 (15) 71.61.4 (11) 69.61.8 (13)
69.53.4 (17)
Process Performances
Carico organico, C2 e AGVLtot
25
1600
20
1400
1200
15
1000
VFA
800
600
10
VOL
400
5
C2
200
- VFA: below 800 mg l-1
- Acetic acid (C2): 7080% of VFA
C2
AGVLtot
Carico organico
Low VFA and C2
indicate efficient
acetogenic and
methanogenic phases
175
169
163
157
151
145
139
133
127
121
Tempo (d) (d)
Time
115
109
97
103
91
85
79
73
67
61
55
49
43
37
31
25
19
7
13
0
1
0
Carico organico ( g COD/l d)
1800
VOL (g COD l-1d-1)
-1
VFA and
C2
AGVL
mg/l (mg l )
2000
- At VOL 10 g COD l-1d-1 the effluent COD is 1.6 g l-1
- Since 1g C2 gives 1g COD, more than 50% of effluent COD was due to VFA
- Hence low residual polyphenols
A decrease of specific CH4 production at VOL of 10 g COD l-1d-1
!!
acetone (50 ml)
sample (25 ml)
discarded
flocculated solids
centrifugation
concentration under N2 stream
n-hexane (50ml)
(extraction repeated
4 times)
water solution
acetone
eliminated
discarded
lipid fraction
freeze drying
H2O (1ml)
CH3CN (10 ml)
n-hexane (20 ml)
(extraction repeated 6 times)
sonication
n-hexane
discarded
lipid fraction
polyphenolic extract in CH3CN
concentration under N2 flux, 30 C
MeOH (3ml)
CH3CN
eliminated
methanolic polyphenolic extract
Fig. 1. Scheme of the procedure used for the extraction of polyphenols from olive mill waste waters and
from the plant effluents.
The average recovery of polyphenols on
the basis of addition of known
concentrations of gallic acid was 59%.
The average percent removal of
polyphenols in the ractor was 89.5%
[100% for 2-(p-hydroxy)phenilethanol].
Removal of 2-(p-hydroxy)phenilethanol
was calculated on the basis of the
response factor of the corresponding
standard while the content of the remain
polyphenols was calculated using the
responce factor of caffeic acid.
Methanogenic Archaeal Community
H2
Acetate
10
Log MPN/SSV
g-1 VSS)
(Log MPN
Methanogen counts
12
No apparent changes
in the methanogen
assemblage in the
effluent as shown by
MPN counts and
coenzyme F420
8
6
4
2
0
2.7 5.7 6.6 10.1 15.2
2.7 5.7 6.6 10.1 15.2
29/05/96
23/01/96
25/07/96
26/03/96
26/03/96
29/05/96
25/07/96
VOL (g COD
l-1d-1) COD/l dd; 29/5/96=5g COD/l d; 9/7/96=>15g COD/l d
D/l d; 26/3/96=2,5g COD/l d;
29/5/96=5g COD/l d; 26/3/96=2,5g
9/7/96=>15g COD/l
23/1/96=0,5g
H2-trofi
Acetog.
SO4-rid.
Acetoclasti
Gluc.Ferm.
H2-trofi
SO4-rid.
Gluc.Ferm.
2 0
3 0
1 5
2 5
2 0
1 0
VOL
1 5
5
1 0
161
0
151
141
121
io r n i)
Time( g(d)
T E M P O
111
101
91
81
71
61
51
41
21
11
0
131
F420
5
1
(nmoles g-1 VSS)
F420 Coenzyme
3 5
31
Acetoclasti
2 5
VOL (g COD l-1d-1)
4 0
-5
Analysis of Methanogenic Archaeal Community
Analysis by SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) can
resolve the diversity of bacteria and Archaea by separation of single
strand fragments with different conformations
Preparazione delle singole eliche
A- con la temperatura
single
strands
A
B
C
B- con primer
fosforilati e
digestione con
l-esonucleasi
C- con primer
biotinilati e
cattura
magnetica
l
exon.
biotin
Methanogenic Archaeal Community: Diversity
P
Methanogen-specific primer
798
915
5’ end phosphorilated primer
Archaea-universal primer
SSCP analysis of
16S rRNA gene
- PCR with a P-labelled primer
- l-nuclease digestion of the P-labelled strand
- PCR on a collection of 30 methanogen species
- PCR on biofilm collected at 5.7 and 10 g COD l-1d-1
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
No apparent qualitative differences in the Archaea community pattern. The
methanogen community was apparently dominated by
M.bacterium
H2 consuming
M.sarcina/M.saeta
Acetate consuming
Methanogenic Archaeal Community: Abundance
Quantification of the different phylogenetic groups of methanogens based on
extinction of PCR signals amplified from biofilm sludge DNA
[Wang et al., 1996 Appl. Environ. Microbiol. 62:1242-1247]
PCR sensitivity
(the minimal n° of cells giving
amplification)
PCR
sensitivity
PCR titer
(The maximum sludge DNA
dilutions for positive PCR)
PCR Titer
+++- -
Microscopic cell counts
PCR
Sample
Culture
DNA
extr.
DNA
extr.
Culture dilutions
+++- PCR
Sample dilutions
Methanogenic Archaeal Community: Abundance
Specific PCR for the different phylogenetic groups of methanogens were set
up basing on 16S rRNA gene signatures [Raskin et al., 1994 Appl. Environ. Microbiol. 60:1232-1240]
5’ end bitinilated probe
B
Methanogen-specific primer
Fwd
Species (strains)
300
798
915
800
Archaea-universal primer
1100 1200
Magnetic Capture
hybridization
Specific PCR
Primer sets
PCR sensitivity
Mb Mc Mm Ms1 Ms2
Mb. formicicum 1535, 3637, 3636, 2639, 3722, 6299; Mb. ulginosum +
104
2956; Mb. ivanovii 2611; Mb. bryantii 863; Mb. palustre 3108; Mb.
thermoalcaliphilum 3267; Mb. thermoautotrophicum 1053, 3720;
Mb. thermoaggregans 3266; Mb. wolfei 2970; Mb. thermophilum
6529; Mbrev. arboriphilicus 1125; Msph. stadtmanae 3091
Mc. maripaludis 2067; Mc. voltae 1537; Mc. vannieli 1224
+
103
Mg. cariaci 1497; Mcull. marisnigri 1498; Mspirillum hungatei 864; +
102
Mcorp. parvum 3823; Mcorp. sinense 4274; Mp. limicola 2279
Msar. barkeri 800; Msar. mazei 2053; Msar. vacuolata 1232; Msar. +
102
acetivorans 2834
Mtrix thermophila 6194; Msaeta concilii 3671
+
+
104
Methanogenic Archaeal Community: Abundance
PCR TITER IN THE BIOFILM
VOL = 5.7
VOL = 10.1
-1
-1
(5.7 g COD l d )
(g COD l-1d-1)
H2
consuming
1011
104
n.d.
108
106
n.d.
M.sarcina/M.saeta
108
109
12
(Log MPN g-1 VSS)
Methanogen counts
Acetate
consuming
M.bacteriaceae
M.microbiaceae
M.coccaceae
10
8
6
4
2
0
Following VOL increase methanogen
community responded by changing the
relative abundance of different
phylogenetic/physiological groups
Conclusions
In the adopted reactor OMW were efficiently treated (COD
removal around 90%) up to VOL of 15 g COD l-1 d-1
A decrease of CH4 specific production occurred at VOL of 10 g
COD l-1 d-1
The overall diversity of methanogen was not affected as
shown by SSCP and sequencing
Methanogen community reacted by re-balancing the
H2trophic/acetotrophic methanogen ratio
TRATTAMENTO DEGLI EFFLUENTI DI CANTINA VINICOLA
Gli scarti delle cantine vinicole sono costituiti dalle acque di lavaggio degli impianti di
vinificazione e contengono parti dei raspi e le bucce degli acini
I reflui di cantina contengono concentrazioni residue di zuccheri e acido tartarico
(dall’uva), etanolo, acido acetico e acido lattico (residui delle fermentazioni)
I reflui che derivano dalla vinificazione del vino rosso contengono anche
considerevoli quantità di composti fenolici (antociani e tannini) che possono avere
effetto tossico sui microrganismi coinvolti nella degradazione anaerobica, in
particolare i metanogeni.
Trattamento dei reflui di cantina:
• trattamento aerobico elevato consumo di energia richiesto dall’aerazione, e
necessità di aggiungere nutrienti
• digestione anaerobica abbattimento del carico organico, con recupero di energia
(produzione di metano)
TRATTAMENTO DEGLI EFFLUENTI DI CANTINA VINICOLA
Un processo di digestione anaerobica degli effluenti di cantina vinicola è stato
messo a punto in un impianto in scala di laboratorio
IMPIANTO:
digestore cilindrico, h= 130 cm, riempito con materiale inerte di riempimento
(truciolato di legno) come matrice di supporto. Caricamento in fase ascendente.
Il digestore conteneva una microflora selezionata nei trattamenti dei precedenti
anni (depurazione degli effluenti di pirolisi, dell’acqua di vegetazione delle olive,
degli impasti di cartiera)
TRATTAMENTO:
le acque di cantina erano diluite fino ad avere un carico organico di COD=7-7,5
g/l, ed addizionate di NaHCO3 e NH4Cl.
Dopo un periodo di adattamento, il reattore ha raggiunto una fase di equilibrio
“steady state” con una rimozione del COD del 90%. Il carico organico è stato
quindi aumentato a 10,5-12,5 gCOD/ld, diminuendo il tempo di ritenzione a 16-17h
TRATTAMENTO DEGLI EFFLUENTI DI CANTINA VINICOLA
La digestione anaerobica delle acque provenienti dalla vinificazione in rosso è risultata meno
efficiente rispetto a quella in bianco:
• minore rimozione di COD
• inferiore produzione di metano
• maggior contenuto di AGV nell’effluente (segnale di un’inibizione dei processi di acetogenesi e
metanogenesi)
• le cariche dei metanogeni presenti nella fase circolante sono inferiori, mentre i batteri eterotrofi e
glucosio-fermentanti sono superiori
TRATTAMENTO DEGLI EFFLUENTI DI CANTINA VINICOLA
Il reattore è in grado di recuperare rapidamente (circa 10 giorni) shocks da carico organico pari ad
un aumento improvviso di tre volte del carico organico specifico volumetrico
METANOGENESI A BASSA TEMPERATURA
Start-up and operation of an anaerobic high-rate staged expanded granular sludge
bed (EGSB) system for the treatment of cold (3 to 8°C), dilute wastewater (0.5 to
0.9 g of COD liter-1), containing 12 mg of O2 liter-1
METANOGENESI A BASSA TEMPERATURA
POTENZIALITA’ DELLA PRODUZIONE DI METANO
- Trattamento termofilo reflui acidificati
- Reattori UASB multipli
- Carico organico fino a 100 kg COD m-3 day-1
POTENZIALITA’ DELLA PRODUZIONE DI METANO
- Rimozione del COD > 90%
- Tempo di ritenzione idraulico = 2-2.5 h
- Produzione di biogas 40-50 m3 m-3reattore day-1
Grazie per l’attenzione !