Transizioni cooperative - sono caratterizzate dal fatto che già
prima della transizione di fase sono presenti domini della nuova
fase, che facilitano il processo di transizione.
Stato disordinato
Transizione ordine-disordine
Stato ordinato
Transizione I ordine
Ttr
T
gomitolo statistico ⇄ α-elica
Tm = temperatura di transizione (m = melting, fusione)
Frazione di α-elica:
A T = Tm: fh = fc = 0.5

h
fh 
h  c
Transizione del I ordine
L’andamento sigmoidale è tipico di una transizione cooperativa.
La pendenza della curva a T=Tm è una misura della cooperatività
della transizione.
Transizione coil-elica della poli(L-lisina) in funzione del pH
Il pH di transizione (10.1) segue da vicino il pH di deprotonazione
dei gruppi amminici (10.2): NH3+  NH2 + H+
pH<10.2: il gruppo amminico laterale è protonato e la
struttura elicoidale è destabilizzata dalle interazioni repulsive
elettrostatiche tra le catene laterali. Lo stato di 'random coil' è
invece stabilizzato da una solvatazione ottimale delle cariche
elettrostatiche grazie alla maggiore libertà conformazionale del
polipeptide.
pH>10.2: predomina la forma deprotonata del gruppo
amminico e le interazioni di legame idrogeno intramolecolare
rendono più stabile la conformazione ordinata.
Nel caso del poli(L-glutammico):
COO- + H+  COOH
A pH acidi predomina la forma protonata e il polipeptide
assume una struttura secondaria ordinata elicoidale, mentre a
pH>4.5 predomina la forma deprotonata carica negativamente.
Transizione coil-elica del
poli(L-glutammato)
di
sodio in funzione della
percentuale di alcool
isopropilico in miscele
acqua/alcool.
I step: Nucleazione
Formazione del primo legame idrogeno i→i+4
Richiede l’immobilizzazione di 6 angoli torsionali (Ψ=-47°; Φ=-57°)
II step: Propagazione
Formazione di un secondo legame idrogeno adiacente ad uno
già formato.
Richiede l’immobilizzazione di soli 2 angoli torsionali
Entalpia di solvatazione
H trans  H HB  H solv  H dipolo
Formazione di legame idrogeno
Interazione tra dipoli ammidici
H trans [ poli( L  glutammico )]  1kcal  mol 1
T=298K
Formazione di legame idrogeno in N-metil acetammide in diversi
solventi
2D

2D  M 
H HB  5kcal  mol
1
Competizione nella formazione di legame idrogeno:
CCl4 < diossano < H2O
Hsolv = differenza di solvatazione tra il peptide in elica e il
peptide in coil.
Un contributo generalmente sfavorevole alla transizione in
elica (+2-3 kcalmol-1). Il coil è infatti libero di riaggiustarsi
in modo da ottimizzare la solvatazione della sequenza
peptidica (rigonfiamento).
H dipolo  2kcal  mol 1 (testa - coda)
1 2
cos   3 cos 1 cos  2 
V12 
3
40 R12
 0
1   2  
 0
1   2    0
 
1   2 

2
 
1  0; 2  
 0
1   2 


2

2
 1  0 ; 2 

2
V12  0
Per un numero sufficientemente grande di residui (n10) il
contributo attrattivo dovuto all’allineamento testa-coda dei
dipoli predomina sul contributo repulsivo dei residui
adiacenti, con una conseguente stabilizzazione
della
struttura elicoidale ( – 1-2 kcal·mol-1).
L’effetto di questa interazione è quello di favorire lunghi
tratti elicoidali.
La valutazione dei contributi entropici del processo
richiede una descrizione approfondita dei processi di
solvatazione.
Il contributo entropico alla transizione elicacoil è
generalmente favorevole ed aumenta all’aumentare della
temperatura:
G
 - S h c  0


  T  p, h c
Un modello a cooperatività infinita: le catene polipeptidiche
possono esistere o in una configurazione tutta elica o in una
configurazione tutto coil.
fh=0.5 significa che il 50% delle catene è in elica e il 50% in coil.
L’energia libera standard per la conversione di un singolo
residuo da coil ad elica è:
G'  H' TS'
Un processo favorito entalpicamente, ma sfavorito dal punto di
vista entropico.
Nella formazione di un α-elica 4 residui non possono formare
legame idrogeno e i due terminali restano comunque liberi di
ruotare:
La variazione di energia libera dell’intero processo sarà:
G'  ( n  4 )H ' ( n  2 )TS'
Scriviamo il potenziale chimico dei due stati:
 h ( 1,T , f h )   ( 1,T , f h  1 )  RT ln f h
0
h
c ( 1,T , f c )   ( 1,T , f c  1 )  RT ln f c
0
c
fh
trans   h  c    RT ln
1 fh
0
All’equilibrio:
trans  0
 h  c
 fh 

   RT ln 
 1  f h  eq
0
Per T=Tm:
fh=fc= 0.5
K 1
  0
0
( n  4 )H'  ( n  2 )Tm S'
( n  4 )H '
Tm 
( n  2 )S'
Dall’equazione di van’t Hoff:
( n  4 )H '
 d ln K 



2
dT
RT

T Tm
m
Poiché:
 fh 

ln K  ln 
 1  f h  eq
d
 d ln K 
 ln f h  ln 1  f h T Tm 


 dT T Tm dt
1

fh
1
 df h 



 dT T Tm 1  f h
 df h 



 dT T Tm
1
1   df h 
 df h 
 
  4



 dT T Tm  f h 1  f h   dT T Tm
( n  4 )H' ( n  2 ) S'
 df h 




2
4 RTm
4 R( n  4 )H'
 dT T Tm
2
= misura della cooperatività della transizione
2
a) Modello per polipeptidi a basso peso molecolare
Sono possibili solo configurazioni del tipo:
cccccchhhhhhccccc o
hhhhhhhcccccc
Vi può essere cioè una sola regione di nucleazione per catena.
Si trascurano effetti terminali di catena. Nel modello non vengono
considerati i residui terminali, strutturalmente incapaci di dar luogo
alla formazione di legami idrogeno.
Nel modello si identificano due contributi energetici:
I. Entropia di nucleazione: congelamento dei primi 4 angoli
torsionali.
S nucl
II. Propagazione: formazione di un legame idrogeno adiacente
ad un residuo già in elica
…ccchcccc…  ….ccchhcc….
G'  H' TS'
I step: Nucleazione - formazione del primo legame idrogeno in
una sequenza altrimenti in coil
…cccccccc…  ….ccchccc….
Consta di due contributi:
<entropia di nucleazione> + <energia libera di propagazione>
G( I )  Gnucl  G'
Gnucl  TSnucl
Il contributo dominante è quello entropico, il contributo
entalpico può essere trascurato.
Dalla definizione statistica di entropia:
S nucl
Per un’elica perfetta:
 h 
 R ln 
 c 
h  1
Per il gomitolo statistico si assume, applicando l’approssimazione
degli isomeri rotazionali, che vi siano 3 stati popolati per ogni
angolo torsionale (t, g+,g-):
c  3
S nucl
1
 R ln   2.18 cal  mol 1
 3
Moltiplicando per i 4 angoli torsionali bloccati durante il
processo di nucleazione:
S nucl
 h 
1


 4 R ln   8.7 cal  mol
 c 
A 25°C:
Gnucl  TS nucl  2.6kcal  mol
1
 Gnucl 
 S nucl 
2
  exp 
  exp
  10
RT 

 R 
Per:
 1
G nucl  0
Transizione non cooperativa!
A T=300K: =2.5 kcalmol-1   0.001
Quanto minore è σ, tanto più grande è l’energia libera di
nucleazione, tanto più cooperativa è la transizione.
Dalla definizione di :
Snucl = Sh – Sc = RT ln
Sh=0 (wh=1)
Sc = - RT ln 
Tanto minore è il valore di , tanto maggiore sarà l’entropia del
coil statistico, legata al numero di conformazioni accessibili al
sistema, cioè al numero di isomeri rotazionali popolati.
Nella serie glicina (R=H), alanina (R=CH3), leucina (R=CH2CH(CH3)2), il valore di  segue l’aumento dell’ingombro sterico
della catena laterale (0.00001, 0.0008, 0.0033), proprio perché
diminuisce il numero di disposizioni geometriche accessibili ad
ogni angolo torsionale.
   ccchhhhccc   
s
   ccchhhcccc   
Assume il significato di una vera e propria costante di equilibrio
relativa al processo di propagazione delle’elica.
G'  H' TS'
 G' 
s  exp 

 RT 
Gprop = - RT lns
Nel caso dei residui glicina, alanina e leucina (s=0.60,1.06,1.14
rispettivamente) al crescere delle dimensioni della catena
laterale, aumentano le interazioni attrattive di Van der Waals.
Gruppi polari determinano l’instaurarsi di interazioni
dipolari con il backbone peptidico, di cui bisogna valutare
caso per caso l’entità sia rispetto al peptide in conformazione
elicoidale, sia come gomitolo statistico.
Nel
caso
dell’Asparagina
(Asn,
R=-CH2-CONH2),
l’interazione della catena con il dipolo ammidico tende a
destabilizzare l’elica.
Il parametro s è formalmente assimilabile ad una costante di
equilibrio:
d lns H prop

2
dT
RT
Per la formazione del primo legame idrogeno:
G( I )  Gnucl  G'
 Gnucl  G' 
s  exp 

RT


Per la formazione del secondo legame idrogeno:
G( II )  G'
 G' 
s  exp 

 RT 
Per due residui adiacenti impegnati in legame idrogeno:
G  Gnucl  2G'
 Gnucl  2G' 
s  exp 

RT


2
Per tre residui adiacenti impegnati in legame idrogeno:
G  Gnucl  3G'
 Gnucl  3G' 
s  exp 

RT


3
Per m residui adiacenti impegnati in legame idrogeno:
 Gnucl  mG' 
s  exp 

RT


m
Da cui si ottiene per la transizione in cui m residui passano da
coil ad elica:
Gtrans = Gnucl + m Gprop = - RT( ln  + m ln s)
Dalla trattazione statistica dei vari modelli:
h
e
c

E h  Ec 

RT
s
h
s
fh 

1  s  h  c

s
fh 
 n
n
n
1 s
 h  c
n
n = numero dei residui
n
h


 n2

n 1
 s  ns  ( n  2 )s  ( n  2 )s  n 
fh 
3 

( s 1 )



s
n 1
 n 1 



s

n

n

1
s

2


(
s

1
)

 

lim f h  0
s 0
lim f h  1
s 

b) Modello per polipeptidi ad alto peso molecolare
In questo caso bisogna introdurre la possibilità di avere più
centri di nucleazione.
Per j centri di nucleazione e m residui adiacenti impegnati in
legame idrogeno:
 jGnucl  mG' 
 s  exp 

RT


j m
L’equilibrio tra sequenze lunghe e corte è in realtà il bilancio tra
la tendenza a minimizzare l’energia e quella simultanea a
massimizzare l’entropia.
Per catene molto lunghe la tendenza, entalpicamente favorita, di
formare lunghe sequenze ordinate è controbilanciata dalla perdita
di entropia complessiva.
Come risultato nella catena vi saranno piu centri di nucleazione
con sequenze di eliche relativamente lunghe separate da regioni
in coil (per esempio -turns in un filamento polipeptidico di una
proteina globulare).
Il risultato per 0.8 < s < 1.2 è:
1
fh  
2
Per s=1:
1
fh 
2
Per s<1:
1
fh 
2

s 1
2 1  s   4s
Per s>1:
2

1
2
1
fh 
2
per =110-4 s=0.8: fh=0.002
s=1.2: fh=0.997
per =110-2 s=0.8: fh=0.127
s=1.2: fh=0.837
Per =1 (Gnucl=0):
1
s -1
1
s -1
1
s -1
s
fh  
 
 [1
]
2
1/2
2
1/2
2 2[(1 - s)  4 s]
2 2[(1  s) ]
2
1s s 1
Da cui si ottiene:
fh
fh
s
 K
1 - fh fc
In questo caso si ha completa assenza di cooperatività, tutti i
residui si comportano in maniera indipendente e s coincide con
la costante di equilibrio della transizione.
La cooperatività della transizione dipende da σ (più piccolo è σ,
maggiore è l’energia libera di nucleazione, maggiore la
cooperatività della transizione).
Infatti:


df
d
s

1
 h

 


 ds T Tm ds  2 1  s 2  4s 

1
2 1  s   4s
2


s 1
2 1  s   4s
2

3
2
A T=Tm, fh=0.5, s=1:
1
 df h 



 ds T Tm ,s 1 4 
Per σ→0:
 df h 



 ds T Tm ,s 1
Per σ→1:
1
 df h 



4
 ds T Tm ,s 1
G nucl  0
Transizione coil-elica per diversi valori di σ
Ammino
acido
Gruppo
laterale

Snucl(u.e.)
s
G(kcalmol-1)
Glicina
-H
0.0000
1
-23.0
0.60
0.30
Alanina
-CH3
0.0008
-14.3
1.06
-0.03
Leucina
-CH2CH(CH3)2
0.0033
-11.4
1.14
-0.08
Serina
-CH2-OH
0.0001
-18.3
0.76
0.16
Glutammi
co
-CH2-CH2COOH
0.0100
-9.1
1.32
-0.17
σ=2·10-4
n=1500
n=46
n=26
Poli(γ-benzil-L-glutammato) in dicloroacetico/dicloroetilene
(80/20, v/v)
• la cooperatività della transizione aumenta con n;
• la formazione dell’elica è favorita da un aumento di temperatura
Il tutto è dovuto alla competizione tra la formazione di legame
idrogeno intramolecolecolare e la solvatazione della catena
peptidica da parte delle molecole di acido dicloroacetico con
formazione di legame idrogeno intermolecolare tra solvente e
gruppi ammidici della catena peptidica.
Il processo è sostanzialmente guidato dal termine entropico che
aumenta all’aumentare della temperatura a causa della
desolvatazione dei gruppi ammidici e la liberazione in soluzione
delle molecole di solvente.
Questo contributo sovrasta la variazione negativa di entropia
dovuta alla strutturazione della catena peptidica.
Nel computo globale dei processi in gioco:
H  0
S  0
0
0
G
0
 S  0
T
0
Un processo guidato dall’entropia|
Per T=Tm, il numero massimo di regioni eleicoidali nella catena
è pari a:
jmax
n 

2
n
m 
2
Il rapporto <m>/<j> rappresenta la lunghezza media di una
sequenza elicoidale:
m
j

1

Notare come questa grandezza sia indipendente dal numero dei
residui.
Per n=103 (polipeptide a basso peso molecolare):
σ =1·10-4: <jmax>=5
<m>/<j>=100
σ =1·10-2: <jmax>=50
<m>/<j>=10
Per n=105 (polipeptide ad alto peso molecolare):
σ =1·10-4: <jmax>=500
<m>/<j>=100
σ =1·10-2: <jmax>=5000
<m>/<j>=10
Questi risultati sono l’effetto di due processi competitivi:
1) Il guadagno energetico (entalpico) dovuto alla formazione di
sequenze elicoidali relativamente lunghe;
2) Il guadagno entropico legato alla presenza di più centri di
nucleazione. I vantaggi entropici di avere più sequenze
elicoidali è controbilanciato dal costo entropico del processo
di nucleazione.
Nelle macromolecole a basso p.m. le sequenze elicoidali sono
troppo corte per avere più centri di nucleazione.
Per polipeptidi a basso p.m. il processo di denaturazione
avverrà preferibilmente a partire dagli estremi della catena,
mentre per polipeptidi ad alto p.m. la transizione avverrà con
la stessa probabilità in tutti i punti della catena.
L’energetica del processo può essere scomposta in due passi:
- Associazione della prima coppia di basi
Un passaggio con una forte perdita entropica e il guadagno
entalpico legato alla sola formazione di legami idrogeno.
-Associazione delle altre coppie di basi
Un forte contributo entalpico legato alla formazione di legami
idrogeno e alle favorevoli interazioni di stacking tra primi
vicini.
G  G ( I )   G ( primi vicini )
0
0
0
 AT 
0  TA 
G  G ( I )  G    G   
 TA 
 AT 
0
0
0
 AG 
0  GC 
0  CA 
  G 
  G 
 
 G 
 TC 
 CG 
 GT 
0
 8.1  3.7  2.4  5.4  9.3  6.0  18.7kJ
Stabilizzazione
per binding di
ioni
complessi
[Co(en)3]3+
Acido poliadenilico – singola macromolecola di adenine stacked