Laurea in Medicina e Chirurgia
Anno accademico 2013-2014
Biochimica/biologia molecolare clinica e diabete
Prof. Fabrizio Barbetti
Biochimica/biologia molecolare clinica del
diabete: obiettivi della lezione
•
•
•
•
•
•
•
•
Fornire la definizione di diabete
Ripercorrere i meccanismi di controllo della glicemia
Descrivere la classificazione eziologica
Descrivere il supporto del laboratorio alla diagnosi del
diabete e degli stati intermedi di alterato metabolismo del
glucosio
Descrivere il supporto del lab. all’inquadramento su base
eziologica
Descrivere il supporto del lab. al monitoraggio della terapia
Descrivere il supporto del lab. al monitoraggio delle
complicanze acute del diabete
Descrivere il supporto del laboratorio al monitoraggio della
complicanze croniche del diabete
Definizione di diabete mellito
• “Un gruppo di disordini metabolici eterogenei
dal punto di vista clinico e genetico caratterizzati
da elevati livelli ematici di GLUCOSIO”
• Nella classificazione corrente si distinguono due
tipi principali di diabete:
• il tipo 1 (T1D, distruzione immuno-mediata delle
cellule  pancreatiche).
• il tipo 2 (T2D, conbinazione di “insulino
resistenza” e deficit insulinico risultanti sia da
fattori genetici che ambientali).
• T1D + T2D: >95% dei casi
Il controllo fisiologico dei livelli
ematici del glucosio
• Il glucosio ematico è
regolato entro limiti
stretti.
• Il controllo fisiologico
della glicemia è -tra
l’altro- finalizzato al
mantenimento di livelli
minimi di glucosio
durante la fase di
digiuno notturna.
1 H-C=O
2 H-C-OH
3 OH-C-H
4 H-C-OH
5 H-C-OH
6
CH2OH
D-Glucosio
Somatostatina
Glicemia
70
mg/dl
120
Glucagone



Isola pancreatica
+
Insulina
Glucosio
+
+
+
Gluconeogenesi
Glicogenolisi
FEGATO
TESSUTO ADIPOSO
MUSCOLO
SCHELETRICO
Somatostatina
Glicemia
400
mg/dl
600
Glucagone



Isola pancreatica
+
Insulina
Glucosio
+
2+
+
+
Gluconeogenesi
Glicogenolisi
FEGATO
TESSUTO ADIPOSO
MUSCOLO
SCHELETRICO
La “soglia” renale
• I livelli plasmatici di
glicemia raggiunti i
quali si “satura” il
meccanismo
di
riassorbimento
del
glucosio a livello del
tubulo
renale:
mediamente attorno
a 180 mg/dl.
• Primo dosaggio
affidabile della glicemia
su sangue intero:
Folin-Wu (1920).
Primi inibitori della
glicolisi: 1931.
I primordi della biochimica clinica:
il “dosaggio” (!?!) della glicosuria nella
diagnosi di diabete
• Diagnosi rara nell’ ‘800: su circa 48.000
ricoveri al Massachussets General Hospital
tra il 1824-1898, solo in 172 casi (0,004%)
venne emessa diagnosi di diabete.
Metodo analitico: far assaggiare
al medico interno le urine del paziente.
Dosaggio della glicemia: raccolta
e conservazione del campione
• Il dosaggio del glucosio in laboratorio è effettuato
su siero o plasma (il sangue intero è utilizzato
nell ’ autocontrollo domiciliare e fornisce valori
più bassi del 12-15%).
• Poiché la glicolisi diminuisce la concetrazione di
glucosio ad un tasso del 5-7%/h a temperatura
ambiente, si aggiungono al prelievo inibitori della
glicolisi come il sodio fluoruro (NaF), in grado di
stabilizzare i livelli di glucosio per almeno 3 giorni
a temperatura ambiente ed un anticoagulante
(ossalato di potassio).
Diabete tipo 2: rilevanza della diagnosi
• T2D= circa 90% di tutti i casi. Insorge tipicamente
> 50 anni di età ed ha una elevata morbidità e costo
sociale.
• L’aumento della prevalenza di T2D correla con
l’aumento dell’obesità.
• 30-35% degli individui con T2D sono asintomatici ed
inconsapevoli della malattia.
• L’iperglicemia asintomatica può precedere di molti
anni (fino a 10) l’esordio clinico e correla con il
rischio cardiovascolare.
• Una significativa percentuale di pazienti con T2D (ca.
20% negli USA) presenta retinopatia diabetica alla
diagnosi.
Le lesioni della retinopatia diabetica sono uniche
La severità delle lesioni aumenta nel tempo
Le complicanze alla diagnosi
come indicatore di malattia
silente: la retinopatia
• La retinopatia diabetica
può essere presente alla
diagnosi e correla con
gli anni di malattia.
Estrapolando i dati è
evidente che il diabete
tipo 2 può essere
presente almeno 6.5
anni prima dei sintomi
clinici (e oltre !).
Diabete mellito: criteri
diagnostici ADA* e WHO §
• Criteri ADA*/WHO§
• Sintomi classici di diabete
e un valore di glicemia
venosa plasmatica
“casuale” =/> a 200 mg/dl
(*, §).
• Glicemia a digiuno >126
mg/dl (per 2 volte) (*, §).
• Glicemia =/>200 mg/dl al
tempo 120’ dell’OGTT
(§, [*]).
• Categorie a rischio:
• IGT (alterata tolleranza al
glucosio): coloro che
hanno una glicemia
plasmatica a 120’
dell’OGTT >140 e <200
mg/dl (§, [*]).
• IFG (alterata glicemia a
digiuno): coloro che
hanno una glicemia a
digiuno >100** e <126
mg/dl (*).
** RIVISTO NEL 2003 (precedente >110)
Diabetes ():
“passare attraverso”
• 1964: il WHO
stabilisce/propone i
primi criteri diagnostici
mediante il carico
orale di “tolleranza” al
GLUCOSIO (OGTT).
• In Giappone:
“Shoukachi” ovvero
malattia della sete.
• Primi del ‘900: test
di “tolleranza” al
RISO
Carico orale di glucosio
(OGTT): modalità.
• OGTT “standard”: 75
g di glucosio
(disciolto) per os e
prelievi al tempo 0’
ed ogni 30’ per 2 ore.
• Da effettuarsi solo se
la glicemia a digiuno
NON abbia già valore
diagnostico.
• Casi speciali.
• Bambini < 40 Kg:
1.75g per Kg di peso
corporeo.
Il “caso speciale” per definizione:
il diabete gestazionale
• Screening del diabete
gestazionale (USA)
“two steps”:
a)“minitest” (50 g),
prelievi a 0’ e 60’.
b)se >140 mg/dl a 60’,
OGTT con 100 g x 3 h.
• Screening “single
step”:
• OGTT con 75 g
Problematiche del diabete in gravidanza
•
•
•
•
Fetali
1° trimestre: malformazioni (aumento in %)
3° trimestre: macrosomia
Nascita: IPOcalcemia, IPOmagnesemia,
IPOglicemia
• Materne (pazienti con diabete tipo 1)
• Retinopatia ? -> Forse
• Nefropatia ? -> probabilmente NO
Criterio di scelta della glicemia a
digiuno diagnostica di diabete da
parte degli esperti ADA
• Il valore di 126 mg/dl
è stato scelto come
“equivalente” in
termini di sensibilità
e specificità al valore
di 200 mg/dl a 120’
dell’OGTT.
Uso o non uso dell’OGTT nella diagnosi
di diabete: conseguenze pratiche
Cambiamento di prevalenza: non
solo un problema metodologico
• Boston, 1946.
Campione: circa 70.000
persone.
• Prevalenza diabete:
0.52 %
• USA 2000 (stima WHO):
17.700.000
• USA 2030 (stima WHO:
30.3120.000
• Messico 2000 (stima
WHO): 2.179.000
• Messico 2030 (stima
WHO): 6.130.000
• Italia 2000 (stima
WHO): 4.252.000
• Italia 2030 (stima
WHO): 5.374.000
Il diabete tipo 1
• Il T1D è una malattia autoimmune organo
specifica caratterizzata dalla distruzione delle
cellule beta pancreatiche mediata dai linfociti T.
• Esordisce tra l’infanzia e la pubertà, ma
nessuna età è risparmiata.
• L’esordio clinico è spesso brusco, con forte
dimagramento, poliuria, iperglicemia elevata
accompagnata da chetosi.
Gli autoanticorpi circolanti
confermano la diagnosi clinica
•
•
•
•
•
Islet Cell Antibodies (ICA)
Glutamic Acid Decarboxylase Antib. (GADA)
Insulinoma-associated protein 2 Antib. (IA-2A)
Insulin autoantibodies (IAA)
ZnT8 autoantibodies (ZnT8A)
Ruolo degli autoanticorpi per la
predizione del T1D
• Il dosaggio degli
autoanticorpi nei
parenti di primo grado
di soggetti con T1D
combinato con la
valutazione delle
secrezione insulinica è
un valido predittore di
insorgenza di T1D.
• Circa il 3-5% dei
pazienti clinicamente
T1D sono negativi al
dosaggio degli
autoanticorpi.
Elevata percentuale di malattia
celiaca nei pazienti con T1D
• 6.8-8.3 % dei
pazienti con T1D
hanno la malattia
celiaca, confermata
con biopsia
intestinale.
• Di questi, circa il
70% sono
sintomatici.
• IgA antiendomisio
(EmA) o anti-TG2
• (sensib.>90%,
spec.>95%
• Se IgA tot. <5 g/L->
IgG antigliadina
(AGA)
GENETICA del T1D e T2D
• Entrambe malattie
poligeniche (nessun
andamento di tipo
mendeliano)
• Geni maggiori del T1D:
1) HLA; 2) VNTR del
gene INS
• Geni maggiori del T2D:
polimorfismi del gene
TCF7L2, moltissimi altri
La famiglia “GCK/MODY 2”
Glic.= 143
Età= 65 anni
“Scoperta” = 39 aa
Terapia=Dieta
Complicanze=NO
Glic.= 132
Età= 31 anni
“Scoperta”= 24 aa
Terap.=Dieta
= Normale
= mutazione GCK
Glicemia= 118
Età= 6 anni
Glicemia= 130
Età= 3 anni
Le mutazioni GCK/MODY 2 (1)
• Il gene della glucochinasi (GCK) è uno dei
sette geni noti che causano un sottotipo
monogenico di diabete mellito denominato
MODY (Maturity Onset Diabetes of the
Young).
• Il MODY si definisce come una condizione
autosomica dominante in cui il diabete -non di
tipo 1- insorge prima dei 25 anni di età.
2
2
Le mutazioni GCK/MODY 2 (2)
• Le mutazioni della glucochinasi sono
relativamente frequenti quando ricercate in
una casistica pediatrica.
• L’iperglicemia è modesta e NON progredisce
nel tempo.
• La diagnosi molecolare derime i dubbi nei
famigliari del bambino portatore ed è utile per
l’indirizzo terapeutico e della valutazione
delle complicanze.
Il diabete tipo 1: un esempio clinico.
• Bambino di 14 anni con recente perdita di
peso, poliuria, polidipsia, alito acetonico
• Glicemia a digiuno: 318 mg/dl
• Chetoni nelle urine: presenti (Ketostix
+++, semiquantitativo= 80-100 mg/dl)
• Diagnosi clinica: diabete tipo 1.
• E’ una diagnosi corretta ?
Il dosaggio degli autoanticorpi nel sospetto
clinico di T1D in soggetti ad elevata
familiarità
• ICA
• Decarbossilasi
dell’acido glutamico
(GAD65)
• Islet antigen 2 (IA-2)
• Insulina (IAA)
Ab +
T1D
Ab probabile
MODY3/HNF 1
= Diabete mellito ad esordio precoce
(<40 anni)
= Sospetto T1D
Mutazioni MODY 3/HNF-1: possibili
meccanismi di iperglicemia
• Topo HNF-1 -/-.
Ridotta espressione
genica nella cellula 
di:
• 1) Ins-1 (ma non Ins-2)
• 2) Glut 2, GK
• 3) Ipf-1/Pdx-1
• 4) NeuroD, HNF-4
Efficacia delle solfaniluree nei paz.
MODY 3
SU started
M stopped
11
SU stopped
M started
9
8
7
6
5
Years from Diagnosis
13
13
.5
12
12
.5
11
11
.5
10
10
.5
9.
5
9
8.
5
4
8
HbA1c %
10
• Deterioramento
della HbA1c->
10.3% dopo
cambio per
metformina
• Perdita di peso
- 5.3kg
• Ripristinata
Glibenclamide
5mg
• HbA1c 5.3%
Pearson et al. Diab Med 2000
Casi sporadici con insorgenza nei
primi 6 mesi di vita:diagnosi ?
• Neonato che alla terza giornata di vita
esordisce con glicemia 400 mg/dl,
chetoacidosi
• Peso alla nascita: 2.400 g
• Familiarità per diabete: nessuna
KATP channels and insulin secretion regulation
KATP channel
activity
KCOs
sulphonylureas
Ca2+
SUR1
KIR6.2
VDCC
+
_
K+
Glucose
[Ca2+]i
ATP/ADP
Cav2.3
+
KATP independent
or augmentation pathway
- prolonged 2nd
phase insulin release
+
pulsatile
insulin release
KATP dependent
or triggering pathway
produce 1st phase
insulin release
Insulin weaning and transfer to SU in patients with
KCNJ11 mutation
MUT
Age at
“switch”
Dose
mg/kg/d
HbA1c
TX: Ins
HbA1c
TX: SU
Dur. TX
SU
C-peptide
nmol/L
R50P
10a, 6m
0.57
7.2
6.3
10m
0.23
V59M
17m
0.5
9.8
5.2
7m
0.2
V59M
28m
0.39
9.2
5.8
14m
0.3
V59M
9a, 1m
0.18
8.0
5.4
12m
0.39
R201C
22m
0.32
7.3
6.7
12m
0.12
R201H
6m
0.47
6.4
5.4
2m
0.2*
R201H
7m
0.37
7.9
4.9
4m
0.2
R201H
23m
0.16
7.1
5.5
1m
0.7*
V59M
9a
0.55
7.7
5.8
6m
0.06
K170R
8a, 6m
0.61
8.4
7.4
14m
0.21
7.9
5.9
mean
Tonini,…Barbetti, Diabetologia 2006
Casi PNDM da Mutazioni KATP nella casistica
italiana
(Ottobre 2012)
• KCNJ11/Kir6.2= 26
• ABCC8/SUR1= 6
• Svezzati da insulina= 30 (93%) (di cui 3
adulti)
Casi sporadici e non con insorgenza
nei primi 6 mesi di vita:diagnosi ?
• Neonato che al terzo mese di vita esordisce
con glicemia 500 mg/dl, chetoacidosi
• Peso alla nascita: 3.100 g
• Familiarità per diabete: un genitore con
diabete diagnosticato entro i primi due anni
di vita
NH2
M
A
L
W
M
R
L
L
P
Signal peptide
3
2
1
N
V
F
A
A
A
P
D
P
G
W
L
A
L
L
A
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
L
V
4
3
21
A-chain
L
1
L
Q
L
A
G
G
G
L
Insulin precursor
R
G
P
30
20
29
19
28
Q
18
27
K
17
26
R
C
16
B-chain
G
15
25
s=s
PC-2
14
24
13
T
12
K
11
P
10
T
9
Y
8
F
7
F
6
COOH
C G S H L V E A L Y L V C G E R
s=s
s=s
C C T S I C S L Y Q L E N Y C N
G
P
L
E
V
Q
G
C-peptide
V
E
L
D
E
A
E
L
W
M
R
L
L
P
G
W
L
A
L
L
A
3
N
2
V
1
F
A
A
6
L
7
C
8
G
s=s
9
S
10 11 12 13 14 15 16 17 18
H L V E A L Y L V
C
7
I C
10 11
D
P
19 20
C G
s=s
S L Y Q L E N Y C
12 13 14 15 16 17 18 19 20
21 22
E R
N
21
Catena A
PC-2
G
1
L
R
K
Q
L
Pre (pro) Insulina
Q
L
G
G
A
L
PC-1/3
G
P
G
P
G
L
E
V Q G
Peptide C
V
E
L
D
E
A
E
Catena B
T S
8 9
s=s
P
24 25 26 27 28 29 30
F F Y T P K T R
C
6
A
Peptide
segnale
COOH
3 4
V
NH2
MA
nd-PS/1: valori di C-peptide a 70, 90, 150 e
350 giorni dopo la scoperta dell’iperglicemia
10
nd-PS/1 (R65C)
8
6
C-peptide
(ng/ml)
4
2
0,3 ng/ml
0
0
50
100
150
200
Days from birth
250
300
350
Insulina, IGF1 ed i loro recettori
Taniguchi et al. Nature Reviews Molecular Cell Biology 7, 85–96 (February 2006) | doi:10.1038/nrm1837
Mutazioni che
aboliscono la funzione
dello INSR causano la
sindrome di Donohue
(“lepreconismo”)
Caso IR-NA/1:
R974X/R974X
Insulinemia: 4000 mU/ml
(v.n. 2-20)
I chetoni
Insulina;
Glucagone
Insulina
Glucagone
(portale)
Acidi grassi liberi plasmatici
(FFA)
Ossidazione epatica FFA
Idrossibutirrato deidrogenasi
epatica
Acetoacetato ematico
spontanea
Acetone
Idrossibutirrato
Acetoacetato, Idrossibutirrato urinari
I corpi chetonici si possono testare con strisce
reattive
• Il reagente è il
nitroprussato di sodio
• Reagisce con acido
acetoacetico e con
acetone, mnon con betaOH-butirrato
• Range: 5-160 mg/dl
Una complicanza acuta: la chetoacidosi diabetica
(DKA)
• Si verifica più comunemente: a) all’esordio del diabete
tipo 1; b) durante infezioni; c) per la sospensione della
terapia insulinica.
• Parametri di diagnosi:
• Glicemia >250 (solitamente molto più alta)
• pH ematico: < 7.3
• Bicarbonati 18 mEq o meno
• Chetoni > 5mEq (o chetonuria)
• ESAME DA EFFETTUARE: EMOGASANALISI
Gli “old-days” della biochimica clinica nel
controllo metabolico: la “soglia” renale
• I livelli plasmatici di glicemia raggiunti i quali si
“satura” il meccanismo di riassorbimento del
glucosio a livello del tubulo renale: mediamente
attorno a 180 mg/dl.
• Inibitori del cotrasportatore sodio-glucosio
SLGT2 costituiscono una nuova classe di
farmaci antidiabetici.
Rilevanza della HbA1c come marcatore
di rischio delle complicanze
microvascolari
• DCCT (T1D):
-35% del rischio di
progressione della
retinopatia diabetica
ad ogni decremento
del 10% (ad es. da 8
a 7.2%) della HbA1c
• UKPDS (T2D):
-35% di rischio di
progressione delle
complicanze
microvascolari ogni
decremento di 1
punto percentuale
(ad es. da 9 a 8%)
della HbA1c
“Biotecnologia di ritorno”: l’uso della
HbA1c a fini diagnostici (2009)
• HbA1c> 6.5%=diabete
• Vantaggi: modeste
variazioni intraassay,
nessuna necessità di
digiuno, stabile a RT
• Svantaggi: risultati spuri
in caso di condizioni
che influenzano la vita
media dei globuli rossi.
La nefropatia diabetica
• Insorge nel 35-45% dei casi con T1D
• Insorge nel 20-35% dei casi con T2D
• 1a causa di insufficienza renale e
trattamento dialitico.
• Insorge solitamente dopo 15-20 anni di
malattia, ma può essere più precoce.
• Se accertata nelle sue prime fasi, può
regredire
• Marcatore precoce la “microalbuminuria”
Il ruolo della biochimica clinica nella valutazione
della nefropatia diabetica.
1) L’aumento di escrezione urinaria di albumina (UAE) è un
marcatore di alterazione microvascolare.
2) Una UAE aumentata è -a volte- presente nei pazienti con
diabete tipo 2 alla diagnosi.
3) UAE > 20 mg/min è un fattore di rischio di sviluppare una
nefropatia diabetica clinicamente evidente.
4) UAE nei soggetti con diabete tipo 2 è un predittore
indipendente di aterosclerosi e mortalità cardiovascolare.
Microalbuminuria: definizione
• Valori compresi tra 30 e 300 mg/24 ore
• La terminologia NON si riferisce ad una
isoforma particolare di albumina, ma al fatto
che i livelli di UAE non sono rilevabili dai
comuni metodi colorimetrici con “stick” (in
grado di misurare concentrazioni >200 mg/L),
pur essendo i valori al di sopra della norma
(<30 mg/24 ore).
Microalbuminuria: ci sono basi strutturali ?
R. Østerby, 1995
Ispessimento della membrana basale.
Siti a carica negativa alterati (selettività di carica).
Glicazione avanzata (?).
Espansione delle cellule del mesangio e del contenuto
di matrice.
Microalbuminuria: ci sono basi strutturali ?
S.C. Satchell, J.E. Tooke , 2008
Nel T1D la disfunzione endoteliale PRECEDE la microalbuminuria
Glycocalyx è alterato dall’iperglicemia.
Diminuzione “relativa” di podociti ?
Difetti nella selettività di carica (e non della selettività per
dimensione).
Familiarità (genetica) per la nefropatia (es. ACE1)
In modelli animali ruolo di: ROS, VEGF, IGF1
Ruolo dei podociti
E.S. Stitt-Cavanagh, L. MacLeod, C.R.J. Kennedy,
2009
• Nel modello Akita mouse, correlazione tra perdita di
espressione delle nefrina, “sparizione” e distacco dalla
membrana basale coincidono con l’inizio dell’albuminuria
• “Transizione” epitelio-mesenchimale del podocita con
perdita dei contatti cellula-cellula, alterazione della
polarità e riorganizzazione del citoscheletro.
Microalbuminuria: quando, come.
• Nei soggetti con T1D a partire da 5 anni dalla
insorgenza della malattia. Controlli successivi con
cadenza annuale.
• Nei soggetti con T2D alla diagnosi e
successivamente con cadenza annuale.
• Metodi quantitativi:
• Dosaggio radioimmunologico. Sensibile e preciso.
• ELISA (“sandwich”).
Microalbuminuria: problemi
•
-
La UAE aumenta con:
l’esercizio fisico
l’ipertensione arteriosa
la posizione eretta
l’iperglicemia
-> necessità di standardizzare la raccolta del
campione.