DNA RICOMBINANTE: DUE MOLECOLE DI DNA VENGONO
UNITE IN PROVETTA SFRUTTANDO LE PROPRIETA’ DI
ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE DI TIPO II E DELLA DNA
LIGASI
CLONAGGIO
-IN BIOLOGIA CLONARE UN ORGANISMO SIGNIFICA OTTENERE UN
INDIVIDUO UNA POPOLAZIONE DI ORGANISMI CHE SONO
GENETICAMENTE IDENTICI
-IN BIOLOGIA MOLECOLARE CLONARE UN TRATTO DI DNA SIGNIFICA
OTTENERE UNA POPOLAZIONE DI DNA IDENTICHE ALLA MOLECOLA
DI PARTENZA
Il clonaggio del DNA
• Clonaggio: viene generata una molecola di DNA
ricombinante, cioe’ isolata dal suo contesto e
introdotta in un replicone (una unita’ di DNA capace
di replicarsi detto vettore).
• Questa molecola di DNA ricombinante viene
introdotta in un sistema cellulare appropriato (in
genere batteri derivati dall’ Escherichia coli).
• Tutti i discendenti di questa singola cellula, detta
clone, conterranno la medesima molecola di DNA
ricombinante originariamente isolata, permettendo
di produrne quantita’ praticamente illimitate
Plasmidi
• Molecole extracromosomiali di DNA circolare,
capaci di replicarsi e di segregare autonomamente
rispetto al DNA cromosomale dei batteri.
• Di solito sono portatori di geni che conferiscono ai
batteri un vantaggio selettivo in particolari condizioni
ambientali (resistenza agli antibiotici, ad es.)
• Possono ospitare DNA estraneo (a condizione che
non sia troppo grande)
• Possono essere facilmente purificati dal DNA
cromosomale in grande quantità.
Plasmidi
Plasmidi: Superavvolgimento
M
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
Il DNA digeritoEnzimi
con gli di
enzimi
di restrizione
restrizione
può essere analizzato mediante elettroforesi
Plasmide (P)
M
Eco RI (E)
10 kb
Bam HI (B)
Eco RI
DNA genomico (G)
3x 109 basi
P
P+B P+E G+E
-
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
+
MAPPATURA ENZIMATICA DI UN TRATTO DI DNA
6.6 bp
M
PstI
HindIII
PstI+HindIII
-
4.1
4
3
2.6
2.3
2
2.3
1.7
1.4
1.4
1.2
1.1
1.1
1
0.6
0,5
PstI HindIII
1.1 kb
0.6 kb
2.3 kb
+
HindIII PstI
1.2 kb
1.4 kb
Le DNA ligasi sono enzimi capaci di legare
covalentemente due molecole di DNA adiacenti
con estremità libere
DNA RICOMBINANTE: due tratti di DNA che in natura non sono
adiacenti, vengono uniti in provetta.
Le proprietà degli enzimi di restrizione sono state essenziali per la
tecnica del DNA ricombinante.
I due tratti da unire vengono tagliati con uno stesso enzima di
restrizione.
EcoRI
GAATTC
CTTAAG
G AATTC
CTTAA G
GAATTC
CTTAAG
G AATTC
CTTAA G
Le estremità coesive prodotte da uno stesso
enzima possono appaiarsi.
G
CTTAA
AATTC
G
GAATTC
CTTAAG
Infine la DNA ligasi viene utilizzata per legare
covalentemente le due molecole di DNA
OH
OH
P
5’
G AATTC
CTTAA G
5’
3’
P
3’
P
G AATTC
CTTAA G
OH
P
3’
5’
OH
OH P
5’
3’
GAATTC
CTTAAG
P
3’
5’
OH
DNA LIGASI
5’
3’
GAATTC
CTTAAG
ATP
3’
5’
Solo estremità compatibili possono essere
legate efficientemente
INSERIMENTO DI UN TRATTO DI DNA ESOGENO
IN UN VETTORE DI CLONAGGIO
CLONAGGIO:
- LIGASI
- TRASFORMAZIONE
- SELEZIONE
- CRESCITA COLONIE
IDENTIFICAZIONE
DELLA COLONIA
BATTERICA DI INTERESSE
Cosa può succedere in una reazione ligasica ?
1. Il vettore si richiude su se stesso senza legarsi con l’inserto
2. Il vettore si lega con l’inserto
L’enzima beta-galattosidasi può essere utilizzato per discriminare
le colonie che contengono un plasmide con inserto da quelle che
contengono un plasmide senza inserto
ALCUNI ENZIMI PRODUCONO ESTREMITA’ TRONCHE (BLUNT)
ESTREMITA’ BLUNT POSSONO ESSERE LEGATE A ESTREMITA’ BLUNT PRODOTTE
DA QUALSIASI ALTRO ENZIMA, NON CI SONO LE LIMITAZIONI IMPOSTE DALLA
COMPLEMENTARIETA’ DELLE BASI DELLE CODINE APPICCICOSE.
SVANTAGGIO: LIGASI DI ESTREMITA’ BLUNT E’ MENO EFFICIENTE PECHE’ NON
SI HA APPAIAMENTO TRA CODINE A SINGOLO FILAMENTO.
CCC/GGG
GGG/CCC
GAT/ATC
CTA/TAG
EcoRV
SmaI
CCC ATC
GGG TAG
LA SEQUENZA IBRIDA CHE SI FORMA NON E’ RICONOSCIUTA DA NESSUNO DEI
DUE ENZIMI.
QUANDO E’ NECESSARIO UNIRE DUE ESTREMITA’ INCOMPATIBILI????
E’ POSSIBILE CONVERTIRE LE ESTREMITA’ STICKY IN ESTREMITA’ BLUNT
Estremita’ 5’ protruding:
5’
3’
3’
5’
L’estremità 3’ del filamento viene utilizzata come innesco dalla DNA POLIMERASI.
Si utilizza il frammento Klenow della DNA polimerasi I di E. coli
(DNA POLIMERERASI intera ha azione 5’esonucleasica).
Estremità 5’ o 3’ protruding:
5’
3’
3’
5’
Si utilizza la nucleasi S1: nucleasi che funziona su singolo filamento.
Il fago lambda come vettore di clonaggio
Il ciclo vitale
del fago lambda
Placche di lisi
Lisogenia
Lisogenia
Ricombinazione sito-specifica
Ricombinazione omologa
Ciclo litico
INFEZIONE
Produzione di enzimi
Per la sintesi del DNA
FASE PRECOCE
Inizia la replicazione
Produzione di teste
e code del fago
packaging
lisi
FASE TARDIVA
Un interruttore complesso
Replicazione ‘rolling circle’
COS
Genoma
COS
Genoma
Packaging
COS
Genoma COS
Il fago lambda come vettore
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