Meccanismi di
Riprogrammazione Neurale
Nuove frontiere per la medicina rigenerativa
Corso di laurea triennale in
Scienze Biologiche
Candidato: Blanka Cerreti
Relatore: Maria Egle De Stefano
LA RIPROGRAMMAZIONE NEURALE
• La riprogrammazione in vitro
• La riprogrammazione in vivo dopo trasduzione in vitro
• La riprogrammazione in vivo
(Huang et al., 2015)
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LA RIPROGRAMMAZIONE IN VITRO
• Dalle iPSCs alle iNPCs:
Nuova visione plastica e dinamica del SNC
 iPSCs generate da fibroblasti maturi transfettati con
un vettore RV o LV codificante TFs pluripotenti
Differenziamento in qualsiasi sottotipo cellulare
richiesto
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Applicazioni cliniche
- Rigenerazione SNC in seguito a traumi o patologie
- Trapianti cellulari
- Creazione tessuti tridimensionali
Svantaggi
-Alti costi creazione iPSCs paziente-specifiche
-Eterogeneità coltura
-hiPSCs giovani rispetto ai neuroni lesionati
-Riattivazione casuale oncogeni tumorali
-Variazioni epigenetiche
-Infezioni virali
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Soluzioni potenziali
- Ridurre l’eterogeneità con il sistema FACS:
isola e purifica sottotipi neurali specifici
- Uso di progerina per eliminare differenza d’età
- Aggiunta di specifici TFs, modulatori esogeni e fattori
rimodellanti la cromatina
Modelli bio-stampati tridimensionali
‘‘Organoidi’’ corticali riproducono connessioni neurali tra
le aree del cervello
ricreano l’organo lesionato
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• Il trans-differenziamento diretto:
Evita il pericoloso stadio di pluripotenza
Neuroni
Fibroblasti + Sox2
Astrociti
iNSCs o iNs
Oligodendrociti
(Kang et al., 2015)
Astrociti
Dlx/Ascl1: neuroni GABA
inibitori
Ng2: glutammatergici eccitatori
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LA RIPROGRAMMAZIONE IN VIVO DOPO
TRASDUZIONE IN VITRO
Trasduzione virale di cellule somatiche e successivo trapianto
in un cervello adulto
 Fibroblasti infettati in vitro con un LV-dox codificante fattori
di conversione neurale e GFP
DA-iNs
generazione di correnti Na+ e K+ voltaggio dipendenti e
potenziali d’azione
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LA RIPROGRAMMAZIONE IN VIVO
Riprogrammazione di cellule residenti nell’organismo
LV-Cre astrociti adulti
LV-hGFAP (OKSM) astrociti
cellule neuronali (GFP+ e NeuN+)
neuroblasti proliferativi
Sox2 incremento di 10volte iNBs
BDNF, Noggin, VPA
neuroni
(Dametti et al., 2015)
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COCKTAIL DI FATTORI DI TRASCRIZIONE
• OKSM: Oct4, Klf4, Sox2, e c-Myc
 Fibroblasti embrionali riprogrammati in iPSCs e iNSCs
Stadio pluripotente Oct4+
riattivazione cromosoma X
(Hochedlinger at al., 2015)
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• BSKM: Brn4, Sox2, Klf4, c-Myc espressi tramite un vettore
virale policistronico dox-inducibile
iNSCs
• ABS9: NFIA, NFIB e Sox9 riprogrammano fibroblasti
embrionali murini in astrociti indotti (GFAP+,S100B+ e Glut-1+)
(Caiazzo et al., 2015)
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LA REGOLAZIONE GENICA NEURALE
• Repressori trascrizionali
REST compete con Ng2 per il legame con ND4
(Masserdotti et al., 2015)
Adenovirus codificante una ricombinasi
Delezione REST allevia blocco riprogrammazione
90% cellule βIII-tub+
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• Gli inibitori chimici
-
Inibizione tramite microRNA
miRNA let-7
auto-rinnovamento hiNSCs
(Kang et al., 2015)
 MEFs transfettati con let-7,Sox2 e HMGA2 aumento
efficienza riprogrammazione hiNSCs
colonie
Pax6+/Nestin+
siHMGA2 decremento autorinnovamento
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- Inibizione senza TFs
 Fibroblasti murini
iPSCs
Inibizione MEK e TGF-beta + mimetici di RNA
Formazione colonie chiPS AP+ (40%)
con marcatori Nanog, Sox2, SEEA1 e Oct4
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(Krejci et al., 2015)
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NUOVO SPIRAGLIO NELLA CURA DI PATOLOGIE
NEURODEGENERATIVE
Fattori scatenanti AD
•Accumulo e deposito placche A-β amiloidi
infiammatoria locale
perdita neuroni
risposta
Nuove strategie
•ESCs, NSCs, MSCs e iPSCs
-Riduzione placche A-β amiloidi (fagocitosi astrociti)
-Attivazione cascate neurotrofiche (BDNF,GDNF, MANF)
-Modulazione risposte immuni (citochine)
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CONCLUSIONI
La medicina rigenerativa
• Sostituzione tessuto/organo danneggiato
• Stimolazione meccanismi di riparazione cellulare
• Creazione di tessuti paziente-specifici
• Guarigione malattie cronicizzate
• Si punta a riprogrammare direttamente cellule nei
siti cerebrali lesi mediante iniezione di TFs
• Creazione di un vettore ideale
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Grazie dell’attenzione
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